Thành phần hóa học của nấm cổ linh chi (Ganoderma australe

Nghiên cứu thành phần hoá học dịch chiết nấm Cổ Linh chi (Ganoderma australe Pat.) thuộc họ Ganodermaceae ở Việt Nam Sử dụng các phư¬ơng pháp phổ hiện đại: phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng (EIMS), phổ cộng h¬ưởng từ hạt nhân 1HNMR, 13CNMR, DEPT, HMBC và HSQC để xác định cấu trúc các hợp chất tách được. Các kết quả phổ đã xác định: hợp chất 83 là ergosta4,22dien3on; hợp chất 84 là 5α, 8epidioxyergosta6,22dien3ol.

Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường sống khác nhau, kể cả sa mạc Đa phần nấm sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trường nước Dựa theo sự theo tỉ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở trong cùng một môi trường, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài [9] Tuy nhiên mới có khoảng 70.000 loài nấm đã được các nhà phân loại học phát hiện và miêu tả.

Nấm đã được sử dụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người Chúng là nguồn thực phẩm giàu

chất dinh dưỡng (Termitomyces albuminosus, Macrocybe gegantea), là nguồn

thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng, chứa nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E ) [17]

Nhiều loài nấm được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh như: Laricifomes officinalis là nguyên liệu để chiết aragicin dùng trong chữa bệnh lao [7,13], hoặc dùng làm thuốc nhuận tràng hay chất thay thế cho quinine [13] Những loại nấm như nấm múa, nấm hương , nấm linh chi đã được tập trung nghiên cứu bởi khả năng chống ung thư, chống virus và tăng cường hệ miễn dịch của chúng

Từ hơn 2000 năm trước, Linh chi đã được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc quý chỉ vua chúa mới được sử dụng Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện thêm nhiều loài linh chi có những đặc tính quý, rất tốt cho phòng và

chữa bệnh Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) được dùng để hỗ trợ điều

trị nhiều bệnh như bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư, AIDS [1, 2, 4, 10]

2

Trong dịch chiết methanol, hexane, ethyl acetate từ các quả thể của Ganoderma

lucidum có các hoạt chất như có hoạt tính kháng virus Chúng có tác dụng kìm

hãm sự sinh trưởng và phát triển của virus HIV [10] Các hoạt chất từ Ganoderma

applanatum có hiệu lực chống khối u cao [2], chúng được sử dụng trong điều trị

ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày [1] Các dẫn xuất adenosine có

trong G.capense và G amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính

tiền tiểu cầu [3]

Việt Nam nằm ở trung tâm Đông Nam Á hằng năm có lượng mưa và nhiệt

độ trung bình tương đối cao Với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm đã tạo cho

rừng Việt nam có một hệ động, thực vật đa dạng và phong phú

Nghệ An là tỉnh có vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt Đây là những vùng được đánh giá là

có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm…

Tuy nhiên, cho đến nay nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và Nghệ

An nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới mẻ, chưa nhận được sự quan tâm

đúng mức của các nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở Nghệ An là

một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn quan trọng, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta nói chung và tỉnh Nghệ

An nói riêng Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa

học của nấm cổ linh chi (Ganoderma australe (Fr.) Pat.) ở Nghệ An ”

2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là dịch chiết từ loài nấm cổ linh chi

(Ganoderma australe (Fr.) Pat.) thuộc họ Nấm Linh chi (Ganoderma) ở Nghệ

An

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn bao gồm:

3

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các dịch chiết của quả thể nấm Cổ Linh chi

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất

4

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Chi Ganoderma (Linh chi)

1.1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm Linh chi

Linh chi đã được sử dụng trong dân gian từ rất lâu, nhưng theo cách hiểu dân gian thì Linh chi chỉ là một loại nấm có lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, hoặc nâu

đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm Mũ nấm có màu đỏ hoặc đỏ

hồng Nhưng đó chỉ là một loài nấm trong họ nấm Linh chi - Ganodermataceae

Lịch sử nghiên cứu nấm Linh chi đã trải qua hơn 200 năm với nhiều biến

đổi và ngày càng thu được những kết quả khoa học có giá trị hơn Lần đầu tiên

W Curtis (1871) đã phát hiện và đặt tên cho l à n ấ m L i n h c h i Một trăm

năm sau, Karsten mới xác lập chi Ganoderma và những nghiên cứu về hệ

thống học, phân loại học nhóm nấm này mới thực sự phát triển Từ khi xác lập

thành một chi riêng, là Ganoderma Karst.(1881) đến nay nhóm nấm quý họ linh

chi đã có 386 tên loài được ghi nhận trên toàn thế giới, trong đó 221 loài được các nhà khoa học công nhận, hơn 200 loài còn lại là các loài đồng nghĩa, các loài

