Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)

Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ CHUYÊN NGÀNH: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ : 62 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS ĐINH THỊ BÍCH LÂN PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM Phản biện 1: GS.TS NGUYỄN THỊ KIM LAN Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: TS BÙI KHÁNH LINH Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS NGUYỄN THỊ LAN ANH Viện Thú y Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh cầu trùng gà nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002) Hiện nay, để phòng trị bệnh cầu trùng người chăn nuôi chủ yếu dùng kháng sinh bổ sung vào thức ăn nước uống Tuy nhiên, phương pháp nhiều hạn chế như: Xuất số chủng Eimeria có khả kháng kháng sinh (Chapman, 1997), tạo loại thuốc đòi hỏi chi phí cao (Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dư sản phẩm gia cầm làm ảnh hưởng đến người tiêu dùng Vì vậy, tạo chế phẩm có tác dụng phòng trị bệnh cầu trùng, thay kháng sinh nhu cầu cấp bách thực tiễn Protein 3-1E kháng nguyên ề m t c khung đ c mở dài 513 p, mã h a đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lư ng ph n t 18.523 kDa, tồn giai đoạn Sporozoite Merozoite số loài E acervulina, E.tenella, E maxima Đã c nghiên cứu s dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ h p làm vắc xin chống lại E acervulina, E tenella E maxima (Lillehoj et al., 2000) Tiêm chủng ng vắc xin DN dựa gene 3-1E c ng g y đư c đáp ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011) Áp dụng công nghệ protein tái tổ h p để sản xuất kháng nguyên tái tổ h p 3-1E dùng kháng nguyên để gây tối miễn dịch cho gà tạo đư c kháng thể có khả chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng Đ y l i phương pháp tiếp cận có áp dụng công nghệ cao so với phương pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống Kháng thể lòng đỏ trứng gà đư c nhiều tác giả quan t m nghiên cứu hiệu n phòng trị ệnh nhiều ệnh truyền nhiễm đư c chứng minh M t khác, kháng thể lòng đỏ c giá thành thấp, dễ ảo quản, c độ an toàn tính đ c hiệu cao, đ c iệt tác động lên mầm ệnh, không ảnh hưởng đến vi sinh vật c l i thể, không g y tư ng kháng thuốc không làm ảnh hưởng đến chất lư ng thực phẩm Bên cạnh đ việc dùng kháng thể phòng điều trị ệnh giải pháp đư c lựa ch n hàng đầu định hướng phát triển ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng sinh phòng trị ệnh vật nuôi 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đư c đ c điểm ệnh lý ệnh cầu trùng gà đàn gà đư c nuôi Phú Vang- Thừa Thiên Huế Sản xuất đư c kháng nguyên tái tổ h p 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể kháng cầu trùng gà Xác định đư c hiệu phòng trị ệnh cầu trùng gà chế phẩm sinh h c chứa kháng thể IgY đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Về thời gian: Các nghiên cứu đư c thực từ 2012-2015, Viện công nghệ sinh h c- Đại h c Huế Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- H c viện Nông nghiệp Việt Nam Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát số đ c điểm ệnh lý ệnh cầu trùng gà Tre nuôi thịt địa àn tỉnh Thừa Thiên Huế nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh h c s dụng phòng trị 1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Kết luận án cho thấy triệu chứng l m sàng, tổn thương đại thể, vi thể thay đổi tiêu huyết h c gà Tre mắc ệnh cầu trùng thừa Thiên Huế Đồng thời, xuất phát từ l i công nghệ sản xuất glo ulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu c chế phẩm kháng thể đ c hiệu thay cho thuốc kháng sinh chống lại ệnh cầu trùng