Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)

Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ Chuyên ngành : Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã số : 62 64 01 02 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Thị Bích Lân PGS.TS Nguyễn Hữu Nam HÀ NỘI, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cám ơn, thông tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2017 Tác giả luận án Huỳnh Văn Chƣơng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án, nhận đƣợc hƣớng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép đƣợc bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy cô PGS.TS Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS Nguyễn Hữu Nam tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế tận tình giúp đỡ trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận án Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích hoàn thành luận án Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Chƣơng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu đồ xi Danh mục đồ thị xi Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh cầu trùng gà 2.1.1 Căn bệnh cầu trùng 2.1.2 Đặc điểm dịch tễ 13 2.1.3 Sinh bệnh học 14 2.1.4 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích gà bị bệnh cầu trùng 15 2.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà 16 2.1.6 Điều trị bệnh cầu trùng gà 18 2.1.7 Miễn dịch chống cầu trùng gà 18 2.1.8 Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà 20 2.2 Tổng quan công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.2.1 Giới thiệu chung công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.2.2 Đặc điểm hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng biểu gene E coli 21 iii 2.3 Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái 24 2.3.1 Trọng lƣợng phân tử tính chất lý hóa IgY (Yolk Immunoglobulin) 24 2.3.2 Cấu trúc IgY 24 2.3.3 Độ bền IgY 25 2.3.4 Lợi công nghệ sản xuất IgY 26 2.3.5 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà 27 2.3.6 Những ứng dụng IgY 28 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 31 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 31 3.3.2 Thiết bị hóa chất dùng cho nghiên cứu 31 3.4 Nội dung nghiên cứu 33 3.4.1 Khảo sát đặc điểm bệnh lý bệnh cầu trùng gà 33 3.4.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E coli 3.4.3 33 Nghiên cứu biểu gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4.4 Kiểm tra độ tinh khiết tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 33 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.5.1 Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng xác định bệnh tích đại thể, vi thể gà mắc cầu trùng 34 3.5.2 Phƣơng pháp xác định tiêu huyết học gà mắc bệnh cầu trùng 34 3.5.3 Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh gà 35 3.5.4 Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 35 3.5.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên vector tạo dòng biến nạp vào tế bào vật chủ E coli TOP10 3.5.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E vector pET200/D-TOPO biểu gene kháng nguyên 3-1E 3.5.7 37 39 Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu định lƣợng kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 40 iv 3.5.8 Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng phòng trị bệnh cầu trùng gà 3.5.9 3.5.10 41 Phƣơng pháp đánh giá hiệu phòng điều trị bệnh cầu trùng chế phẩm 42 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 44 Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể, vi thể gà mắc cầu trùng 4.1.1 44 Tỷ lệ cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi huyện Phú Vang, Thừa Thiên Huế 44 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi gà từ đến 42 ngày tuổi 44 4.1.