Plasmodium spp

27-Feb-14 TRÙNG BÀO TỬ KÝ SINH TRONG MÁU PLASMODIUM spp (KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT ) ThS BS Phùng đức Thuận 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 Gánh nặng SR giới năm 2010 Nguồn: World Malaria Report 2012 (WHO) 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 Phân vùng sốt rét lưu hành năm 2003 2009 Không có SR Nguy Nhẹ Vừa Nặng 2003 2009 27-Feb-14 • Có loài ký sinh trùng sốt rét (KST SR) ký sinh người điều kiện tự nhiên: • Plasmodium malariae (Laveran, 1881) • Plasmodium vivax (Grassi Feletti, 1890) • Plasmodium falciparum Welch, 1897 • Plasmodium ovale Stephens, 1922 • Plasmodium knowlesi Sinton Mulligan, 1932 • Chu kỳ phát triển KST SR xảy ký chủ: - người: với phát triển vô tính gan hồng cầu cho phân liệt (schizont), - muỗi Anopheles spp.: với phát triển hữu tính dày tuyến nước bọt cho thoa trùng (sporozoit) 27-Feb-14 27-Feb-14 • Ở thú vật có KST SR riêng cho loài: • Khỉ: P cynomolgi, P rhodhaini, P knowlesi, P inui…, • Chim: P gallinaceum, P lophurae, P relictum…, • Gặm nhấm: P berghei, P gonderi…, • Bò sát: P agamae, P azurophilum…, • KST SR loài gây bệnh cho loài (trừ trường hợp P knowlesi khỉ có gây bệnh cho người) • Các đường lây truyền cho người: tự nhiên (do muỗi Anopheles), đường máu (tiêm truyền), thai (SR bẩm sinh) 27-Feb-14 • Tuổi hồng cầu bị ký sinh: P vivax P ovale có khuynh hướng xâm nhập hồng cầu non, P malariae, hồng cầu già, P falciparum không phân biệt tuổi hồng cầu để xâm nhập • Ngoài P vivax không xâm nhập hồng cầu người có nhóm máu Duffy âm tính (thường người Phi Châu da đen) P falciparum lại cần đến điểm tiếp nhận màng hồng cầu có cấu tạo glycophorin A để xâm nhập 27-Feb-14 27-Feb-14 Thời gian xâm nhập hồng cầu kéo dài từ 30 giây phút Trước KST (cụ thể mảnh trùng hay gọi thể phân cách) tiếp xúc với màng hồng cầu, làm cho màng hồng cầu lõm vào phía ngày sâu, tạo “giếng” qua mảnh trùng trượt vào hồng cầu, sau màng hồng cầu hàn kín lại 27-Feb-14 • Để phát triển KST SR tiêu thụ hemoglobin hồng cầu thải haemozoin (hay gọi sắc tố sốt rét) • Ngoài KST lấy chất dinh dưỡng có hồng cầu qua cấu giống miệng (cystotome) • Tổng hợp protein từ acid amin thiết yếu có huyết tương thấm vào hồng cầu (do màng hồng cầu tăng tính thẩm thấu lên cao) • Lipid tổng hợp từ thành phần huyết tương người bệnh • Acid nucleic tổng hợp phần thể KST hồng cầu phần đường chuyển hóa khác 27-Feb-14 27-Feb-14 • Khả sống kst SR thể người tùy thuộc vào khả sống hồng cầu mà chúng ký sinh • Các nghiên cứu năm 1940 cho thấy kst có khả sống sót tuần lễ máu dự trữ ngân hàng máu • Các nghiên cứu sau cho thấy P falciparum P malariae sống đến 10 ngày máu bảo quản 0C, chất chống đông máu có chứa dextrose • Có thể giữ kst sống sót để sau nghiên cứu cách bảo quản nhiệt độ -70 0C đá khô hay -196 0C nitơ lỏng (có thể giữ đến 10 năm mà không làm khả sống