gà Đề tài đư c tiến hành để tạo chế phẩm sinh h c c chứa kháng thể đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E cầu trùng gà Điểm nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh h c để tạo kháng nguyên tái tổ h p 31E g y miễn dịch cho gà mái đẻ Sau đ thu trứng c chứa kháng thể đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E Thành công nghiên cứu chế tạo đư c ột lòng đỏ trứng c chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E cầu trùng gà s dụng phòng điều trị ệnh cho kết tốt như: Làm giảm tỷ lệ mắc ệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi ệnh tăng khả sinh trưởng gà 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đ y công trình nghiên cứu lĩnh vực sinh h c phân t để tạo kháng nguyên tái tổ h p 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để phòng điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế nâng cao hiệu cho ngành chăn nuôi gia cầm PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ Bệnh cầu trùng đư c phát ivolta (1983), ệnh loại ký sinh trùng c ph n gà, đến năm 1864 xác định đư c Eimeria nguyên sinh động vật sinh sản theo bào t thuộc lớp Sporozoa, Cocoidie, h Eimeriaidae Ngày bệnh cầu trùng gà giới xác định có khoảng 12 loài Eimeria Trong đ c loài đư c xác định rõ tên, kích thước, màu sắc gồm E tenella, E acervulina, E mitis, E brunetti, E necatrix, E maxima, E praecox, E hagani, E mivatti Có loài cầu trùng gà số loài gây bệnh phổ biến (trừ Eimeria hagani, Eimeria mivatti) (Conway and Mckenzie, 2007) 2.2 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Công nghệ ADN tái tổ h p đư c hình thành từ năm 1970 nhờ phát triển phương pháp kỹ thuật dùng nghiên cứu trình sinh h c mức độ phân t ADN tái tổ h p (còn g i công nghệ di truyền, công nghệ gene hay kỹ thuật gene…) tập h p kỹ thuật phân t để định vị, phân lập, biến đổi nghiên cứu đoạn ADN Thuật ngữ tái tổ h p đư c dùng thường xuyên mục tiêu kết h p ADN từ hai nguồn xa Ví dụ: gene từ hai nguồn vi khuẩn khác đư c liên kết lại, ho c gene người đư c đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn (Nguyễn Hoàng Lộc cs., 2007) 2.3 CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÕNG ĐỎ TRỨNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI Thành phần lòng đỏ trứng gà lipid protein Phần lipid, bao gồm triglyceride, phospholipid cholesterol, chiếm khoảng 30% lòng đỏ trứng Protein bao gồm 15 đến 17% lòng đỏ, c thể chia thành phần thành loại: phần hạt phần plasma, đ phần plasma lại ao gồm phần lipoprotein tỷ tr ng thấp thành phần hòa tan nước IgY n m phần hòa tan nước (Schade et al., 2005) Do đ việc tách chiết IgY yêu cầu phải loại bỏ lipoprotein thu nhận phần hòa tan nước (WSF) làm IgY (Poison et al., 1980) PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Địa điểm lấy mẫu: Các trang trại hộ chăn nuôi gia đình huyện Phú Vang- Thừa Thiên Huế Phòng Thí nghiệm môn Bệnh lý, Khoa Thú y - H c viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Quỳ- Gia Lâm- Hà Nội Phòng Thí nghiệm Bộ môn Miễn dịch h c vắc xin- Viện công nghệ sinh h c- Đại h c Huế, Phú Vang- Thừa Thiên Huế 3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Từ năm 2012-2015 3.3 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 3.3.1 Vật liệu nghiên cứu Gà mắc bệnh cầu trùng địa bàn Tỉnh Thừa Thin Huế Gà mái đẻ trứng chuyên dụng đư c tiêm đầy đủ loại vắc xin, gà không nhiễm cầu trùng số vật liệu thiết yếu khác 3.3.2 Thiết bị hóa chất dùng cho nghiên cứu Máy ly tâm Eppendorf, hệ thống máy đông khô lạnh Thermo Savant, máy Vortex - genic 2, máy ELISA tự động, khuấy từ IKA C-MAG HS 7, máy đúc Block, máy cắt Microton, máy phân tích huyết h