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.1.4 Bệnh tích đại thể chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng 47 4.1.5 Bệnh tích vi thể chủ yếu số quan gà mắc bệnh cầu trùng 50 4.2 Kết nghiên cứu tiêu huyết học gà mắc bệnh cầu trùng 54 4.2.1 Một số tiêu hồng cầu gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng 55 4.2.2 Kết nghiên cứu tiêu hệ bạch cầu gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi) 4.2.3 56 Kết nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết gà mắc bệnh cầu trùng (35 - 42 ngày tuổi) 58 4.3 Kết phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 59 4.3.1 Thu tinh Oocyst cầu trùng gà 59 4.3.2 Xác định loài cầu trùng phƣơng pháp PCR 59 4.3.3 Kết tách chiết ARN tổng số 60 4.3.4 Kết thực PCR 61 4.3.5 Tinh sản phẩm PCR 62 4.4 Kết nghiên cứu tạo dòng biểu gene 3-1E 63 4.4.1 Kết tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng 63 4.4.2 Phân tích trình tự gene 3-1E 64 4.4.3 Kết tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu pET200/D-TOPO 4.4.4 4.5 66 Kết tinh khiết khả liên kết kháng nguyên 3-1E đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+ 68 Tối ƣu điều kiện biểu kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 70 v 4.5.1 Kết sinh trƣởng E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 70 4.5.2 Kết khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng 71 4.5.3 Kết tỷ lệ tiếp giống tối ƣu 72 4.5.4 Kết tốc độ lắc tối ƣu lên khả sinh trƣởng vi khuẩn E coli chủng BL21 (DE3) 73 4.5.5 Kết môi trƣờng biểu tối ƣu 74 4.5.6 Nồng độ tối ƣu chất cảm ứng IPTG 74 4.5.7 Thời gian cảm ứng chất cảm ứng tối ƣu 75 4.5.8 Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu 76 4.5.9 Mật độ tế bào tối ƣu 77 4.6 Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng xác định tính đặc hiệu kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 78 4.6.1 Tách chiết, tinh định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 78 4.6.2 Tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp 78 4.7 Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng phòng trị bệnh cầu trùng gà 79 4.7.1 Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà 79 4.7.2 Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà 80 4.7.3 Định lƣợng kháng thể IgY 81 4.7.4 Xác định hiệu giá kháng thể chế phẩm lòng đỏ 82 4.7.5 Đánh giá hiệu phòng bệnh chế phẩm 83 4.7.6 Đánh giá hiệu điều trị chế phẩm 86 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 5.1 Kết luận 89 5.2 Kiến nghị 89 Danh mục công trình công bố 91 Tài liệu tham khảo 92 Phụ lục 106 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Bp Base pair Cặp ba zơ BSA Bovine serum albumin Albumin huyết bò cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid A xít Deoxyribonucleic ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu IgY Yolk Immunoglobulin Kháng thể long đỏ trứng IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton Kilo dalton NC Negative control Đối chứng âm OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RIA Radioimmunoassay Phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ RT – PCR Reverse transcription polymerase chain Phản ứng chuỗi trùng hợp reaction phiên mã ngƣợc SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Điện di gel polyacrylamide gel electrophoresis WSF Phần hòa tan nƣớc Water soluble fraction vii DANH MỤC BẢNG STT 4.1 Tên bảng Trang Tỷ lệ cƣờng độ nhiễm cầu trùng đàn gà số xã huyện Phú Vang 44 4.