Kĩ thuật di truyền Thầy TKQ

KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các tên gọi khác: – Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (DNA recombinant technology) – Kỹ thuật di truyền (Genetic engeneering).  – Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay Công nghệ gene (Genetic technology hay gentech) – Thao tác gene (Gene manipulation) – Tạo dòng phân tử (Molecular cloning)  NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KTDT ‐Trong lĩnh vực y tế: + Chẩn đoán rối loạn di truyền (trên nhiễm sắc thể) + Phát tác nhân ngoại lai (vi khuẩn, virus lây nhiễm…) … ‐Trong công nghiệp SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 1865 Di truyền học cổ điển đời từ nghiên cứu Mendel tượng lai có kiểm tra Thời gian nghiên cứu: năm (1856-1863) Đối tượng nghiên cứu: đậu Hà Lan (Pissum sativum) + Công nghệ lên men Cỡ mẫu: ẫ ~37.000 37 000 â đậu đậ 300 300.000 000 h hạtt đậu đậ + Thuốc trừ sâu sinh học, phân hủy rác cặp tính trạng nghiên cứu: … ‐Trong nông nghiệp + Cấy ghép gene quý vào thực vật: tăng khả chống chịu, tăng suất + Chọn lọc, lai tạo giống động vật, thực vật… SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 1908 1865 Drosophila melanogaster ‐ Thomas Hunt Morgan: tính trạng liên kết giới tính Mỗi bố mẹ mang 2 “nhân tố”, nhưng ở mỗi bố mẹ, chỉ có 1 trong 2 “nhân tố” được truyền cho hệ “Nhân tố” của Mendel: “gene” ngày SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 1949 1953 Khái niệm bệnh phân tử/bệnh di truyền lần đưa James D Watson Francis H.C.Crick SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN NGHIÊN CỨU DNA Ở NGƯỜI 1983 Kary Mullis phát minh kỹ thuật PCR ‐DNA được di truyền gia đình  quan hệ huyết thống ‐ Làm để chứng minh một bệnh do di truyền ‐ Các nghiên cứu con song sinh song sinh  tìm hiểu biểu gene và gene tương tác gene với môi trường ‐ Xác định gene liên quan đến bệnh NGHIÊN CỨU DNA Ở NGƯỜI ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN ‐ Bác sĩ, các nhà khoa học đọc thông tin về DNA, nghiên cứu, thay đổi,  chỉnh sửa DNA  Giới hạn đến đâu? Tình 1: Cha mẹ Vợ chồng bạn sinh 1 con gái mong chờ đứa con trai. Bạn có thai, qua siêu âm, biết bé gái. Kỹ thuật di truyền can thiệp để biến đổi giới tính thai nhi. Bạn có sử dụng cho trường hợp bạn không?  ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT DI TRUYỀN HỘI CHỨNG DOWN bất thường vật liệu di truyền, thừa nhiễm sắc thể 21 Triệu chứng: + Trí tuệ phát triển Tình 2: Cha mẹ Một cặp vợ chồng có người con. Người vợ mang thai,  qua siêu âm, biết có khả tương đối lớn bé bị Down. Theo bạn, cặp vợ chồng nên xử lý như nào?  + Chậm nói, khả lại, nghe + Vấn đề tim mạch + Vô sinh + Không sống lâu ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tình 3: Bác sĩ Bệnh nhân bạn lịch sử gia đình cho thấy có khả bị ung thư trực tràng Hiện tại, sức khỏe người bình thường Các chẩn ẩ đoán di truyền ề cho thấy ấ người có 15% bị ung thư trực tràng 20 năm tới Bạn thông báo kết với bệnh nhân nào? Họ có quyền sống không? Nếu có, gánh nặng xã hội thân giải Nếu không, cần định thời điểm nào? http://en.wikipedia.org/wiki/Down_syndrome ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tình 4: Bệnh nhân Ông bạn bạn nhỏ bệnh huntington Đây bệnh di truyền, bạn có khả mang bệnh Bạn có xét