c tự động Cell Dyn 3700, máy soi gel Dolphin- Doc, máy lắc c điều nhiệt để nuôi tế bào số trang thiết bị hóa chất thiết yếu khác 3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát đ c điểm bệnh lý bệnh cầu trùng gà - Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E coli - Nghiên cứu biểu gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết định lư ng kháng nguyên tái tổ h p - Kiểm tra độ tinh khiết tính đ c hiệu kháng nguyên tái tổ h p - Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 3.5 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng xác định bệnh tích đại thể, vi thể gà mắc cầu trùng 3.5.1.1 Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm theo dõi triệu chứng lâm sàng Các mẫu ph n đư c xét nghiệm theo phương pháp phù nổi, đánh giá mức độ cảm nhiễm gà Cường độ nhiễm đư c tính b ng mật độ Oocyst vi trường kính hiển vi: vi trường có từ - Oocyst (+); - Oocyst (+); - 10 Oocyst (+); 10 Oocyst (+) Theo dõi triệu chứng lâm sàng b ng phương pháp thường quy 3.5.1.2 Phương pháp xác định bệnh tích đại thể Tất gà nhỏ gà lớn ốm chết nghi mắc cầu trùng tiến hành mổ khám theo phương pháp Skrja in để kiểm tra bệnh tích đại thể, kiểm tra đường tiêu hóa a đoạn: Manh tràng, ruột non trực tràng, nạo niêm mạc soi tươi kính hiển vi để tìm quan sát Oocyst 3.5.1.3 Phương pháp xác định bệnh tích vi thể Mẫu tiêu vi thể đư c làm theo quy trình đúc ng Parafin, nhuộm tiêu b ng Haematoxylin - Eosin (HE) Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, H c viện Nông nghiệp Việt Nam 3.5.2 Phương pháp xác định tiêu huyết học gà mắc bệnh cầu trùng Máu gà lấy vào buổi sáng trước cho ăn cho vào ống có chứa chất chống đông để phân tích tiêu hệ hồng cầu gồm: Số lư ng hồng cầu (triệu/mm3máu); Hàm lư ng Hemoglobin (g/l); Tỷ khối huyết cầu (%); Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (g/dl); Lư ng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (pg) thể tích trung bình hồng cầu (fl),các tiêu hệ bạch cầu: Số lư ng bạch cầu (nghìn/mm3), công thức bạch cầu (%) hàm lư ng protein huyết đư c xác định b ng máy tự động Celldyn -3700 3.5.3 Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh gà 3.5.3.1 Thu thập tinh Oocyst cầu trùng gà Mẫu phân gà nghi nhiễm Eimeria đư c thu nhận từ nhiều địa phương khác địa bàn Thừa Thiên Huế Oocyst ký sinh trùng đư c thu theo phương pháp phù nổi, sau đ soi kính hiển vi quang h c với độ ph ng đại 40x để kh ng định c m t cầu trùng Dịch thu đư c từ phương pháp phù đư c x lý với chất diệt khuẩn NaClO 5,7 sau đ đư c r a lại nhiều lần b ng nước cất vô trùng lần với phosphat buffer saline 1X (PBS 1X) (Ding et al., 2012) 3.5.3.2 Phương pháp tách ADN tổng số cầu trùng gà DN đư c tách từ Oocyst cầu trùng theo phương pháp Carvalho et al (2010) có cải tiến, 3.5.3.3 Phương pháp PCR xác định loài cầu trùng gà ADN tổng số đư c s dụng làm khuôn mẫu để thực phản ứng PCR xác định có m t loài cầu trùng Các c p mồi đ c hiệu cho loài cầu trùng giống Eimeria đư c tham khảo theo (Carvalho et al., 2011) 3.5.4 Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 3.5.4.1 Thiết kế mồi phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E Gen 3-1E đư c phân lập với c p mồi có trình tự sau topo31E.F: 5’-CACCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTAGAAGCCGCCCTGGTACA-3’ 3.5.4.2 Tách chiết ARN tổng số ARN tổng số cầu trùng gà Eimeria đư c tách chiết b ng Kit “SV Total N Isolation System” S i ADN bổ sung đư c tổng h p dựa Kit “First Strand cDN Synthesis” Sản phẩm ARN sau tách chiết đư c ghi kí hiệu mẫu bảo quản -70ºC để s dụng cho thí nghiệm sau 3.5.4.3 u tr nh ph n ứng tổng hợp sợi ADN bổ sung S dụng Kit hãng