kst) 27-Feb-14 27-Feb-14 27-Feb-14 Đặc điểm loài Plasmodium Đặc điểm người Loài ký sinh trùng P f P v P o P m Giai đoạn gan (ngày) 5,5 – 6–8 14 – 16 Thời gian ủ bệnh (ngày) – 14 12 – 17 hay lâu 16 – 18 14 – 40 Số lượng KST phân liệt gan 30.000 10.000 15.000 15.000 Giai đoạn hồng cầu (giờ) 48 48 50 72 27-Feb-14 Đặc điểm người Loài ký sinh trùng P f P v P o P m Mật độ KST/l máu 20 – 500.000 (trung bình) 20.000 9.000 6.000 Mật độ tối đa 2.000.000 50.000 30.000 20.000 Sốt sơ phát Nặng - ác tính Nhẹ - nặng Nhẹ Nhẹ Sốt tái phát (do ngủ gan) – + + – KST tồn người không điều trị (năm) 1–2 1,5 – 1–5 – 50 Thời gian KST phát triển muỗi 28 0C (ngày) – 10 – 10 14 – 16 12 – 14 27-Feb-14 27-Feb-14 Vai trò sinh bệnh học • Các t/c lâm sàng bệnh sốt rét thể vô tính máu gây Các thể giao bào ký sinh hồng cầu chờ dịp muỗi Anopheles hút vào để tiếp tục phát triển muỗi, tạo thoa trùng gây bệnh cho người lành khác • Khi kst phát triển bên hồng cầu, chất thải sắc tố sốt rét (haemozoin) chất độc khác tích tụ • Khi phân liệt máu vỡ ra, chất vào máu kích thích đại thực bào tế bào khác, để tế bào tiết cytokin yếu tố hòa tan khác gây nên sốt lạnh run làm bệnh diễn biến nặng 27-Feb-14 • Các hồng cầu bị nhiễm P falciparum (nhất giai đoạn tư dưỡng già, phân liệt) bám vào thành mạch máu không di chuyển tự hệ tuần hòa • Nếu ẩn cư (sequestration) xảy mạch máu não làm tắc nghẽn tuần hoàn não gây sốt rét ác tính thể não với tỷ lệ tử vong cao • KST SR gây thiếu máu, nặng trẻ em phụ nữ có thai Các đại thực bào “dọn sạch” hồng cầu bị ký sinh mà thực bào tiêu diệt hồng cầu bình thường khác KST SR làm rối loạn ức chế phát triển bình thường tủy xương Trường hợp sốt rét đái huyết cầu tố góp phần làm thiếu máu 27-Feb-14 27-Feb-14 Nuôi cấy kst sốt rét • Bass Johns tìm cách nuôi cấy kst in vitro từ năm 1912 • Vào năm 1976, Trager Jensen nuôi cấy kst in vitro đĩa Petri đặt bình nến (candle-jar) • KST nuôi môi trường RPMI 1640 + huyết người không khí có 3-4% CO2 16% O2 Sau hồng cầu tươi thêm vào để việc nuôi cấy trì liên tục • Nhờ nuôi cấy kst điều kiện in vitro mà chủng kháng thuốc sốt rét phát hiện, giúp đánh giá tác dụng diệt kst thuốc sốt rét 27-Feb-14 Hình thể ký sinh trùng sốt rét 27-Feb-14 10 27-Feb-14 Hình thể bên - cánh, cánh thường có đốm - chân - vòi dài - Nhiều vẩy thể 27-Feb-14 Vectơ truyền bệnh sốt rét VN • Vectơ chính: – Vùng rừng núi toàn quốc: An minimus – Vùng rừng núi từ 20 vĩ độ Bắc trở vào Nam: An dirus – Vùng ven biển nước lợ Nam Bộ: An epiroticus • Vectơ phụ: – Vùng đồi núi toàn quốc: An aconitus, An jeyporiensis, An maculatus – Vùng ven biển miền Bắc: An subpictus, An sinensis, An vagus, An indefinitus – Vùng ven biển miền Nam: An subpictus, An sinensis, An campestris 27-Feb-14 20 27-Feb-14 Sinh thái số vectơ SR An dirus: vùng rừng núi (rừng rậm), có mặt suốt mùa mưa, cao tháng 8, 9, 10 Thích sống nhà hút máu người