được sắp xếp nhầm vào họ linh chi và gần 10 loài chưa xác định loại được Riêng

loài G.lucidum đã có 40 thứ Chúng phân bố khắp nơi trên thế giới, nhưng thường

mọc rộng rãi nhất tại các nơi có khí hậu nhiệt đới, môi trường sống của nấm thường ở rừng kín xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến 1500 m [5], [16], [18]

Điểm đặc biệt chỉ có ở nhóm nấm này là màng bào tử đảm 2 lớp - một dấu

hiệu di truyền nổi bật, cho nên nhiều nhà khoa học đã đề nghị để ở bậc taxon cao

hơn và xếp chúng thành 1 họ độc lập: họ Linh chi (Ganodermataceae Donk) Theo

Donk (1993), phân họ Ganodermataceae thuộc:

5 Năm 1971, Ainsworth G.C dựa vào đặc điểm hình thái q u ả thể, cấu trúc bào tử đảm, đã đưa ra hệ thống phân loại một cách hoàn chỉnh Cho đến nay hệ thống phân loại này đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng [16], [17], [18]

Nấm Linh chi có đặc điểm chung của ngành là: được cấu tạo bởi các tế bào

có nhân thật, không có diệp lục, nhận thức ăn từ môi trường bên ngoài bằng cách hấp thu từ giá thể (sống dị dưỡng) [18] Ngoài ra còn có các đặc điểm riêng [16], [17], [18], [22]:

+ Sợi nấm gồm nhiều đoạn ngăn cách với nhau bởi các vách ngang Mỗi

đoạn được coi như một tế bào có một hay nhiều nhân Trên các vách ngang đó có

lỗ nhỏ, từ đó chất nguyên sinh và cả nhân có thể đi qua

+ Cuống quả thể biến dị lớn: Các loại đa niên thường không cuống còn các loài có cuống thì rất phong phú: Từ loài có cuống rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến các loài dài cỡ hàng 5–10cm hoặc rất dài (20–25cm), to và mập (đường kính có thể tới 3,3cm) Cuống nấm có thể phân nhánh hoặc không, màu sắc thay đổi khác nhau tuỳ từng loài Cuống thường đính bên, đôi khi đính gần tâm do quá trình liên tán mà thành

+ Mũ nấm: Dạng thận, gần tròn đôi khi xoè thành hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ Màu sắc từ vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, đỏ tím, nâu đen, nhẵn, bóng, láng như vecni, sẫm màu dần khi già Lớp vỏ láng phủ suốt trên mặt mũ và chạy dài theo cuống nấm Kích thước tán biến động từ 2–30cm, dày 0,8 – 2,5cm tuỳ từng loại Phần đính với cuống hoặc gồ lên hoặc lõm xuống

+ Thịt nấm dày từ 0,4–1,8 cm màu vàng kem, nâu nhạt, trắng Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc, cứng và nhẹ Hệ sợi có đầu tận cùng phình hình chuỳ, màng rất dày, đan kết vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt mũ

+ Bào tầng là một lớp ống dày từ 0,2–1,7cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng, vàng ánh xanh

+ Đảm đơn bào mang 4 bào tử đảm hình trứng, trứng cụt

+ Bào tử đảm có cấu trúc vỏ kép, màu vàng mật ong sáng, ở giữa tụ dạng

6 giọt dầu, kích thước (5 –6) x (8,8 – 12) µm Vỏ bào tử khá dày cỡ 0,7 –12 µm,

có cấu trúc phức tạp: Màng ngoài trong suốt, màng trong sần sùi mụn cóc, gai nhọn, gò trống

Đặc biệt, dù hình thái bên ngoài của nấm biến đổi rất đa dạng, song về cấu

tạo của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật Bản, Trung Quốc hay chủng Lim đà Lạt, Hà Bắc

Các bào tử đảm đơn bào, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo ra hệ sợi sơ cấp rồi qua một loạt sự phát triển tạo tán nấm Tán nấm hình thành bào tầng rồi lại phát tán bào tử đảm tạo thành chu trình sống của nấm Linh chi Chu trình sống này tương tự như chu trình sống của những nấm đảm khác