Fermentas (Nhật Bản) đư c thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.5.4.4 u tr nh ph n ứng PCR ph n ập gene 3-1E S i ADN bổ sung thứ sau đư c tổng h p s dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR phân lập gene mã hóa tạo kháng nguyên 3-1E với c p mồi topo3-1E.F topo3-1E.R 3.5.4.5 Tinh s n phẩm PCR Sản phẩm PCR đư c tinh theo hướng dẫn Kit (Wizard®SV Gel and PCR CleanUp System) Sản phẩm gene 3-1E sau tinh đư c ký hiệu bảo quản -20oC thực thí nghiệm 3.5.4.6 Kỹ thuật điện i iểm tr s n phẩm ARN, PCR Kiểm tra sản phẩm ARN tổng số agarose gel 1% có s dụng formaldehyde để biến tính, điện trường hiệu điện 60 V, cường độ 250 m , thời gian 120 phút ADN đư c điện di agarose gel 1% 3.5.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên vector tạo dòng biến nạp vào tế bào vật chủ E coli TOP10 3.5.5.1 Gắn s n phẩm PCR có chứa gene 3-1E vào vector tạo dòng pGEM® - T Easy Sản phẩm phản ứng PC sau đư c tinh b ng Kit “Wizard®SV Gel and PCR CleanUp System” sau đ đư c gắn vào vector pGEM® -T Easy theo phương pháp dòng h a T (T -cloning) hãng Invitrogen, c enzym T4 DN ligase làm enzym nối, kỹ thuật gắn theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.5.5.2 Biến nạp v ctor tái tổ hợp v o tế o E co i T P1 Biến nạp trình chuyển sản phẩm gắn vào tế chủ E coli TOP10, tế dương tính đư c ch n l c nuôi cấy môi trường thích h p để thu nhận đư c lư ng lớn tế đư c chuyển nạp vector tái tổ h p, sau đ thông qua tách chiết DN tái tổ h p thu đư c lư ng lớn DN vector tái tổ h p 2.5.5.3 Chọn lọc khuẩn lạc ương tính Các khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc trắng) đư c tiến hành ch n l c ngẫu nhiên kiểm tra b ng phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu cho gene 3-1E ho c c p mồi (M13) đư c thiết kế sẵn vector Các khuẩn lạc dương tính với sản phẩm PC đư c nuôi cấy ống nghiệm chứa ml môi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml kháng sinh ampicillin, 37°C qua đêm 3.5.5.4 Tách ADN p smi tái tổ hợp Các dòng khuẩn lạc dương tính nuôi cấy ống nghiệm qua đêm đư c s dụng để tách chiết plasmid theo Kit tách chiết plasmid tái tổ h p hãng Invitrogen 3.5.5.5 iểm tr ADN p smi tái tổ hợp Plasmid pGEM®-T Easy hãng Promega c độ dài 3015 bp, vector có chứa vị trí liên kết gen pUC cho khuếch đại c p primer M13, tiến hành phản ứng PC plasmid tái tổ h p ng c p mồi này, thu đư c đoạn DN cho độ dài tương ứng 713 bp (bao gồm kích thước gene đoạn khoảng 200 bp n m vector pGEM®-T Easy c p primer M13 khuếch đại 3.5.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E vector pET200/D-TOPO biểu gene kháng nguyên 3-1E 3.5.6.1 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E vector pET200/D-TOPO biến nạp vào tế bào vật chủ E coli BL21 (DE3) Sản phẩm PCR từ vector pGEM®-T Easy đư c cắt khỏi agarose gelvà tinh b ng Kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)”, sau đ gắn vào vector pET200/D-TOPO (Invitrogen, Mỹ) Các bước thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 3.5.6.2 Nghiên cứu biểu gene kháng nguyên 3-1E Các tế bào E coli BL21(DE3) có chứa vector biểu mang gene 31E đư c nuôi bình tam giác chứa 10 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 1% glucose 50 μg/ml kanamycin 37oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút Khi mật độ tế bào dịch nuôi cấy (OD600) đạt tới 0,8 bổ sung IPTG đến nồng độ 0,5 mM nuôi tiếp 20oC, sau đ thu sinh khối 3.5.6.3.Phương pháp điện di SDS-PAGE Điện di protein tái tổ h p polyacrylamide gel 15% kháng thể lòng đỏ trứng gel 12% 3.5.