Đốt người vào sẫm tối • An minimus: vùng rừng núi (ven rừng nhiều khe suối) Có mặt trước sau mùa mưa, thích sống nhà, gần có số sống nhà Đốt người nhà vào nửa đêm • An epiroticus: vùng đồng ven biển (nước lợ), có mặt suốt mùa mưa, cao tháng 5, 6, Thích sống nhà, đốt người khoảng nửa đêm sau ban ngày nhà • An subpictus: vùng đồng ven biển hải đảo (nước lợ) Chịu đựng độ mặn cao, có mặt quanh năm, cao từ mùa khô sang mùa mưa (tháng 2-8) Đốt người nhà lẫn nhà, có tính cao máu gia súc, hoạt động suốt đêm cao từ 18-21 • 27-Feb-14 CHẨN ĐOÁN CẬN LÂM SÀNG 27-Feb-14 21 27-Feb-14 Phết máu ngoại biên nhuộm Giemsa 3-5%, soi kính hiển vi (x 1000 lần) Giọt dày: phát định loại KST Phết mỏng: xác định chủng loại KST có nghi ngờ 27-Feb-14 Đánh giá mật độ KST lam máu + – 10 KST / 100 vi trường giọt dày ++ 11 – 100 KST / 100 vi trường giọt dày +++ – 10 KST / vi trường giọt dày ++++ > 10 KST / vi trường giọt dày 22 27-Feb-14 Que thử chẩn đoán SR nhanh (RDT - Rapid Diagnostic Test)  Phát kháng nguyên KST có máu bị ly giải, phương pháp sắc ký miễn dịch  Hình thức: dạng que thử (dipstick), cassette hay bìa cứng (card) có gắn kháng thể đơn dòng chống lại kháng nguyên KST  Thử nghiệm có kết vào phút thứ 15, 20  Có loại phát Pf, có loại phát Pf /Pv, Pm, Po Một số dạng trình bày test chẩn đoán SR nhanh Cassettes Que thử Bìa cứng 23 27-Feb-14 Các kháng nguyên KST SR mà que thử chẩn đoán nhanh phát Kỹ thuật nested PCR (Polymerase Chain Reaction)  Một đoạn gen kst nhân lên hàng triệu lần, sau chạy điện di gel nhuộm để phát  Đối với KST SR, áp dụng kỹ thuật nested PCR (PCR lồng)  Bước một, PCR nhân gen đặc hiệu Plasmodium với mồi (primer) Sản phẩm thu dùng cho bước hai  Bước hai, PCR nhân gen đặc hiệu cho loài Plasmodium với đôi mồi đặc hiệu cho Pf, Pv, Pm Po 24 27-Feb-14 Hình ảnh chạy điện di gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide phát băng đặc hiệu Plasmodium DNA P ovale P falciparum P malariae P vivax Một kỹ thuật mới: Real-time quantitative PCR (qPCR) Nhạy gấp 5000 lần soi kính hiển vi 100 lần kỹ thuật PCR thông thường 27-Feb-14 25 27-Feb-14 Lâm sàng bệnh sốt rét SR thể thông thường (SR cơn): rét run, sốt, vã mồ hôi Có tính chu kỳ (hàng ngày, cách ngày, cách ngày) SR thể ác tính với hay nhiều biến chứng sau: • Rối loạn tri giác, hôn mê (Glasgow/Blantyre coma scale ) • thiếu máu nặng: Hct < 15%, Hb < g/dL, • suy thận cấp: creatinin HT > mg/dL (hay > 265 mol/L), [trẻ em: > 1,5 mg/dL hay > 130 mol/L], • hạ đường huyết: < 40 mg/dL hay < 2,2 mmol/L, • toan chuyển hóa lactat máu tăng: > mmol/L, • phù phổi cấp: XQ phổi, SaO2 < 92%, • tiểu huyết cầu tố: Hb nước tiểu, • vàng da: bilirubin > mg/dL (hay > 50 mol/L), • mật độ KST cao: > 100.000 /l máu hay HC nhiễm > 5% 26 27-Feb-14 Nguyên tắc điều trị bệnh SR • Điều trị SR sớm, đúng, đủ liều • Điều trị cắt sốt kết hợp chống lây lan • Phác đồ thuốc SR phối hợp (ACT) Pf • Điều trị đặc hiệu kết hợp điều trị hỗ trợ nâng cao thể trạng 27 27-Feb-14 Thuốc điều trị • Đối với thể tư dưỡng phân liệt (=thể vô tính) – P.v P.m.: chloroquin – P.f.: DHA-PPQ (arterakin, CV-artecan), quinin + clindamycin (nếu có thai < tháng) • Đối với thể giao bào (thể hữu tính): primaquin • Đối với thể ngủ gan (P.v P.o.): primaquin • Thể sốt rét ác tính: artesunat tiêm • Thuốc cấp tự điều trị: DHA-PPQ 27-Feb-14 Điều trị bệnh SR thể thông thường SR lâm sàng SR Pf SR Pv, Pm SR nhiễm phối hợp < tuổi DHA-PPQ DHA-PPQ CQ DHA-PPQ  tuổi DHA-PPQ DHA-PPQ + PRI CQ + PRI (Pv) DHA-PPQ + PRI Thai < tháng QUI + CLIN QUI + CLIN CQ QUI + CLIN Thai  tháng DHA-PPQ CQ DHA-PPQ Nhóm b/n DHA-PPQ 28 27-Feb-14 Hiện tượng kháng thuốc • Năm 1967, TCYTTG định nghĩa tượng kháng thuốc “như khả loài (hay dòng) ký sinh trùng sống sót phát triển bệnh nhân điều trị hấp thu lượng thuốc sốt rét Thuốc cho liều hay cao liều thông thường khả chịu đựng thể” • Định nghĩa sau bổ sung thêm ý “dạng thuốc có hoạt tính với ký sinh trùng phải xâm nhập vào ký sinh trùng hay hồng cầu có chứa ký sinh trùng thời gian đủ để thuốc có tác dụng bình thường” (Bruce-Chwatt c.s., 1986) 27-Feb-14 China Myanmar CQ SP MEF ASU+MEF * AL: - 86% - 74% - 27% - 3% - 5% CQ 18 - 91% PIP 17 - 50% PYR 0% DHA - 4% AL: - 4% DHA+PIP 0% ASU+PYR 0% Viet Nam CQ 10 - 100% SP 12 - 90% MEF - 9% ASU - 40% ART - 50% ARE 1% ASU+MEF - 16% CV8 - 5% DHA+PIP - 1% AL: 0% Lao PDR CQ 17 - 88% SP - 33% CQ+SP - 17% MEF 0% DHA+PIP - 5% ASU+MEF - 3% AL: - 7% Chữ viết tắt: Thailand AL – Artemether-lumefantrine CQ SP MEF ASU+MEF DHA+MEF * AL * QN+TCN ARE – Arteether ART – Artemisinin ASU – Artesunate CQ – Chloroquine DHA – Dihydroartemisinine MEF – Mefloquine 97 - 100% 99 - 100% - 69% - 21% - 20 % - 4% - 15% Cambodia CQ 25 - 97% SP 20 - 99% MEF - 27% ASU 4% ASU+MEF - 15% DHA+PIP - 5% AL: 14 - 29% DHA+PIP+TRI - 6% PIP – Piperaquine PYR – Pyronaridine SP – Sulfadoxine-pyrimethamine TRI – Trimethoprime Mức độ kháng thuốc khu vực Tiểu vùng sông Mekong 29 27-Feb-14 Kháng artemisinin dẫn xuất Hiện việc P falciparum kháng artemisinin vấn đề thời quan tâm cần làm rõ TCYTTG năm 2011 đề xuất định nghĩa thực hành kháng artemisinin sau: • Một gia tăng thời gian cắt kst, thể qua việc có  10% trường hợp sốt rét kst máu sau ngày điều trị với phác đồ phối hợp với artemisinin (nghi ngờ kháng thuốc); • Điều trị thất bại dùng đơn artemisinin uống dù có đủ nồng độ thuốc máu, thể qua việc kst sau ngày, kst vào ngày thứ có tái phát sốt rét vòng 28/42 ngày (xác nhận kháng thuốc) 27-Feb-14 Phát kháng thuốc • Đánh giá hiệu lực điều trị thuốc (Therapeutic Efficacy Study – TES): điều trị b/n theo quy trình chuẩn theo dõi kết điều trị 28, 42 hay 63 ngày • In vitro maturation test: nuôi cấy ngắn ngày KST để xem phát triển môi trường có thuốc SR • Genotyping: phát đánh dấu phân tử (molecular marker) có liên