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi gà 45 4.3 Triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.4 Kết mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng 48 4.5 Tần suất xuất giai đoạn phát triển cầu trùng gà tiêu vi thể quan gà bệnh 50 4.6 Chỉ tiêu hồng cầu gà mắc bệnh cầu trùng 55 4.7 Chỉ tiêu hệ bạch cầu gà mắc bệnh cầu trùng 57 4.8 Hàm lƣợng protein huyết gà mắc bệnh cầu trùng 58 4.9 Tỷ lệ nhiễm loài cầu trùng gây bệnh gà 60 4.10 Sinh trƣởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E môi trƣờng khác 4.11 70 Sinh trƣởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E tỷ lệ tiếp giống khác 4.12 Sinh trƣởng chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E tốc độ lắc khác 4.13 73 Kết kiểm tra lƣợng kháng thể long đỏ trứng gà đƣợc gây miễn dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất 4.14 84 So sánh tỷ lệ chết gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 4.16 80 So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 4.15 73 85 So sánh sinh trƣởng gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E 85 4.17 Lƣợng Oocyst phân gà trƣớc sau điều trị 86 4.18 Tỷ lệ khỏi bệnh gà sau điều trị 86 4.19 Ảnh hƣởng kháng thể kháng sinh lên sinh trƣởng gà 87 viii review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine Altern Lab Anim Vol 33 (2) pp 192-154 109 Schnitzler B E., J G Mattson, F.Tomley and M W Shirley (1998) Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken Avian Patho Vol 27 (5) pp 490-497 110 Shen Y., X G Lao, Y Chen, H Z Zhang and X X Xu (2007) High-level expression of cecropin X in Escherichia coli International Journal of Molecular Sciences (8) pp 478-491 111 Shirley M W (1995) Eimeria species and strains of chickens In: Biotechnology Guidelines on Techniques in Coccidiosis Research, Luxembourg, European Commission pp 1–24 112 Shirley M W (1986) New methods for the identification of species and strains of Eimeria Research in avian coccidiosis University of Georgia, Athens 113 Shirley M W., A L Smithand D P Blake (2007) Challenges in the successful control of the avian coccidia.Vaccine Vol 25 (30) pp 5540-5547 114 Shivaramaiah C., J R Barta, X Hernandez-Velasco, G Téllez and B M Hargis (2014) Coccidiosis: recent advancements in the immunobiology of Eimeria species, preventive measures, and the importance of vaccination as a control tool against these Apicomplexan parasites Veterinary Medicine Vol (5) pp 23-34 115 Shimizu M., H Nagashima, K Sano and K Hashimoto (1993) Comparative studies on molecular stability of immunoglobulin G from different species Comp Biochem Physiol Vol 106 (2) pp 255-261 116 Smith N C., M Wallach, C M Miller, R Morgenstern, R Braun and J Eckert (1994) Maternal transmission of immunity to Eimeria maxima: enzyme-linked immunosorbent assay analysis of protective antibodies induced by infection Infect Immun.Vol 62 (4) pp 1348-1357 117 Song X., L Xu, R Yan, X Huang, M A Shah and X Li (2009) The optimal immunization procedure of DNA vaccine pcDNA-TA4-IL-2 of Eimeria tenella and its cross-immunity to Eimeria necatrix and Eimeria acervulina Veterinary parasitology Vol 159 (1) pp 30-36 118 Stucki U., R Braun and I Roditi (1993) Eimeria tenella: characterization of a 5S ribosomal RNA repeat unit and its use as a species specific probe Exp Parasitol Vol 76 (1) pp 68-75 102 119 Su Y C., A C Fei and F M Tsai (2003) Differential diagnosis of five avian Eimeria species by polymerase chain reaction using primers derived from the internal transcribed spacer (ITS-1) sequence Vet Parasitol Vol 117 (3) pp 221-227 120 Thomas J., D Kirsten and W Ternes (2008) Preserving functional properties of hen’s egg yolk during freeze-drying Journal of Food Engineering Vol 87 (4) pp 522-526 121 Tyzzer E E (1932) Coccidiosis in gallinaccous bird: a comparative study of species of eimeria of the chicken J Epidemiol Vol 15 (2) pp 319-393 122 Veerasami M., N B Singanallur, N Thirumeni, S K Rana, R Shanmugham, S Ponsekaran, M Muthukrishnan and S A Villuppanoor (2008) Serotyping of footand-mouth disease virus by antigen capture-ELISA using monoclonal antibodies and chicken IgY New Microbiol Vol 31 (4) pp 549-554 123 Vega C G and M Bok (2012) IgY