Hình 1.1 Chu trình phát triển của nhóm Nấm họ Linh chi

Nấm hoá gỗ, sống một năm hay lâu năm Quả thể có mũ dạng thận, tròn hoặc dạng quạt, dày, đường kính 3-10cm, cuống dài dính lệch, hình trụ tròn hay dẹt, có khi phân nhánh, mặt trên mũ có những vòng đồng tâm, mép lượn sóng Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn

Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dưới của quả thể Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục

7 hoặc đất Hiện nay ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam, người ta đã chủ

động nghiên cứu trồng được nhiều loại nấm linh chi trên giá thể nhân tạo để

dùng làm thuốc

Nấm Linh chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay đã chết Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11), có thể mọc trên thân cây, quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây, thích hợp với bóng rợp, ánh sáng khuyếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà Nên ở các vùng núi đồi cao trên 1000m so với mực nước biển, thường có các chủng thích hợp nhiệt độ thấp từ

21 - 260 như các vùng ở Tam Đảo, Pù Mát, Thừa Thiên Huế, Trường Sơn nước ta

Các loài Nấm Linh chi được phát hiện ở Việt Nam khá sớm Dựa theo màu sắc mũ nấm, Lý Thời Trân (1590) phân biệt thành sáu loại Linh Chi với tên gọi tương ứng: Linh chi trắng (Bạch chi hay Ngọc chi), Linh chi vàng (Hoàng chi hay Kim chi), Linh chi xanh (Thanh chi hay Long chi), Linh chi đỏ (Xích chi hay hồng chi), Linh chi tím (Tử chi), Linh chi đen (Hắc chi hay huyền chi)

Các nhà Thực vật học, Y- Dược học kế tục Tuệ Tĩnh đã phát hiện được 26 loài thuộc chi Ganoderma [18]:

1 Ganoderma amboinense (Lam & Fr.) Pat

7 G capense (L.Loyd) Pat

8 G cochlear (Bl & Nees) Bress

9 G fulvelum Bres

10 G guinanense Zhao et Zhang

11 G hainanense Zhao, Xu & Zhang

12.G koningsberg Li (L.Loyd), Teng

13.G lobattum (Schow) Atk

8

14 G lucidum (Leyss ex Fr) Karst

15 G mastoporum (Mont) Pat

16.G ochrolacctum (Mont) Pat

17.G orflavum (L Loyd) Teng

18.G philipii (Bress et Henn) Bres

19.G virulosum Pat et Har

20.G sasile Murr

21.G sichuanense Zhao & Zhang

22.G sinense Zhao, Xu & Zhang

23 G subtornatum Murr

24.G toantum (Pers) Pat

25.G tropicum (Jungh) Bres

26.G tsugae

Theo những nghiên cứu của Trần Văn Mão, Trịnh Tam Kiệt, đàm Nhận, Phạm Quang Thu, Lê Xuân Thám đã phát hiện được 46 loài Linh chi ở lãnh thổ nước ta, trong đó có 4 loài chuẩn và 4 chủng [5], [15], [18]

Theo thống kê của tổ chức lương thực thế giới (FAO) thì G lobatum đã

được sử dụng làm thuốc tại Trung Quốc G.lobatum đã được phát hiện tại

Cộng hoà Sec, tại quần đảo Sky ở Arizona [31], [36] Ở Việt Nam G.lobatum đã

phát hiện được ở rừng thuộc địa phận tỉnh Ninh Bình

Với những giá trị ngày càng được khẳng định, loài chuẩn nấm Linh chi màu

đỏ – Hồng chi , xích chi, đơn chi…là 1 trong vài ba loài nấm được nghiên

cứu kỹ lưỡng nhất, được nuôi trồng cho sản lượng ngày càng lớn, kể cả các nước Âu - Mỹ

9

Hình 1.2 Ganoderma lucidum (W.Curt.: Fr.) Karst - Linh chi đỏ

Hình 1.3 Ganoderma sinesis - Huyền chi

Hình 1.4 Ganoderma tropicum

Hình 1.5 Ganoderma tsugae

Hình 1.6 Ganoderma appalanatum 1.1.2 Thành phần hóa học:

Tổng kết từ những nghiên cứu trước đây, thành phần hoá học của loài

Ganoderma lucidum và một số loài khác trong chi Ganoderma có thành phần

chính như sau [5], [16], [18]:

- Nước 12 - 13%, lignin 13 - 14%

- Hợp chất nitơ: 1,6 - 2,1%

Ngoài ra nấm còn chứa các nguyên tố vô cơ: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg,