nghiệm đểể biết ế bạn có mang gene gây bệnh không hay làm ngơ? Bệnh Huntington gây bất thường (CAG)n gene Huntingtin nằm nhiễm sắc thể số Triệu chứng: thoái hóa thần kinh nặng, thường xảy độ tuổi 40 dẫn đến tử vong - Thường xảy người Tây Âu châu Á Phi - Chưa có biện pháp chữa trị PDB ID: 3IOU ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tình 5: Người dân Chính phủ đưa dự luật yêu cầu người dân phải đến sở y tế, “nộp” vài ml máu để lập sở liệu di truyền ề toàn quốc ố nhằm ằ kiểm ể soát vấn ấ đềề tội phạm biện pháp rà soát, loại trừ án oan Bạn bỏ phiếu thuận hay phiếu chống? - Đối với chẩn đoán trước sinh, rối loạn di truyền nghiêm trọng chữa trị định ngưng thai kỳ Y liệu: LiệuLiệu pháppháp gene gene Y học họctrịtrị liệu: Con người xã hội kiểu gene - Các biến đổi di truyền tế bào sinh dục không chấp nhận - Gene bệnh gene trội so với gene ghép - Biểu gene phải ổn định, có tính đặc hiệu tế bào, tế bào chuyển gene phải tồn thể ghép - Đối với bệnh chữa trị có thời gian biểu bệnh lâu, kỹ thuật chẩn đoán không áp dụng Đối với thai nhi xác định có mang bất thường dù nhỏ, loại bỏ không? ‐ Kỹ thuật gene có thể giúp xác định giới tính phôi thai từ sớm => mất cân tỷ lệ trẻ sơ sinh nam nữ vi phạm trầm trọng đến quyền sống con người ‐ Hầu hết đặc điểm cá nhân quy định từ gene, nhiễm sắc thể => ý  tưởng quản lí công dân thông qua kiểu gen của họ giống đặc tính vân tay,  chiều cao, màu mắt - Phải ợ thử nghiệm g ệ lâm sàng g ợ chứng g thực ự trước đưa vào sử dụng người - Tránh tương tác xuất tế bào ghép tế bào sinh dục Bí mật cá nhân của mỗi người sẽ được sử dụng và bảo vệ như thế nào? - Là liệu pháp sử dụng sau biện pháp xử lý khác - Phải Ủy ban đặc biệt (về đạo lý sinh-y học) chấp nhận => Rất liệu pháp gene ứng dụng chữa trị bệnh Ứng dụng công nghệ gene công nghiệp ‐ Trong công nghệ lên men, người ta đã tính toán, gia giảm cơ chất và các chất dinh dưỡng  hoặc xử lý để các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…)  sẽ chết vào cuối quy trình sản  xuất trước khi đưa sản phẩm vào sử dụng ‐ Các vấn đề nảy sinh ứng dụng của thuốc trừ sâu sinh học, phân hủy chất thải bằng phương  pháp sinh học:  + đưa gene tự sát vào vi sinh vật => luôn có một đột biến mới bất hoạt các gene này g ự ậ ộ ộ g y + không lường trước được sự tái tổ hợp giữa vi sinh vật tự nhiên và vi sinh vật biến đổi  gene Ứng dụng công nghệ gene công nghiệp - Vũ khí sinh học: sử dụng sinh vật có độc tố cao vũ khí chiến tranh + Cuối chiến người Pháp người da đỏ Bắc Mỹ (1689–1763), tướng lĩnh người Anh thả mền có chứa vi sinh vật gây bệnh đậu mùa vào tộc, dẫn đến việc hàng loạt người nhiễm bệnh chết người + Vào năm 1979, hàng ngàn người Nga bị tử vong nhiễm vi khuẩn bệnh than (Bacillus anthracis) Nguyên nhân cho bất cẩn khâu bảo quản vi khuẩn Vào năm 1925, Hiệp định Geneve nghiêm cấm việc sử dụng vũ khí hóa học sinh học, nhiều quốc gia tham gia đạo luật (Hoa Kỳ Nhật Bản tham gia 50 năm sau) Hiệp định không cấm nghiên cứu biện pháp chống lại vũ khí hóa học, sinh học Hiệp định vũ khí sinh học có nghiêm chỉnh chấp hành không? Việc bảo quản vũ khí sinh học tiến hành Ứng dụng dụngcông côngnghệ nghệgene geneở các nước nước đang phát phát triểntriển Công nghệ gene có tác động lớn đến tiến loài người Ưu điểm: - Nâng cao chất lượng sức khỏe người - Nâng cao chất lượng môi trường sống Ứng dụng dụngcông côngnghệ nghệgene geneở các nước nước đang phát phát triểntriển - Công nghệ sinh học công cụ quan trọng để cải thiện việc bảo toàn nguồn tài nguyên di truyền thực vật Nếu sử dụng phù hợp, nông nghiệp nước phát triển tốt - Việc ứng dụng công nghệ sinh học nước phát triển gây thiệt hại cho ngành sản xuất sản phẩm tương tự nước phát triển: đường, vanilla, - Nâng cao suất chất lượng vật nuôi, trồng - Các sáng chế nước phát triển cần phải ghi nhận vào bảo vệ quyền quyền Khuyết điểm: - Các nước phát triển có nguy nơi thử nghiệm nghiên cứu vốn không phép nước phát triển - Tăng phân hóa giàu nghèo - Tăng phân hóa người thụ hưởng người không thụ hưởng (các biện pháp chẩn đoán, điều trị ) - Các nước phát triển chịu hậu (nếu có) nặng không đủ lực để kiểm soát Hội nghị quốc tế công nghệ sinh học thực vật TCA, FAO tổ chức Luxembourg (1989) Ứng dụng công nghệ gene nước ta CNSH nước ta có bước phát triển định lĩnh vực y tế công – nông nghiệp - Sự phát triển CNSH phải phù hợp với phát triển đất nước xu chung giới - Không chép sách lược nước công nghiệp hóa - Sự ứng dụng kỹ thuật cần song song với biện pháp kiểm soát soát - Cần đưa nghiêm chỉnh tuân theo luật lệ liên quan đến lĩnh vực Các nhân tố di truyền Là cấu trúc mang thông tin di truyền ‐ Nhiễm sắc thể mang thông tin di truyền thiết yếu sống ‐ Các nhân tố nhiễm sắc thể: ty thể, sắc lạp, plasmid,  virus… ‐ Ty thể lục lạp chứa DNA, không tồn độc lập ‐ Plasmid: DNA dạng vòng, có thể thể nhân đôi độc lập ‐ Virus: mang thông tin di truyền, không có cấu trúc tế bào Gene/NST NST/Gene ở eukaryote Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote Nucleosome: - đoạn DNA gồm 147 bp cuộn quanh lõi gồm protein Histone Cuộn chặt: trình nén nhỏ ngẫu nhiên mà hình thành cấu trúc phức tạp - đoạn linker dài ~80 bp - đường kính chuỗi nucleosome khoảng 100 Å 31 Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote 32 Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote Sợi solenoid: đường kính 300 Å Trong nhân, sợi solenoid tiếp tục kết hợp với protein khác RNA tạo nên cấu trúc cuộn xoắn cao với đường kính lên đến 3000 Å 33 Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote 34 Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote Trong nhân, sợi solenoid tiếp tục kết hợp với protein khác RNA tạo nên cấu trúc cuộn xoắn cao với đường kính lên đến 7000 Å: chromatine 35 Trong nhân, sợi solenoid tiếp tục kết hợp với protein khác RNA tạo nên cấu trúc cuộn xoắn cao với đường kính lên đến 7000 Å 36 Nucleic acid – cấu trúc DNA tế bào eukaryote Nucleic acid – trình tự DNA DNA cuộn xoắn cực đại, trở thành nhiễm sắc thể, đường kính lên đến 14000 Å  (nhiễm sắc thể ở trung kỳ, được nhân đôi gồm 2 nhiễm sắc tử dính nhau ở tâm động)  tế bào phân chia - Kích thước DNA eukaryote không phản ánh kích thước mức độ tiến hóa sinh vật - DNA prokaryote thường có dạng vòng, toàn DNA mang thông tin di truyền - DNA eukaryote bao gồm trình tự mã hóa (exon) xen kẽ với trình tự không mã hóa (intron) http://de.academic.ru/dic.nsf/dewiki/419095 37 38 DNA  Một số kỹ thuật thao tác gene  .là cấu trúc đa phân bao gồm đơn phân nucleotide ‐ Tách chiết DNA, PCR, Southern Blot… Có loại ribonucleotide: A, G, C, T ‐ Multiplex PCR ‐ RFLP (Restriction fragment length polymorphism) ‐ DNA barcode DNA b d ‐ Realtime PCR ‐ SSCP (Single stranded conformational polymorphism) ‐ LAMP (Loop‐Mediated Isothermal Amplification) ‐ Giải trình tự DNA thế hệ 39 Một số kỹ thuật thao tác gene Một số kỹ thuật thao tác gene ‐ Multiplex PCR ‐ DNA barcode TKQuân nnk(2004). Phát vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ kỹ thuật PCR mutiplex. Y học TpHCM, 8(1):58‐61 ‐ Các kỹ thuật bản: tách chiết DNA, Southern blot, xác định nồng độ khángg sinh ức chế tối thiểu…)) Nuesch‐inderbinen M.T et al (1997). Survey and Molecular Genetics of SHV b‐ Lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: Two Novel Enzymes, SHV‐11 and  SHV‐12. AAC, 41(5):943‐949 ‐ RFLP Brugger SD et al. (2012). 16S rRNA Terminal Restriction Fragment Length  Polymorphism for the Characterization of the Nasopharyngeal Microbiota. PLoS ONE 7(12): e52241 Vences M. et al (2005). Comparative performance of the 16S rRNA gene in DNA  barcoding of amphibians. Frontiers in Zoology. 2:5 ‐ Kỹ thuật SSCP (Single stranded conformational polymorphism) Pajak j k B. et al.l (2011). Rapid Differentiation of Mixed Influenza A/H1N1 Virus  (20 ) id iff i i f i d fl / i Infections with Seasonal and Pandemic Variants by Multitemperature Single‐ Stranded Conformational Polymorphism Analysis. Journal of Clinical Microbiology.  49(6): 2216‐2221 ‐ Kỹ thuật LAMP (Loop‐mediated isothermal amplification) Ocker R. et al (2016). Malaria diagnosis by loop‐mediated isothermal amplification  (LAMP) in Thailand. Rev.Inst.Med.Trop. Sao Paulo. 58:27  Một số kỹ thuật thao tác gene ‐ Realtime PCR Faye O. et al (2013). Quantitative real‐time PCR detection of Zika virus and  evaluation with field‐caught Mosquitoes. Virology Journal. 10:311 ‐ Kỹ thuật giải trình tự hệ mới: Next mới: Next‐generation generation Sequencing Sequencing TÁCH CHIẾT DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP BOOM MULTIPLEX PCR Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính liên kết với nucleic acid hạt silica môi trường có Guanidinium thiocyanate (hiệu ứng Chaotropic) Nguyên tắc: nhân đôi DNA ống nghiệm sử dụng Multiplex PCR sử dụng nhiều mồi để khuếch đại nhiều trình tự DNA khác ống nghiệm Các bước tiến hành: Bước 1: Ly giải iải tếế bào bà với ới enzyme biến biế tính í h protein i Bước 2: Thêm hạt silica bead GuSCN vào dịch chiết Bước 3: Thu silica có gắn DNA Bước 4: Dung giải DNA khỏi hạt silica Bước 5: Thu nhận DNA Boom R. et al. (1990). Rapid and simple method for purification of Nucleic acid. Journal of clinical microbiology. 28(3):495‐503 MULTIPLEX PCR Các lưu ý: - Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR - Tm mồi - Kích thước sản phẩm PCR NESTED PCR - Là phương pháp cải biên từ PCR truyền thống để làm giảm thiểu tạo thành sản phẩm không mong muốn bắt cặp không đặc hiệu mồi NESTED PCR Đoạn trình tự cần khuếch đại PCR PCR SEMI NESTED PCR SEMI SEMI NESTED MULTIPLEX PCR SEMI Đoạn trình tự cần khuếch đại PCR PCR Bacterial mating hay kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn Bacterial mating hay kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn Định nghĩa: kỹ thuật chuyển vật liệu di truyền tế bào vi khuẩn dựa tiếp xúc trực tiếp thông qua cầu nối tế bào Cơ chế: Đặc điểm: -Thường