Antibodies Protect against Human Rotavirus Induced Diarrhea in the Neonatal Gnotobiotic Piglet Disease Model Vol (8) Special section p1 124 Vervelde L., A N Vermeulen and S H Jeurissen (1996) In situ characterization of leucocyte subpopulations after infection with Eimeria tenella in chickens Parasite Immunol Vol 18 (5) pp 247-256 125 Wallach M., A Halabi, G Pillema, O Sor-Shalom, D Meucha and M G Lal (1992) Maternal immunization with gametocyte antigens as a means of providing protective immunity against Eimeria maxima in chickens Infect Immun Vol 60 (5) pp 2036–2039 126 Wallach M G., U Ashash and A Michael (2008) Field application of a subunit vaccine against an enteric protozoan disease Protozoan disease vaccine Vol (12).pp 1-7 127 Wallmann J., C Staak and E Luge (1990) A simple method for the isolation of immunoglobulin (Y) from the eggs of immunized hens Zentralblatt Fur Veterinarmedizin - Reihe B Vol 37 (4) pp 317-320 128 Wang L H., X Y Li, L J Jim, J S You, Y Zhou and S Y Li (2011) Characterization of chicken egg yolk Immunoglobulins (IgYs) specific for the most prevalent capsular serotypes of mastitis-causing Staphylococcus aureus Vet Microbiol Vol 149 (3-4) pp 415-421 129 Wang Q., J Li, X Zhang, Q Liu, C Liu, G Ma, L Cao, P Gong, Y Cai and G 103 Zhang (2009) Protective immunity of recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing rhomboid gene against Eimeria tenella challenge Veterinary Parasitology Vol 160 (3-4) pp 198–203 130 Williams R B (1998) Epidemiological aspects of the use of live anticoccidial vaccines for chickens Int J Parasitol Vol 28 (7) pp 1089-1098 131 Williams R B (1999) A compartmentalised model for the estimation ofthe cost of coccidiosis to the world's chicken production industry.Int J Parasitol Vol 29 (8) pp 1209-1229 132 Williams R B., A C Bushell, J M Répérant, T G Doy, J H Morgan, M W Shirley, P Yvoré, M M Carr and Y Frémont (1996) A survey of Eimeria species in commerciallyreared chickens in France during 1994 Avian Pathol Vol 25 (1) pp 110 - 130 133 Williamz L R and M C Dougald (1991) Coccidiosis deseases of Poultry Nineth Iowa State University Press, Ames, USA: p 38 - 40 134 Wills F K and L E Luginbuhl (1963) The use of egg yolk for passive immunization of chickens against Newcastle disease Avian Dis Vol (1) pp 5-12 135 Woods W G., K G Whithear, D G Richards, G R Anderson, W K Jorgensen and R B Gasser (2000) Single-strand restriction fragment length polymorphism analysis of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) for six species of Eimeria from chickens in Australia Int J Parasitol Vol 30 (9) pp 1019-1023 136 Xiao Y., X Gao, O Taratula, S Treado, A Urbas, R D Holbrook, R E Cavicchi, C T Avedisian, S Mitra, R Savla, P D Wagner, S Srivastava and H He (2009) AntiHER2 IgY antibody functionalized single-walled carbon nanotubes for detection and selective destruction of breast cancer cells BMC Cancer 137 Xu J., Y Zhang and J Tao (2013a) Efficacy of a DNA Vaccine Carrying Eimeria maxima Gam56 Antigen Gene against Coccidiosis in Chickens Korean J Parasitol Vol 51 (2) pp 147-154 138 Xu J., C Z Ren, S Wang, D Liu, L Cao and J Tao (2013b) Protection Efficacy of Multivalent Egg Yolk Immunoglobulin against Eimeria tenella Infection in Chickens Iran J Parasitol Vol (13) pp 449-458 139 Xu S Z., T Chen and M Wang (2006a) Protective immunity enhanced by chimeric DNA prime-protein booster strategy against Eimeria tenella challenge Avian diseases Vol 50 (4) pp 579-585 104 140 Xu Z., Z Zhong, L Huang, L Peng, F Wang and P Cen (2006b) High level production of bioactive human beta-defens in-4 in Escherichia coli by soluble fusion expression Applied microbiology and biotechnology Vol 72 (3) pp 471-479 141 Ye J., H Shao and D R Perez (2012) Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections Immunotherapy Vol (2) pp 175-186 142 Ying Z., L Wang, P Yao, J Zhang and J An (2013) Expression and purification of 3-1E gene from Eimeria acervulina in Pichia pastoris Journal of Chemical and Pharmaceutical Research Vol (11) pp 659-665 143 Yokoyama H., R C Peralta, R Diaz, S Sendo, Y Ikemori and Y Kodama (1992) Passive protective effect of chicken eggyolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets InfectImmun Vol 60 (3) pp 998-1007 144 Yokoyama K., N Sugano, A K Rahman, M Oshikawa and K Ito (2007) Activity of anti–Porphyromonas gingivalis egg yolk antibody against gingipains in vitro Oral Microbiol Immunol Vol 22 (5) pp 352-355 145 Yousif A A., W A Mohammad, M H deir and A A el-Sanousi (2006) Oral administration of hyperimmune IgY: an immunoecological approach to curbing acute infectious bursal disease virus infection Egypt J Immunol Vol 13 (2) pp 85-94 146 Zander D and E Mallinson (1991) Principles of disease prevention: diagnosic and control In Desaese of Poutry Ames Iowa State Univ pp 3-44 147 Zhao Y., C Wang, Y Lu, S Amer, P Xu, J Wang, J Lu, Y Bao, B Deng, H He and J Qin (2011) Prokaryotic expression and identification of 3-1E gene of merozoite surface antigen of Eimeria acervulina Parasitol Res Vol 109 (5) pp 1361-1365 148 Zhen Y H., L J.Jin, J Guo, X Y Li, Y N Lu and J Chen (2008) Characterization of specific egg yolk immunoglobulin (IgY) against mastitis-causing Escherischia coli Vet Microbiol Vol 130 (1-2) pp 126-133 105 PHỤ LỤC MỘT SỐ TRANG THIẾT BỊ DÙNG CHO NGHIÊN CỨU Bộ thiết bị điện di protein Máy luân nhiệt PCR Máy ly tâm lạnh Máy siêu âm mẫu Tủ nuôi lắc, ổn nhiệt Máy cảm ứng (water barth) 106 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG THÍ NGHIỆM Giải phẩu manh tràng gà mắc bệnh cầu trùng để thu Oocyst Đƣờng tiêu hóa gà mắc bệnh cầu trùng 107 Kiểm tra Oocyst cầu trùng gà Thu trứng gà chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E Kiểm tra hiệu giá kháng thể ELISA Kết tủa háng thể Cắt gel agarose có chứa gene 3-1E để tinh 108 PHỤ LỤC KIỂM ĐỊNH SỰ SAI KHÁC CÁC TỶ LỆ (Sử dụng phần mềm Minitab 14.0) Tỷ lệ nhiễm cầu trùng xã Rows: Xã Columns: ketqua - + All PH 158 51.30 160.0 150 48.70 148.0 308 100.00 308.0 PL 165 51.56 166.2 155 48.44 153.8 320 100.00 320.0 PT 157 53.04 153.8 139 46.96 142.2 296 100.00 296.0 All 480 51.95 480.0 444 48.05 444.0 924 100.00 924.0 Pearson Chi-Square = 29.213, DF = 3, P-Value = 0.025 Tỷ lệ nhiễm theo tuổi Rows: TUOI Columns: KETQUA - _ + All T1 150 80.65 63.52 0.00 14.52 36 19.35 107.96 186 100.00 186.00 T2 39 19.50 68.30 0.00 15.62 161 80.50 116.08 200 100.00 200.00 T3 42 32.31 44.39 0.00 10.15 88 67.69 75.45 130 100.00 130.00 T4 0.00 68.98 67 33.17 15.77 135 66.83 117.24 202 100.00 202.00 T5 62 44.29 47.81 0.00 10.93 78 55.71 81.26 140 100.00 140.00 293 34.15 293.00 67 7.81 67.00 498 58.04 498.00 858 100.00 858.00 All Pearson Chi-Square = 491.473, DF = 8, P-Value = 0.000 109 Bệnh tích gà bị nhiễm cầu trùng Rows: benhtichTT Columns: ketqua - + All MT 62 25.62 181.5 180 74.38 60.5 242 100.00 242.0 MT-RN 218 90.08 181.5 24 9.92 60.5 242 100.00 242.0 RN 219 90.50 181.5 23 9.50 60.5 242 100.00 242.0 TT 227 93.80 181.5 15 6.20 60.5 242 100.00 242.0 All 726 75.00 726.0 242 25.00 242.0 968 100.00 968.0 Pearson Chi-Square = 420.694, DF = 3, P-Value = 0.000 Tỷ lệ nhiễm loài cầu trùng Chi-Square Test: số không nhiễm số nhiễm Rows: loaicautrung Columns: ketqua Sk nhiễm số nhiễm All EA 305 61.24 359 193 38.76 139 498 100.00 498 EM 360 72.29 359 138 27.71 139 498 100.00 498 EMi 452 90.76 359 46 9.24 139 498 100.00 498 EN 396 79.52 359 102 20.48 139 498 100.00 498 EP 420 84.34 359 78 15.66 139 498 100.00 498 ET 221 44.38 359 277 55.62 139 498 100.00 498 All 2154 72.09 2154 834 27.91 834 2988 100.00 2988 Pearson Chi-Square = 356.277, DF = 