Mn, Sn, Zn, Bi Cùng với những tiến bộ các khoa học kỹ thuật và bằng các phương pháp hiện đại: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), Sắc ký khí - Khối phổ liên hợp, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và phổ kế plasma (ICP) từ những năm 1980 đến nay, người

ta đã xác định chính xác rất nhiều thành phần hoá học trong nấm Linh chi Cho

đến nay theo thống kê của một số tác giả thì đã phát hiện và chứng minh cấu trúc

hoá học của hàng trăm chất có trong G lucidum

Theo các tác giả Gao Y.H và Kim H.W trong quả thể của nấm Linh chi

có polysacarid, acid amin, hợp chất steroid, saponin, protein, alcaloid, dầu béo… ngoài ra còn có thành phần flavonoid Một nhóm chất rất phổ biến, thường gặp trong các loài nấm Linh Chi là terpenoid [34], [35] Các báo cáo cho thấy, các dẫn chất bậc hai có hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc hai nhóm: triterpenoid và polysaccarit

1.1.2.1 Lanostanoit tritecpenoit

Lanostanoit là kiểu cấu trúc thường gặp nhất khi phân tích thành phần hóa học của các loài Ganoderma

Trong nhiều năm qua các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào Ganoderma

lucidum [22-23], nổi tiếng tại Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc và khu vực Đông

Á khác, nơi mà các thảo dược được sử dụng để điều trị các bệnh như ung thư, viêm gan, viêm phế quản mãn tính, hen suyễn, bệnh trĩ và triệu chứng của mệt mỏi 24 Bên cạnh đó cung cấp một số lượng lớn các hợp chất, ngày nay vẫn tiếp tục cô lập các chất chuyển hóa có hoạt tính dược lý mới đã được công bố gần đây 25-26 Có khoảng 130 tritecpenoit loại lanostanoit oxy hóa cao đã được phân lập từ

sợi nấm và bào tử của G Lucidum

Từ những kết quả thu được khi phân tích thành phần của G.lucidum, trong

những năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nhiều loài nấm khác trong họ

này như: G tsugae, G.applanatum, G australae…

Các triterpennoit được phân lập từ các bộ phận khác nhau của G lucidum là:

Trong các lanostanoid phân lập được từ loài này ta thấy số lượng các axit

ganoderic chiếm một lượng lớn Dựa theo các nhóm chức khác nhau (như độ lớn

của các nhóm thế - hydroxyl oxo, acetoxyl,), đặc biệt là ở các nhóm thế ở vị trí

C-3, C-7, C-15 và C-22 thường quan sát thấy ở những bộ khung), kiểu mạch, cấu

trúc bộ khung mà các axit ganoderic được chia thành 3 loại chính:

R

R R

COOH

R R

R R

3 4

4 3

2 1

III

Hình 1.7 Các kiểu cấu trúc lanostanoit cơ bản

Năm 1982, từ dịch chiết clorofom của quả thể G.lucidum, Kubota và cộng sự

đã phân lập được hai hợp chất mới là axit ganoderic A (1), B (2)

11 12

14 15 20

O

OH H

HO

(1) Ganoderic acid A (2) Ganoderic acid B

Nghiên cứu này mở đầu cho việc tìm ra những dẫn xuất lanosterol mới trong

họ nấm này Có khoảng 130 tritecpenoit loại lanostanoit oxy hóa cao đã được

phân lập từ sợi nấm và bào tử chủ yếu là của G lucidum và các G aplanatum,

trong các axit là ganoderic C, D, E, F, H, I, J, Md, Me, Mf, N, OP, Q, R, ST, U,

V, W, X, Y , Z; axit ganoderenic A, B, C, D; axit ganolucidic A, B, C, E; axit

lucidenic A, B, C, D, E, F; ganoderiol A, B, C, D, E, F, G, H, I; ganoderol A, B,

13ganodermatriol, ganodermanontriol; hợp chất B8, B9, C5, C6; metyl ganoderat M,

N, O; metyl lucidenat H, I J, K, L, M, epoxyganoderiol A, B, C; ganoderal A và

B, axit ganoderma Ja, JB, P1, P2, R, T-N, T-O, T-Q, trong số các hợp chất khác [ 20-21]

Năm 1983, Toth và cộng sự phân lập từ quả thể thu được 6 lanostanoid là

(5) Ganoderic acid W (6) ) Ganoderic acid X

Năm 1997, Wang.F.S và cộng sự đã tách được một ganolacton mới là 7βhydroxy-3,11,15-trioxo-lanosta-8-en-24 20s lacton (7) và 3 chất đã biết, trong

-đó có ganodermatriol (8)