h đ xem h “mating”, “ i ” sinh i h sản ả hữu h tính í h vìì cóó liên liê quan đến trao đổi vật liệu di truyền - Tế bào cho thường cung cấp nhân tố di truyền di động: plasmid, transposon Các plasmid thường có hệ thống đảm bảo tế bào nhận nhân tố tương tự - Vật liệu di truyền chuyển thường có lợi cho tế bào nhận, thường đặc tính kháng kháng sinh, khả sử dụng sản phẩm trao đổi chất mới… Bacterial mating hay kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn MIC – Minimum inhibitory Concentration Ứng dụng: - Chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn sang tế bào nấm men, thực vật, động vật ty thể động vật - Nghiên cứu khả kháng kháng sinh vi khuẩn Định nghĩa: nồng độ thấp kháng sinh ngăn chặn phát triển vi khuẩn MIC – Minimum inhibitory Concentration MIC – Minimum inhibitory Concentration MIC – Minimum inhibitory Concentration MIC – Minimum inhibitory Concentration RFLP – ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN TRÌNH TỰ BỊ CẮT BỞI ENZYME CẮT GIỚI HẠN RFLP – ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN TRÌNH TỰ BỊ CẮT BỞI ENZYME CẮT GIỚI HẠN Nguyên tắc: Phân biệt trình tự DNA tương đồng dựa đa hình kích thước đoạn trình tự DNA được hình thành do khác vị trí nhận biết cắt enzyme cắt giới hạn.  CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH VÍ DỤ VỀ ỨNG DỤNG RFLP Tách chiết DNA mẫu cần phân tích Cắt DNA enzyme cắt giới hạn chọn lọc Điện di để phân tách đoạn trình tự cắt Chuyển lên màng lai – lai Southern Blot với mẫu dò đặc hiệu với trình tự marker Phân tích đa hình tín hiệu lai (các đoạn DNA), phân biệt dựa vào kích thước đoạn trình tự giới hạn Terminal RFLP (T(T-RFLP) DNA BARCODE DNA barcoding phương pháp phân loại sử dụng trình tự DNA ngắn đặc trưng sinh vật làm đặc điểm nhận diện sinh vật DNA BARCODE vs PHYLOGENY DNA BARCODE PHYLOGENY Xác định taxon chưa biết Xác định mối quan hệ taxon D vào Dựa ột trình t ì h tự/đặc t /đặ điể điểm Tính Tí h toán t mức ứ độ giống iố h taxon đặc trưng trình tự DNA taxon làm đặc điểm nhận diện QUY TRÌNH QUY TRÌNH Xác định trình tự DNA marker thể đặc trưng taxon cần xác định + Động vật nhiều eukaryote khác: gene mã hóa Cytochrome Oxydase I (COI) mtDNA + Thực vật: gene rbcL and matK + Nấm: Vùng ITS (internal transcribed spacer) So sánh trình tự taxon quan tâm để xác định trình tự đặc trưng QUY TRÌNH QUY TRÌNH Xây dựng sở liệu chứa tất trình tự/đặc điểm đặc trưng sinh vật Dùng trình tự đặc trưng để xác định mẫu vật chưa biết ỨNG DỤNG ỨNG DỤNG - Xác định loài thực vật chưa hoa, chưa phát triển - Xác định loài côn trùng giai đoạn ấu trùng ỨNG DỤNG ỨNG DỤNG - Xác định loài thực vật mà thành viên có kiểu hình khác biệt - Cơ sở liệu DNA barcode cá ỨNG DỤNG - Cơ sở liệu DNA barcode chim SSCP – Single strand conformation polymorphism SSCP Nguyên tắc: Dựa đa hình cấu trúc mạch đơn DNA có thành phần nucleotide khác Sự di chuyển với vận tốc khác cấu trúc khác qua trình điện di giúp phân biệt trình tự DNA khác nhau, dù nucleotide Cơ sở khoa học: Sự biến đổi nucleotide DNA mạch đôi phát thông qua trình điện di, tính chất vật lý mạch đôi giống allele DNA mạch đơn môi trường thường cuộn lại tạo cấu ấ trúc bậc cao Về mặt lý thuyết, trình tự DNA khác dù nucleotide, hình thành cấu trúc bậc cao khác Sự khác hình dạng trình tự DNA mạch