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu định lƣợng kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 3.5.7.1 Tách chiết tinh khiết kháng nguyên 3-1E Kháng nguyên 3-1E đư c tinh b ng Kit “ProBondTM Purification System (Invitrogen, USA)” theo nguyên lý sắc ký lực đuôi 6×His protein dung h p phối t Ni2+ cột sắc ký 3.5.7.2 Kiểm tr tính đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp Để kiểm tra tính đ c hiệu kháng nguyên 3-1E tái tổ h p, s dụng phương pháp Western lot để xác định kết h p đ c hiệu kháng nguyên 3-1E với kháng thể đư c sản xuất từ kháng nguyên 3-1E 3.5.8 Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng phòng trị bệnh cầu trùng gà 3.5.8.1 Phương pháp xác định liều ượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch S dụng 18 gà mái chia thành lô thí nghiệm: Lô lô đối chứng (không tiêm kháng nguyên), lô nghiệm thức đư c g y đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên tái tổ h p 3-1E liều lư ng khác nhau, lần lư t từ lô đến lô 25; 50; 100; 150; 200 µg So sánh kết để tìm liều lư ng kháng nguyên thấp cho lư ng kháng thể cao 3.5.8.2 Phương pháp chọn tá chất thích hợp gây miễn dịch cho gà Gà mái Hy-line độ tuổi đẻ trứng đư c chia làm lô (3con/lô) Gà lô đư c gây miễn dịch sau (Lô 1: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Freund,s; Lô 2: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Montanide ISA 201 VG; lô 3: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Montanide ISA 50 V2 với nước sinh lý vừa đủ 1ml) Gà đư c tiêm 1ml/con, m i tiêm thứ hai cách m i tiêm thứ 10 ngày, m i tiêm lần thứ ba cách lần thứ hai 20 ngày Thu thập trứng, tách chiết kháng thể thực phương pháp ELIS , để xác định lô gà cho lư ng kháng thể cao 3.5.8.3 Phương pháp ELISA xác định kháng thể Cho vào m i giếng 100 μl kháng nguyên cầu trùng (3-1E) tái tổ h p pha với dung dịch Carbonate-Bicarbonate (5 µg/ml) Mẫu chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E đư c pha loãng ng PBS 0,01 M vào giếng Kháng thể IgY đ c hiệu đư c phát b ng cách bổ sung kháng thể thỏ kháng IgY cộng h p (Horseradish peroxidase) chất OPD Dừng phản ứng với 3M H2SO4 đ c kết ước sóng 492 nm 3.5.8.4 Tách chiết IgY từ òng đỏ trứng Kháng thể IgY đư c tách chiết từ lòng đỏ trứng tinh dựa theo Bizhanov and Vyshniauskis (2000) Ko and Ahn (2006) mô tả có cải tiến 3.5.8.5 Đông hô ột òng đỏ trứng Bột lòng đỏ trứng đư c đông khô dựa theo qui trình đư c Thomas Jaekel (2008) mô tả Sau tách hết lòng trắng, lòng đỏ đư c đông lạnh tủ đông -20oC 24 đư c đông khô ng hệ thống đông khô 36 3.5.9 Phƣơng pháp đánh giá hiệu phòng điều trị bệnh cầu trùng chế phẩm 3.5.9.1 Phương pháp đánh giá hiệu qu phòng ệnh Thí nghiệm phòng bệnh đư c tiến hành 100 gà 30 ngày tuổi khỏe mạnh (không có biểu l m sàng ệnh cầu trùng, x t nghiệm phân Oocyst trùng, ăn uống hoạt động ình thường), c khối lư ng đồng Gà đư c chia thành lô Lô đối chứng đư c ăn tự thức ăn h n h p hoàn chỉnh Công ty Cargill, không bổ sung bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E cầu trùng (sau đ y g i tắt ột kháng thể) Lô thí nghiệm đư c ăn tự thức ăn h n h p hoàn chỉnh Công ty Cargill trộn bột kháng thể lư ng 5g bột lòng đỏ 25 kg thức ăn, cho ăn liên tục 10 ngày Gây nhiễm thực nghiệm b ng cách cho uống 105 Oocyst/con (cầu trùng sau thu đư c ủ 29oC 22 với dung dịch 4.1.