O

O OH

O

O

O

H O

OH OH

Me

CH OH2

CH2OH C

H3

O O

C

H3

CH3COOH

O

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3OH

OH

OH O

(14) Ganoderic γ (15) Ganoderic δ

C

H3

CH3COOH

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

OH

O O

(16) Ganoderic ε (17) Ganoderic ζ

C

H3

CH3COOH

OH

OH

O

O H

C

H3

CH3COOH

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

OH

O

O OH

(18) Ganoderic η (19) Ganoderic θ

Các hợp chất khác là axit lucidenic A (20) và metyl lucidenat F (21) phân

lập từ bào tử của G.lucidum bởi Tian-Shung Wu và các cộng sự (2001) [28]

H3

O

O O

(20) Lucidenic acid A (21) Metyl lucidenat F

Các axit 20(21)-dehydrolucidenic A (22), metyl 20(21)-dehydrolucidenat A

(23) và axit 20-hydroxilucidenic D2 (24), F (25), E2 (26), N (27), P (28) phân lập

từ bào tử nấm G.lucidum bởi Toshihiro Akihisa và các cộng sự (2005) [27]

O

OH O

Ba tritecpenoit loại lanostan với một nhóm andehit gọi là lucialdehit A (29),

B (30) và C (31) phân lập từ quả thể bởi Giang-Cao Jing và các cộng sự [29]

C

H3

CH3CHO

O

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

(29) Lucialdehit A (30) Lucialdehit B

C

H3

CH3CHO

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

(31) Lucialdehit C

Năm 2011, nhóm của H.Moreno phân lập được Lucidumol B (32), nhóm của

Lee phân lập được methyl 7β, 15α-isopropylidenedioxy-3,11,23-trioxo-5α

O OO

H3

O O

O

O

(36)

Từ quả thể của loài Hoàng chi (G Golossum), Peter Kleinwachter và cộng

sự phân lập sáu tritecpenoit mới, colosolacton B (37), C (38), D (39), E (40), F

H3 CH

3

O

O C

CH3

O

O O

(37) Colosolacton B (38) Colosolacton C

O

O H

O

CH3

O

O O

CH3

CH3H

CH3O

CH3O

O O

C H3

C H3

O H

C H3O

O

(41) Colosolacton F (42) Colosolacton G

Từ quả thể của G.applanatum, S.H.Lee và cộng sự (2006), đã tách được 8

chất, trong đó có hai chất là 7β

-hydroxy-3,11,15,23-tetraoxolanosta-8,20E(22)-dien-26-oic axit methyl este (43) và axit 7β,20,23ξ

20Năm 2008, Riham Salah El Dine và cộng sự tách được 4 lanostan triterpen

mới từ quả thể của loài nấm G.colossum ở Việt Nam là colossolactone V (45),

colossolactone VI (46), colossolactone VII (47), and colossolacton VIII (48)

H

O O

H

O O

H

OH

OCOCH3

(47) Colossolactone VII (48) Colossolactone VIII

Năm 2010, nhóm của C.F.Wang đã phân lập được 3 triterpenoit mới chứa 4 vòng không giống với lanostan triterpenoit, 8 lanostan triterpenoit mới trong đó

có: một pentanorlanostan là ganosineniol A (49), ganosinensic acid B (50), ganosineniol B (51), ganosinoside A (52), ganoderiol J (53), ganosinensine (54)

OH

OH O

OH O

(51) Ganosineniol B (52) Ganosinoside A

O O

OH OH

OH H

O

O H

Từ loài nấm G tsugae, Chun-Nan Lin và các cộng sự đã phân lập hai

lanostenoit mới, axit 3α-axetoxy-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic (55) và axit

3-oxo-5α-lanosta-8,24-dien-21-oic (56) [32]

CH3

CH3C

H3AcO

CH3

CH3C

H3AcO

Các sterol có nhiều nhất trong các loại nấm là ergosta-5,7,22-trien-3-β-ol

(ergosterol-58), mà đã được báo cáo ở nồng độ 0,3-0,4% trong G lucidum, và

ergosta-7,22-dien-3-β-ol (dihidroergosterol-59), thêm vào đó là những

ergosta-7-en-3-β-ol (60), ergosta-5,7,9(11),22-tetra-3-β-ol (61) và peroxide ergosteril (62)

O H

O O

(62) Peroxide ergosteril

Các ergosterol tìm thấy rất nhiều trong một số loài nấm ăn được và được chuyển thành vitamin D2 bởi các phản ứng quang hóa bằng cách sử dụng bức xạ tia cực tím, cũng là nguyên liệu để tổng hợp phân tử sinh học quan tâm như hoá chất nông nghiệp brassinoesterol, ecdyson và sterol oxy hóa cao [17]