đơn làm cho di chuyển chúng gel qua trình điện di khác SSCP SSCP Quy trình: Tách chiết DNA nguyên liệu Dùng kỹ thuật PCR, khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu Biến tính DNA Điện di gel biến tính (thường gel polyacrylamide) Nhuộm bạc, xác định băng DNA Phân tích, so sánh vị trí vạch DNA LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Nguyên tắc: Dựa hoạt động DNA polymerase mồi riêng biệt để khuếch đại trình tự DNA nhiệt độ định LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Các đặc điểm: - Không cần bước biến tính DNA (tách DNA mạch đôi thành mạch đơn) - Toàn phản ứng khuếch đại diễn liên tục nhiệt độ định - Hiệu khuếch đại cao - Với mồi bắt cặp lên trình tự xác định, kỹ thuật LAMP có tính đặc hiệu cao - Không đòi hỏi thiết bị hay hóa chất đặc biệt - Sản phẩm khuếch đại bao gồm đoạn trình tự lặp lại ngược xen kẽ - Có thể sử dụng RNA làm nguyên liệu (cần RTase) LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Đặc điểm mồi vị trí bắt cặp - Chiều dài đoạn trình tự (khoảng cách F2 B2) từ 120 – 180 bp - Khoảng cách F2-F3 B2-B3 từ - 20 bp - Khoảng cách vùng tạo loop (5’F2 -3’F1, 5’B2-3’B1) khoảng 40-60 bp LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Bước 1: - Mồi FIP bám lên mạch bổ sung (đang dạng mạch đôi, liên kết lỏng lẻo nhiệt độ khoảng 65oC) - DNA polymerase bắt đầu kéo dài mạch, với hoạt tính polymerase thay mạch Bước 3: - Mồi F3 bám lên vùng F3c DNA mạch khuôn, FIP, bắt đầu tổng hợp mạch bổ sung với mạch khuôn (giống mạch bắt đầu FIP) LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Bước 4: - Tổng hợp mạch hoàn chỉnh F3 LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Bước 6: - Đoạn trình tự FIP giải phóng mạch đơn, đóng vai trò mạch khuôn mẫu bắt đầu trình tổng hợp từ BIP B3 LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Bước 5: - Đoạn trình tự FIP giải phóng mạch đơn, F1c bắt cặp với F1 tạo thành loop LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Bước 7: Trình tự mạch đôi từ F1 đến B3 tổng hợp LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION LOOP Realtime PCR (qPCR (qPCR)) – PCR định lượng Kỹ thuật PCR Realtime PCR, hay PCR định lượng, kỹ thuật cải tiến từ PCR thông thường Với kỹ thuật này, DNA khuếch đại qua chu kỳ nhiệt định lượng (định lượng thời gian thực - real time) Realtime PCR Kéo dài mạch DNA Realtime PCR Hoàn thành 1 chu kỳ nhân đôi Realtime PCR 5’‐3’ exonuclease Thành phần phản ứng Realtime PCR Ngoài thành phần phản ứng PCR thông thường, phản ứng Realtime PCR cần: - Probe có gắn reporter quencher Probe phải đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu - Máy Realtime PCR, vừa có tính luân nhiệt, vừa có khả phát định lượng cường độ huỳnh quang reporter phát Thông thường, trình tự DNA mục tiêu, phản ứng Realtime PCR thường khuếch đại trình tự DNA có hàm lượng mẫu (chứng nội) Các trình tự DNA thường sử dụng 18S or 25S rRNA, actin, GAPDH, ubiquitin GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI - NGS NGS - Illumina (Solexa Solexa)) sequencing Giải trình tự hệ (Next-generation sequencing – NGS) bao gồm nhiều kỹ thuật giải trình tự khác có hiệu suất cao, cho phép giải trình tự DNA với tốc độ cao giá thành rẻ Các kỹ thuật NGS thông dụng bao gồm: - Illumina (Solexa) sequencing - Roche 454 