quan đến kháng thuốc 27-Feb-14 30 27-Feb-14 Phân loại đánh giá hiệu lực thuốc (WHO)  Điều trị thất bại sớm: ngày đầu theo dõi, xuất tình sau:  xuất dấu hiệu nguy hiểm sốt rét nặng vào ngày N1, N2 N3 có KST máu  mật độ KST máu ngày N2 > N0  mật độ KST máu ngày N3  25% N0  ngày N3 có KST /máu nhiệt độ nách  37,5 0C 27-Feb-14  Điều trị thất bại muộn: chia làm loại,  Thất bại lâm sàng muộn, có điểm sau:  Tăng lên dấu hiệu nguy hiểm SR nặng sau ngày N3, có KST máu trước không gặp dấu hiệu điều trị thất bại sớm  Có KST máu nhiệt độ nách  37,5 0C vào ngày từ ngày đến ngày 28 trước không gặp dấu hiệu điều trị thất bại sớm  Thất bại ký sinh trùng muộn: có KST máu vào ngày từ ngày đến ngày 28 (N7, N14, N21 N28), nhiệt độ nách < 37,5 0C trước không gặp dấu hiệu điều trị thất bại sớm thất bại lâm sàng muộn 27-Feb-14 31 27-Feb-14  Đáp ứng lâm sàng ký sinh trùng tốt (điều trị khỏi bệnh): kst máu vào ngày 28, không kể đến nhiệt độ nách, dấu hiệu điều trị thất bại sớm hay thất bại lâm sàng muộn thất bại kst muộn  Hiện phác đồ ACT điều trị khỏi bệnh SR Pf VN, có dấu hiệu kéo dài thời gian cắt KST máu (báo động kháng thuốc) 27-Feb-14 In vitro maturation test • 100 l lấy đầu ngón tay trộn với môi trường RPMI 1640 có thêm HEPES bicarbonat, sau nhỏ vào “giếng” phiến nhựa (microplate), ủ bình nến 24-30 Trong giếng có pha thêm thuốc SR với nồng độ từ thấp đến cao • Thử nghiệm xác định đến nồng độ thuốc phát triển kst từ thể nhẫn lên thể phân liệt bị ngăn chận Kỹ thuật đánh giá lúc nhiều loại thuốc sốt rét 27-Feb-14 32 27-Feb-14 • Ngoài có kỹ thuật in vitro sử dụng đồng vị phóng xạ, kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể chống lactat dehydrogenase (LDH) hay HRP2 kst, hay sử dụng phẩm nhuộm huỳnh quang gắn vào DNA kst • Các thử nghiệm in vitro giúp theo dõi diễn biến mức độ nhạy kháng kst theo thời gian, thể qua giá trị IC50, IC90 hay MIC thuốc 27-Feb-14 Dự phòng bệnh sốt rét Chủ trương Dự án QG PCSR VN là: • Không uống thuốc để dự phòng bệnh SR mà cấp thuốc tự điều trị cho người vào vùng lưu hành SR nặng tuần, xa sở y tế có xét nghiệm máu • Khuyến khích biện pháp bảo vệ cá nhân: mặc quần áo dài tay, dùng nhang, kem xua muỗi, ngủ mùng, võng ( tẩm hóa chất diệt côn trùng) 27-Feb-14 33 27-Feb-14 27-Feb-14 34 ... điều kiện tự nhiên: • Plasmodium malariae (Laveran, 1881) • Plasmodium vivax (Grassi Feletti, 1890) • Plasmodium falciparum Welch, 1897 • Plasmodium ovale Stephens, 1922 • Plasmodium knowlesi Sinton... liệt Plasmodium falciparum gặp máu ngoại biên 27-Feb-14 13 27-Feb-14 Thể phân liệt Plasmodium falciparum 27-Feb-14 Thể giao bào Plasmodium falciparum 27-Feb-14 14 27-Feb-14 Thể tư dưỡng già Plasmodium. .. Thể tư dưỡng Plasmodium ovale Hồng cầu bị ký sinh có hình oval, có bờ cờ bị rách 27-Feb-14 17 27-Feb-14 Plasmodium knowlesi: KST thứ gây bệnh SR người Soi kính hiển vi dễ bị lầm với Plasmodium