5, P-Value = 0.000 110 Tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E Rows: loga Columns: KETQUA - + All DC 12 25.50 44 88 24.50 50 100 50.00 TN 45 90 25.50 10 24.50 50 100 50.00 All 51 51 51.00 49 49 49.00 100 100 100.00 Pearson Chi-Square = 60.864, DF = 1, P-Value = 0.000 So sánh tỷ lệ chết gà đƣợc không đƣợc phòng bệnh kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E Rows: loga Columns: KETQUA số gà k chết gà chết All DC 18 28.50 41 82 21.50 50 100 50.00 TN 48 96 28.50 21.50 50 100 50.00 All 57 57 57.00 43 43 43.00 100 100 100.00 Chi-Square = 62.056, DF = 1, P-Value = 0.000 Tỷ lệ khỏi bệnh gà sau điều trị Chi-Square Test: Số gà không khỏ bệnh; số gà khỏi bệnh Rows: logathnghiem Columns: ketqua kkhỏibệnh khỏi bệnh All LO1 4.00 1.25 48 96.00 48.75 50 100.00 50.00 LO2 0.00 1.25 50 100.00 48.75 50 100.00 50.00 LO3 0.00 1.25 50 100.00 48.75 50 100.00 50.00 111 LO4 6.00 1.25 47 94.00 48.75 50 100.00 50.00 All 2.50 5.00 195 97.50 195.00 200 100.00 200.00 Chi-Square = 5.538, DF = 3, P-Value = 0.036 One-way ANOVA: Gà khỏe HC, Gà bệnh HC Source hc Error Total DF 38 39 S = 0.2112 Level N gà bệnh 20 gà khoẻ 20 SS 5.6927 1.6949 7.3876 MS 5.6927 0.044 F 127.63 R-Sq = 77.06% P 0.000 R-Sq(adj) = 76.45% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -1.754 0.2029 ( -* -) 2.553 0.2192 ( -* -) -+ -+ -+ -+ -1.75 2.00 2.25 2.50 Pooled StDev = 0.2112 One-way ANOVA: Gà khỏe Hb, Gà bệnh Hb Source Hb Error Total DF 38 39 SS 25.28 58.74 84.02 MS 25.28 1.55 F 16.36 P 0.000 S = 1.243 R-Sq = 30.09% R-Sq(adj) = 28.25% Level N gà bệnh 20 gà khỏe 20 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -7.110 1.274 ( -* -) 9.400 1.212 ( -* -) -+ -+ -+ -+ -7.00 7.70 8.40 9.10 Pooled StDev = 1.243 10 One-way ANOVA: Gà khỏe Tỷ khối huyết cầu, Gà bệnh Tỷ khối huyết cầu Source tkhc Error Total DF 38 39 S = 0.8737 SS 595.984 29.006 624.990 MS 595.984 0.763 R-Sq = 95.36% F 780.79 P 0.000 R-Sq(adj) = 95.24% 112 Level gà bệnh gà khỏe N 20 20 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -21.851 0.742 (-*) 29.750 0.988 (-*) -+ -+ -+ -+ -22.5 25.0 27.5 30.0 Pooled StDev = 0.874 11 One-way ANOVA: Gà khỏe Thể tích bình quân hồng cầu, Gà bệnh Thể tích bình quân hồng cầu Source bqhc Error Total DF 38 39 S = 5.837 SS 118.9 1294.8 1413.7 MS 118.9 34.1 R-Sq = 8.41% Level N Mean Gà khỏe 20 120.312 gà bệnh 20 124.381 F 3.49 P 0.000 R-Sq(adj) = 6.00% StDev 0.16 8.25 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+-( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+-120.0 122.5 125.0 127.5 Pooled StDev = 5.84 12 One-way ANOVA: Gà khỏe Nồng độ huyết sắt tố bình quân, Gà bệnh Nồng độ huyết sắt tố bình quân Source hstbq Error Total DF 38 39 S = 0.2969 SS 0.2739 3.3496 3.6235 MS 0.2739 0.0881 R-Sq = 7.56% F 3.11 P 0.086 R-Sq(adj) = 5.13% Level N Mean StDev Gà bệnh 20 13.450 0.047 Gà khỏe 20 13.645 0.417 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) + -+ -+ -+ 13.32 13.44 13.56 13.68 Pooled StDev = 0.297 13 One-way ANOVA: Gà khỏe Lƣợng huyết sắt tố bình quân, Gà bệnh Lƣợng huyết sắt tố bình quân Source lhstbq Error Total DF 38 39 S = 0.2770 SS 88.0902 2.9161 91.0064 MS 88.0902 0.0767 R-Sq = 96.80% F 1147.89 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.71% 113 Level Gà bệnh 20 Gà khỏe 20 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev + -+ -+ -+ 40.505 0.195 (*) 37.527 0.340 (-*) + -+ -+ -+ 38.0 39.0 40.0 41.0 Pooled StDev = 0.277 14 One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu, Gà bệnh Bạch cầu Source bc Error Total DF 38 39 S = 1.261 Level N gà bệnh 20 gà khỏe 20 SS 364.39 60.46 424.86 MS 364.39 1.59 R-Sq = 85.77% F 229.01 P 0.000 R-Sq(adj) = 85.39% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -32.353 0.702 ( *-) 26.406 1.640 (-* ) -+ -+ -+ -+ -26.0 28.0 30.0 32.0 Pooled StDev = 1.261 15 