Khi chiếu xạ với ánh sáng cực tím ergosterol tạo ra một preergocalciferol thông qua việc mở vòng, và sau đó thông qua một phản ứng nhiệt được chuyển thành vitamin D2 (ergocalciferol) Chỉ có 50% ergosterol được chuyển kể từ khi chúng xảy ra photoreactions thứ cấp gây ra bởi sự kích thích của trien, đó là những phản ứng ngược lại tạo vòng của lumisterol [6]

1.1.2.2.1 Nguồn gốc phát sinh của ergosterol

Các sterol là có nguồn gốc biogenetically của các axetyl (nguồn từ axetat)

thông qua mevalonat và squalene Các ergosterol là chất tiền thân trực tiếp của lanosterol, theo cách thức tương tự có nguồn gốc từ tritecpenoit Sterol tham gia vào các quá trình của sinh tổng hợp như metyl hóa của carbon 24, đề metyl cacbon 4 và 14, như khử hóa và hiđro hóa [18-19]

2 3

HO

Ergosterol HO

Hình 1.9 Sinh tổng hợp của ergosterol

1.1.2.3 Polysaccarit kháng u

Polysaccaride là nhóm chất tồn tại phổ biến trong nấm, chúng là những chất chủ yếu cấu tạo nên thành tế bào của nấm Từ quả thể, bào tử và sợi nấm, hoặc từ dịch nước trong môi trường nuôi cấy của các loài Ganoderma có khoảng hơn 100 loại gồm hơn 200 polysaccharite đã được phân lập [20] Qua kiểm tra hoạt tính sinh học của các hợp chất này thấy chúng có hoạt tính chống ung thư và kháng u rất mạnh [16]

Hoạt tính của polysaccharide được tách ra từ quả thể, sợi, dịch nuôi cấy của các loài Ganoderma chủ yếu đến từ các kiểu cấu trúc cơ bản của glucan là chuỗi

Hình 1.10 Hiển thị định hướng và vị trí của β-glucan liên kết khác nhau Cấu trúc cơ bản của β-1-3 D-glucopyranan gồm từ 1 đến 15 nhóm β-1-6 monoglucosyl trong mạch [Mizuno 1991]

O CH

OH O OH

2 1

* O

CH OH

OH O

3 3

3 6

m n

O OH

O

OH

O O

O OH

O

OH

O OH

O O

O

O OH

O O

OH O

OH

O

O OH

O

O

O

(63) β-D-glucan [(1-6)-D-glucozyl nhánh β - (1-3)-D-glucopyranozơ]

Không phải tất cả các β-D-glucan đều có hoạt tính kháng Tác dụng kháng u phụ thuộc vào cấu tạo, kích thước phân tử của các polysaccharid, hoạt tính của mỗi polysaccarit khác nhau ở mỗi gốc đường (như xylozơ, galactozơ, mannozơ axit gluconic…43), sự sắp xếp của các chuỗi phân tử và số lượng nhóm OH trên các chuỗi trong cấu trúc hóa học và sự hòa tan trong nước của chúng Các báo cáo gần đây cho thấy những polyglucan có trọng lượng từ 104-106 Dalton (500.000-

2000000 đvC), ít phân nhánh, có khả năng tan tốt trong nước đem lại hoạt tính kháng u tốt nhất

Khả năng kháng u còn có ở một số kiểu polisaccarit khác ở G.lucidum là heteropolysaccarit, glycoprotein (polysaccarit liên kết với protein, hoặc một nhóm polysaccarit đã biết là ganoderan A, B, C [Lindequist 1995] Ngoài ra polysaccarit tăng cường sản xuất và đời sống của tế bào lympho CD4 trợ giúp, mà bị phá hủy khi xâm nhập do virus và phối hợp trong việc giảm cường độ của các triệu chứng,

cả trong nhiễm virus chẳng hạn như những sản xuất bởi vi rút AIDS (HIV) [43]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Các loài nấm thuộc chi Linh chi được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền Trung Quốc, trong những năm gần đây được nghiên cứu tác dụng dược lý của chúng trên các bệnh nhân viêm gan, tăng đường huyết, viêm phế quản mãn tính, ung thư, tăng huyết áp, tăng cholesterol máu và bệnh bạch cầu đã thu được kết quả đầy hứa hẹn [35]