sequencing - Ion torrent: Proton / PGM sequencing - SOLiD sequencing -DNA mục tiêu phân cắt thành đoạn ngắn Chiều dài đoạn DNA khác tùy vào máy giải trình tự khác - Trong kỹ thuật Illumina sequencing, đoạn trình tự thường có chiều dài từ 100 – 150 bp Các đoạn trình tự gắn vào slide thông qua đoạn trình tự DNA gọi adaptor - Mỗi slide gắn số lượng lớn trình tự (spot) Tùy máy giải trình tự từ vài Giga-nu đến vài Tera-nu - Trong kỹ thuật NGS, lượng lớn trình tự DNA ngắn giải trình tự đồng thời Các mảnh trình tự DNA sau giải mã nối với thành đoạn trình tự DNA hoàn chỉnh phần mềm vi tính chuyên dụng NGS - Illumina (Solexa Solexa)) sequencing NGS - Illumina (Solexa Solexa)) sequencing - Tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu adaptor - Thêm loại nucleotide đánh dấu huỳnh quang khác DNA polymerase - Các terminator thêm vào cho trước đợt máy đọc tín hiệu huỳnh quang có nucleotide gắn vào mạch DNA - Đọc tín hiệu huỳnh quang, ghi nhận nucleotide gắn thêm vào spot NGS - Illumina (Solexa Solexa)) sequencing NGS - Illumina (Solexa Solexa)) sequencing - Bước tiếp theo, terminator giải phóng, cho phép nucleotide gắn thêm vào mạch DNA - Máy ghi nhận spot xem có nucleotide gắn vào - Lặp lại bước vài trăm lần giải xong mảnh trình tự DNA dài 100 – 150 nucleotide NGS - Roche 454 sequencing NGS - Roche 454 sequencing - Giải trình tự dài so với Illumina, lên đến 1kb - Tương tự Illumina, 454 sequencing giải đồng thời nhiều mảnh trình tự DNA ngắn, đọc trình tự DNA theo nhiều bước, bước ghi nhận tín hiệu nucleotide gắn vào - Tiến hành phản ứng PCR với mồi đặc hiệu adaptor - Mỗi bước, thêm loại nucleotide đánh dấu huỳnh quang - Nếu nucleotide thêm vào gắn vào mạch DNA, tín hiệu huỳnh quang phát ra, máy ghi nhận - Cường độ tín hiệu ghi nhận tương ứng với số nucleotide loại gắn mạch DNA - Nếu nucleotide không gắn vào, tín hiệu huỳnh quang phát NGS - Roche 454 sequencing NGS - Ion torrent: Proton / PGM sequencing - Bước kế tiếp, nucleotide trước bị loại khỏi slide, loại nucleotide đánh dấu khác đưa vào - Máy lại phát xem nucleotide đưa vào có gắn vào mạch DNA hay không thông qua tín hiệu huỳnh quang phát - Quy trình lặp lặp lại với loại nucleotide đánh dấu - Các tín hiệu huỳnh quang phát đồng thời nhiều spot khắp slide - Mỗi nucleotide tự gắn vào mạch DNA giải phóng ion H+, ion H+ làm giảm pH môi trường Sự thay đổi pH cho phép phát hay nhiều nucleotide gắn vào mạch DNA NGS - Ion torrent: Proton / PGM sequencing - Tương tự 454 sequencing, bước, loại nucleotide thêm vào Máy đọc tín hiệu xem spot, nucleotide có thêm vào hay không Trong kỹ thuật này, tín hiệu ghi nhận thay đổi pH (và cường độ thay đổi) môi trường ... DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tình 3: Bác sĩ Bệnh nhân bạn lịch sử gia đình cho thấy có khả bị ung thư trực tràng Hiện tại, sức khỏe người bình thường Các chẩn ẩ đoán di truyền ề... NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT DI TRUYỀN Tình 5: Người dân Chính phủ đưa dự luật yêu cầu người dân phải đến sở y tế, “nộp” vài ml máu để lập sở liệu di truyền ề toàn quốc ố nhằm... đổi vật liệu di truyền - Tế bào cho thường cung cấp nhân tố di truyền di động: plasmid, transposon Các plasmid thường có hệ thống đảm bảo tế bào nhận nhân tố tương tự - Vật liệu di truyền chuyển