One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu nhân trung tính, Gà bệnh Bạch cầu nhân trung tính Source dntt Error Total DF 38 39 S = 1.121 Level gà bệnh gà khỏe N 20 20 SS 2898.51 47.72 2946.23 MS 2898.51 1.26 R-Sq = 98.38% Mean 51.820 35.251 StDev 1.298 0.910 F 2308.11 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.34% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ -(*) (*) -+ -+ -+ -+ -35.0 40.0 45.0 50.0 Pooled StDev = 1.121 16 One-way ANOVA: Gà khỏe tế bào lympho, Gà bệnh tế bào lympho Source lympho Error Total DF 38 39 S = 0.5413 SS 2978.213 11.133 2989.346 MS 2978.213 0.293 R-Sq = 99.63% F 10165.81 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.62% 114 Level gà bệnh gà khỏe N 20 20 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+-41.011 0.685 (* 59.208 0.342 *) -+ -+ -+ -+-45.0 50.0 55.0 60.0 Pooled StDev = 0.541 17 One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu đơn nhân lớn, Gà bệnh Bạch cầu đơn nhân lớn Source bcdnl Error Total DF 38 39 S = 0.4527 SS 26.244 7.787 34.031 MS 26.244 0.205 R-Sq = 77.12% F 128.07 P 0.000 R-Sq(adj) = 76.52% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev + -+ -+ -+ gà bệnh 20 2.8050 0.3953 ( * -) gà khỏe 20 4.2050 0.5035 ( * -) + -+ -+ -+ 2.40 3.00 3.60 4.20 Pooled StDev = 0.4527 18 One-way ANOVA: Gà khỏe Bạch cầu kiềm, gà bệnh Bạch cầu kiềm Source DF SS MS F P bcak 0.000084 0.000084 0.09 0.764 Error 38 0.035062 0.000923 Total 39 0.035146 S = 0.03038 R-Sq = 0.24% R-Sq(adj) = 0.00% Level gà bệnh gà khỏe N 20 20 Mean 0.12045 0.12135 StDev 0.02451 0.03528 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * ) + -+ -+ -+ 0.1120 0.1200 0.1280 0.1360 Pooled StDev = 0.03038 19 One-way ANOVA: Gà khỏe bạch cầu toan, gà bệnh Bạch cầu toan Source bcatoan Error Total DF 38 39 S = 0.1267 Level gà bệnh gà khỏe SS 43.3472 0.6100 43.9572 MS 43.3472 0.0161 R-Sq = 98.61% F 2700.54 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.58% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev -+ -+ -+ -+ -20 3.3205 0.1572 (*) 20 1.2235 0.0859 (*) -+ -+ -+ -+ -1.20 1.80 2.40 3.00 Pooled StDev = 0.1267 115 20 One-way ANOVA: Gà khỏe Protein tổng số, gà bệnh Protein tổng số Source protein Error Total DF 38 39 S = 1.107 SS 3298.22 46.54 3344.76 Level gà bệnh gà khỏe MS 3298.22 1.22 R-Sq = 98.61% N 20 20 F 2692.77 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.57% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev + -+ -+ -+ 17.307 0.800 (*) 35.468 1.345 (*) + -+ -+ -+ 20.0 25.0 30.0 35.0 Pooled StDev = 1.107 21 One-way ANOVA: Gà khỏe Albumin, gà bệnh Albumin Source albumin Error Total DF 38 39 SS 1341.659 28.432 1370.091 MS 1341.659 0.748 F 1793.17 P 0.000 S = 0.8650 R-Sq = 97.92% R-Sq(adj) = 97.87% Level N gà bệnh 20 gà khỏe 20 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -6.151 0.719 (*) 17.924 0.989 (*) -+ -+ -+ -+ -7.0 10.5 14.0 17.5 Pooled StDev = 0.865 22 One-way ANOVA: Gà khỏe globulin, gà bệnh globulin Source globulon Error Total DF 38 39 SS 376.812 28.410 405.222 MS 376.812 0.748 F 504.00 P 0.000 S = 0.8647 R-Sq = 92.99% Level gà bệnh gà khỏe Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev -+ -+ -+ -+ -11.463 0.964 (-*-) 17.511 0.753 (-*-) -+ -+ -+ -+ -12.0 14.0 16.0 18.0 N 20 20 R-Sq(adj) = 92.80% Pooled StDev = 0.865 116 ...HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ Chuyên ngành : Bệnh lý. .. án: Khảo sát số đặc điểm bệnh lý bệnh cầu trùng gà nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng phòng trị Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi; Mã số: 62 64 01 02 Cơ sở đào tạo: Học viện... Mục đích nghiên cứu Khảo sát số đặc điểm bệnh lý chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng Thừa Thiên Huế tạo chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E cầu trùng gà, sử dụng cho