Các hợp chất hóa học với tính chất hoạt tính sinh học cao hơn là tritecpenoit và polysaccarit Các polysaccarit có trong hầu hết các loại nấm và

27cũng là thành phần chính của thành tế bào, tuy nhiên, các tritecpenoit đặc biệt tìm thấy trong nấm Linh chi và đã phân lập được chủ yếu là axit ganoderic, các axit

ganoderiol và axit lucidenic Được tìm thấy nhiều nhất là axit ganoderic [36]

Các hợp chất khác nhau cho thấy sự khác nhau về hoạt tính sinh học, ví dụ như: chống HIV-1 (ganoderiol F và ganodermanontriol), giảm cholesterol (axit ganoderic B và C) [37], kháng histamin (axit ganoderic C1 và C2), các hoạt chất chống HIV-1 proteas (lucidumol B và ganodermanontriol) [38], tác dụng gây độc

tế bào chống lại meth-A (sarcoma) (ganodermanondiol và lucidunol A và B) [39], ung thư phổi của Lewis (LLC) (lucidunoles A và B axit ganoderic θ) [40], T-47D (ung thư vú) (ganodermanondiol)41, còn được gọi là sự ức chế vi khuẩn cariogenic streptococcus mutans của glucosiltransfersa ( axit ganoderic S1 và C) [42]

1.1.3.1 Kháng khuẩn chất chuyển hóa

Theo đánh giá về hoạt động sinh học gần đây của khoảng 200 loài nấm, hơn 75% cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh [45] Hoạt động này không chỉ liên quan đến chất chuyển hóa phân tử nhỏ (như sterol, tritecpenoit, ) mà cả với những polysaccarit khối lượng lớn có trong thành tế bào

Việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ Basidiomycetes,

mà con người chia sẻ các nghiên cứu về mầm bệnh vi khuẩn như Escherichia coli (vi khuẩn đại tràng), Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn hay tụ cầu vàng) và

Pseudomonas areuginosa (trực khuẩn mủ xanh) do đó có kết quả cao từ khả năng

tự vệ của các loài nấm được sử dụng để chống lại vi sinh vật [46]

Ví dụ: hai hợp chất ganomycin A (64) và ganomycin B (65), phân lập từ

một loại nấm châu Âu G pfeifferi cho thấy ức chế sự tăng trưởng vừa phải chống lại sự sống của vi khuẩn gram dương và B subtilis (trực khuẩn vi khuẩn), S

aureus (tụ cầu vàng) và Micrococcus flavus Ngoài các loại nấm này đã thu được

trên ganodermadiol (66), lucidadiol (67), và axit applanoxidic (68) có hoạt tính

kháng khuẩn chống lại loại virut cúm A [47]

COOH

R O

O H

(64) R= OH (65) R = H

H3O H

H3O

C H3

C H3

C H3O

-O H

COOH

C H3

(69) 1.1.3.2 Chất chuyển hóa có đặc tính chống oxy hóa

29Oxy hóa có liên quan với tăng nguy cơ bệnh thoái hóa như bệnh tim mạch

và ung thư, rất nhiều bài báo đã được ghi nhận rộng rãi rằng các loài nấm (G

lucidum, G tsugae, G aplanatum) có nhiều lợi ích cho các động vật và ảnh

hưởng sức khỏe con người bảo vệ gan, chống ung thư và tim mạch [49] Vì vậy các hoạt tính chống oxy hóa của chất chiết xuất từ các loại nấm là tương quan với

sự hiện diện của triterpenoit polysaccarit-protein phức tạp, và polysaccarit [50]

1.2 Đối tượng nghiên cứu

Họ: Ganodermataceae Donk ( hoặc Polyporales)

Chi: Ganoderma (Fr.) Pat

Loài: Ganoderma australe

Tên tương tự: Ganoderma adspersum, Polyporus australis Fr ,

Polyporus adspersum S., Ganoderma europaeum Stey., Ganoderma tornatum,

Tên thường gọi : Cổ linh chi

Hình 1.12.1 Ganoderma australe non

1.2.2 Đặc điểm hình thái

1.2.2.1 Đặc điểm bên ngoài

Quả có dạng hình dấu ngoặc, không có cuống, thường gắn trực tiếp vào cây Kích thước chiều ngang từ 7-60cm, rộng 5-25 cm, dày 3-30 cm, bề mặt phía trên dày, cứng, lồi lõm có nốt, phân thành các vòng trần, có vỏ dai chắc Màu quả thể thường màu xám hoặc màu nâu Đối với những quả thể già thường có các vòng rõ ràng từ màu nâu xám chuyển sang màu nâu đen và các bào tử thường có màu đỏ nâu Viền quả thể phồng lên có màu kem hoặc hơi vàng