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng Những iểu triệu chứng l m sàng gà ị ệnh cầu trùng đư c tổng h p qua ảng 4.3 Bảng 4.3 Triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh cầu trùng Triệu chứng lâm sàng quan sát đƣợc STT Số gà có biểu (con) 17 Tỷ lệ (%) Bỏ ăn Giảm ăn, uống nước nhiều 120 60,00 Ủ r , lười vận động 186 93,00 Lông xù, xơ xác, ph n dính hậu môn 160 80,00 Mào yếm nh t nhạt 40 20,00 Phân loãng, nhiều nước, có b t khí 175 87,50 Phân màu sô côla 120 60,00 Phân có lẫn máu 70 35,00 8,50 Gà mắc bệnh cầu trùng gồm có triệu chứng sau: đứng tụ lại đám vài một, dáng mệt nh c, chậm chạp Sau đ giảm ăn rõ rệt, 4.1.4 Bệnh tích đại thể chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng Kết mổ khám 242 gà chết nghi bệnh cầu trùng lứa tuổi khác b ng phương pháp mổ khám không toàn diện Skrjabin, gà bị bệnh với tổn thương bệnh lý chủ yếu đư c thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Kết mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng Bệnh tích đƣờng tiêu hóa Tuổi gà (ngày) Số gà mổ khám – 14 15 – 21 22 – 28 29 – 35 36 – 42 Tổng 20 56 59 67 40 242 Manh tràng Ruột non Trực tràng Số 16 44 45 50 25 180 Số Tỷ lệ (%) 5,00 7,14 8,47 10,44 15,00 23 9,50 Số Tỷ lệ (%) 80,00 78,57 76,27 74,62 62,50 74,38 15 Tỷ lệ (%) 5,00 5,08 8,95 12,50 6,19 Manh tràng ruột non Số Tỷ lệ (%) 10,00 14,28 10,16 5,97 10,00 24 9,91 Kết bảng cho thấy tổn thương manh tràng cao chiếm 74,38 Giai đoạn gà từ 8-14 ngày tuổi tổn thương cầu trùng gây manh tràng cao chiếm tới 80,00 giai đoạn gà từ 36-42 ngày tuổi có tỷ lệ thấp với 62,50% Bệnh tích ruột non tăng gà lớn thể 11 từ 5,00% giai đoạn 8-14 ngày tuổi lên 15,00% 36-42 ngày tuổi 4.1.5 Bệnh tích vi thể chủ yếu số quan gà mắc bệnh cầu trùng Sau kiểm tra bệnh tích đại thể từ gà mổ khám, tiến hành lấy đoạn ruột: Ruột non, manh tràng, trực tràng, gan, tụy, thận, lách, phổi gà bệnh để làm tiêu M i block có tiêu có xuất giai đoạn phát triển cầu trùng ên thể đư c coi dương tính Kết đư c trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Tần suất xuất giai đoạn phát triển cầu trùng gà tiêu vi thể quan gà bệnh Cơ quan Manh tràng Ruột non Trực tràng Gan Tụy Thận Lách Phổi Số Block nghiên cứu Số Block dƣơng tính Tần suất (%) 40 31 0,77 40 40 40 40 40 40 40 15 0 0 0,37 0,12 0 0 Ruột non: Trong lòng ruột có nhiều hồng cầu, chất chứa lòng ruột non tế thư ng bì Biểu mô ruột xuất huyết vỡ nát, lông nhung ruột bị đứt nát, xuất huyết, tế bào lông nhung có biến đổi dính lại với thành đám làm ruột non bị thu hẹp Manh tràng: Tổn thương điển hình, lớp niêm mạc manh tràng bị viêm, xuất huyết, mạch quản giãn rộng lòng chứa nhiều tế bào hồng cầu, bạch cầu Trực tràng: Qua quan sát tiêu nhận thấy lòng ruột có chất nhầy lẫn máu tế bào niêm mạc bị thoái hóa, hoại t Các giai đoạn phát triển khác cầu trùng đư c tìm thấy tiêu vi thể quan gà bệnh: Ruột non, manh tràng, trực tràng, gan, tụy Xác suất tìm thấy manh tràng cao (0,77%), tiếp đ ruột non (0,37%) thấp trực tràng (0,12%) 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA GÀ MẮC BỆNH CẦU TRÙNG 4.2.1 Một số tiêu hồng cầu gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng Gà mắc bệnh biến đổi tổ chức mức độ vi thể đại thể, bên cạnh đ số huyết h c máu c ng thay đổi đáng kể Để góp phần cung cấp thêm thông tin gà mắc bệnh cầu trùng, so sánh 12 số tiêu chủ yếu gà mắc bệnh cầu trùng với gà khỏe vào lúc 3542 ngày tuổi Bảng 4.6 Chỉ tiêu hồng cầu gà mắc bệnh cầu trùng Đối chứng (n=20) Chỉ tiêu Gà bệnh (n=20) X  mx X  mx a Số lư ng Hồng cầu (triệu/mm ) 2,55 ± 0,04 1,75 ± 0,03b a Hàm lư ng Hb (g/l) 9,40 ± 0,25 7,10 ± 0,20b a Tỷ khối huyết cầu (%) 29,75 ± 0,65 21,85 ± 0,67b b Thể tích bình quân hồng cầu (fl) 120,31 ± 4,80 124,38 ± 4,00a a Nồng độ huyết sắc tố bình quân hồng cầu (g/dl) 31,64 ± 1,32 31,45 ± 1,35a Lư ng huyết sắc tố bình quân hồng cầu (pg) 37,52 ± 1,40b 40,50 ± 1,03a Bảng 4.6 cho thấy tiêu sinh lý máu gà nhiễm cầu trùng gà so với gà không nhiễm có khác biệt rõ rệt, số lư ng hồng cầu gà nhiễm cầu trùng 1,75 triệu/mm3, thấp so với gà không nhiễm 2,55 triệu/mm3 (p