Hình 1.12.2 Ganoderma australe lâu năm

Phía bên dưới có các lỗ mịn màu trắng hoặc màu kem

Hình 1.12.3 Bề mặt dưới của G.australe

Nấm tươi nếu khi ta chạm tay vào phía dưới mũ nấm, sẽ chuyển màu hơi vàng, có 4-5 lỗ chân lông tròn trong trong 1mm, độ dài của ống từ 10-15 nm

Hình 1.12.4 Lớp chân lông phía dưới của G.australe

Các quả thể nấm lâu năm có các bào tầng nhưng không có hoặc có ít các vách ngăn giữa các bào tầng Các vách ngăn dày trong các quả thể một năm, độ dài ống tăng lên, có thớ dạng gỗ, cứng dai chắc, màu nâu đỏ đậm, có các vòng

đồng tâm, hơi có mùi

Thường mọc đơn, sống lâu năm, không ăn được Chúng thường ký sinh trên các cây gỗ, gây ra bệnh thối trắng, giết chết cây chủ, và có thể sống vài năm nữa trên gốc cây đã chết

1.2.2.2 Đặc điểm bên trong

- Bào tử thường có dạng hình elip (hình trứng), màu nâu đỏ, kích thước 8-13

x 5,5-9 µm, chủ yếu là khoảng 10 x 6.5 µm

- Đảm phồng, hình elip, trông ngắn, cụt, kích thước 22-30 x 7-12 µm, 4 tiểu

đỉnh Màu nâu vàng, các bào tử trong và bào tử ngoài được ngăn cách bởi các

+ Sợi bên kết màu nâu, thành dày phân nhánh, dày 2-3,5 µm

Đã có thời gian người ta thường sai lầm khi cho rằng hai loài nấm G.australe

và G.applanatum Vì rất khó có thể phân biệt được hai loài này nếu chỉ dựa vào một số đặc điểm về hình thái bên ngoài Tuy nhiên, ở lát cắt ngang của G.australe

cho thấy một vách ngăn dày màu đỏ nâu, không có trắng ở giữa

Hình 1.12.5 Lát cắt ngang của G.australe và G.applanatum

Bào tử G.australe màu đỏ nâu, trong khi bào tử G.applanatum màu nâu đất

Cả hai loại này đều được phân biệt bằng kích thước bào tử Bào tử của

G.applanatum kích cỡ hơn 8×6 µm, còn ở G.australe thì lớn hơn hẳn

1.2.2.3 Phân bố

G.australe phân bố phổ biến ở Tây Âu, châu Á và Bắc Phi Ở Việt Nam, loài

này mới chỉ được ghi nhận là phân bố ở vườn quốc gia Pù Mát-Nghệ An, dãy Trường Sơn thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế

1.2.3 Thành phần hóa học

Hiện nay số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học loài G.australe còn rất

ít Đây có thể là nghiên cứu đầu tiên về loài này ở Việt Nam

Năm 1984, Amolak C Jain và cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất từ loài

nấm này ở Ấn Độ gồm 3 sterol là ergosterol (58), ergosterol palmitat (70), ergosta -7,22-dien-3-one (71) và một lanostan triterpenoid là lanosta-7,9(11),24-

H3

CH3

H

H H

(71) ergosta -7,22-dien-3-one (72) lanosta-7,9(11),24-trien-3β,21-diol Khi nghiên cứu hàm lượng fatty axit từ quả thể, bào tử và sợi nấm của loài

G.australe, A T Martinez và cộng sự thấy rằng hàm lượng lipit vẫn chiếm 5-6%

trọng lượng khô, trong đó hàm lượng fatty axit chiếm 6-14% lipit toàn phần Thành phần chính của fatty axit là các axit chưa no chứa từ 18 nguyên tử Cacbon trở lên (chiếm 80%) gồm axit oleic, axit linoleic, axit palmitic…

34Năm 2000, nhóm của Gerber đã tách được 5 triterpenoid là applanoxidic

acids A (73), C (74), F (75),G (76), và H (77) cùng 3 sterol là 5α-ergost-7en-3β

-ol (78), 5α-ergost-7,22-dien-3β-ol (79), and

O

O

COOH OH

(73) Applanoxidic acid A (74) Applanoxidic acid C

(75) Applanoxidic acid F (76) Applanoxidic acid G

O H

H

(77)Applanoxidic acid H (78) 5α-ergost-7en-3β- ol