tach chiet beberin tu cay vang dang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Ket-noi.com chia se ĐỒNG QUANG HUY NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT BERBERIN TỪ VÀNG ĐẮNG BẰNG DUNG DỊCH KIỀM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỒNG QUANG HUY NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT BERBERIN TỪ VÀNG ĐẮNG BẰNG DUNG DỊCH KIỀM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn: TS.Nguyễn Văn Hân Người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ bảo tận tình năm tháng học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên hỗ trợ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng 08 năm 2014 Đồng Quang Huy MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Berberin clorid 1.1.1 Công thức hóa học tính chất 1.1.2 Nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin 1.1.3 Tác dụng dược lý ứng dụng 1.1.4 Một số chế phẩm chứa berberin 1.2 Cây vàng đắng 1.2.1 Đặc điểm thực vật vàng đắng 1.2.2 Phân bố sinh thái 10 1.2.3 Bộ phận dùng 10 1.2.4 Thành phần hóa học 11 1.2.5 Ứng dụng vàng đắng 12 1.3 Sản xuất berberin 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Xác định hàm lượng berberin dược liệu vàng đắng 18 2.2.2 Xác định độ tan Berberin dung môi chiết xuất 18 2.2.3 Xác định độ ổn định berberin dung môi chiết xuất 18 2.2.4 Xác định tốc độ chiết 18 2.2.5 Khảo sát nồng độ vôi 19 2.2.6 Xác định số lần chiết 19 2.2.7 Chiết xuất kg bột dược liệu vàng đắng 19 2.2.8 Tinh chế berberin 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp định lượng berberin 19 2.3.1.1 Nguyên tắc 19 2.3.1.2 Tiến hành 19 2.3.1.3 Tính kết 21 2.3.2 Phương pháp xác định độ tan berberin dung môi chiết xuất 21 2.3.2.1 Nguyên tắc 21 2.3.2.2 Tiến hành 21 2.3.3 Phương pháp xác định độ ổn định berberin dung môi chiết xuất 22 2.3.4 Phương pháp xác định tốc độ chiết 22 2.3.5 Phương pháp chiết xuất tinh chế berberin 23 2.3.6 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 23 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 24 3.1 Xác định hàm lượng berberin dược liệu vàng đắng 24 3.2 Xác định độ tan berberin dung môi chiết xuất 26 3.3 Xác định độ ổn định berberin dung môi chiết xuất 27 3.4 Xác định tốc độ chiết 28 3.5 Xác định nồng độ vôi thích hợp 29 3.5.1 Sơ đồ quy trình dự kiến 29 3.5.2 Mô tả quy trình 30 3.5.3 Khảo sát nồng độ vôi 31 3.6 Xác định số lần chiết 32 3.7 Chiết xuất kg bột dược liệu vàng đắng 36 3.8 Tinh chế berberin clorid 38 3.9 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 42 3.9.1 Kiểm nghiệm sản phẩm berberin clorid tinh chế 42 3.9.2 Dữ liệu phổ 43 CHƯƠNG BÀN LUẬN 46 4.1 Về giai đoạn chiết xuất 46 4.2 Về giai đoạn tinh chế 48 4.3 Về quy trình thao tác 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Thân, lá, hoa vàng đắng Hình 1.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất berberin dd acid sulfuric 0,4% 14 Hình 2.1 Lát cắt thân vàng đắng 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn berberin 25 Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC mẫu dược liệu 25 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn nồng độ berberin dung môi chiết theo thời gian 29 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình dự kiến chiết phân lập berberin clorid thô 30 Hình 3.6.1 Biểu đồ khối lượng berberin clorid thô chiết với số lần chiết khác 34 Hình 3.6.2 Hình ảnh sản phẩm berberin clorid thô 35 Hình 3.7.1 Sơ đồ quy trình chiết berberin hỗn dịch vôi 1% 37 Hình 3.7.2 Sắc ký đồ berberin clorid thô 38 Hình 3.8.1 Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid thô ethanol 50% 41 Hình 3.8.2 Sắc ký đồ berberin clorid tinh chế lần 41 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hàm lượng berberin(C20H18NO4) dược liệu 24 Bảng 3.2 Độ tan berberin clorid dung môi chiết xuất 26 Bảng 3.3 Độ ổn định berberin dung môi chiết xuất 27 Bảng 3.4 Nồng độ berberin dung môi chiết xuất theo thời gian 28 Bảng 3.5 Hiệu suất chiết berberin nước vôi 31 Bảng 3.6 Khối lượng berberin thô với số lần chiết khác hỗn dịch vôi 1% 32 Bảng 3.7 Khối lượng berberin thô với số lần chiết khác dung dịch natri bicarbonate 0,2% 33 Bảng 3.8 Khối lượng berberin thô với số lần chiết khác dung dịch acid sulfuric 0,4% 33 Bảng 3.9 Hiệu suất chất lượng sản phẩm khô với dung môi khác 35 Bảng 3.10 Kết chiết xuất berberin mẻ 1kg 36 Bảng 3.11 Hàm lượng berberin clorid tinh chế lần 39 Bảng 3.12 Hàm lượng berberin clorid tinh chế lần 40 Bảng 3.13 Tóm tắt kết kiểm nghiệm 42 Bảng 3.14 Các giải hấp thụ đặc trưng phổ hồng ngoại (IR) 43 Bảng 3.15 Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) và(13C-NMR) 44 Từ kết thu được, đề xuất phương pháp chiết xuất berberin từ vàng đắng nước vôi tinh chế ethanol 50%.   Phương pháp chiết xuất: phương pháp ngâm Kết tủa berberin natri clorid acid clohydric 45 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về giai đoạn chiết xuất Sử dụng phương pháp ngâm Phương pháp chiết xuất có nhiều ưu điểm: dễ thực hiện, thiết bị dụng cụ đơn giản Tuy nhiên hiệu suất chiết thấp, không chiết kiệt hoạt chất nguyên liệu Dung môi chiết dung dịch natri bicarbonat nước vôi rẻ tiền, sẵn có, hòa tan hoạt chất berberin, độc hại Berberin tan ổn định dung dịch kiềm trên, có 4% bị thay đổi khoảng thời gian tháng Qua thực nghiệm khảo sát chiết xuất cho thấy so với dung môi chiết dung dịch acid sulfuric loãng, berberin tan dung dịch kiềm tốt (trong điều kiện chiết xuất nhiệt độ, thể tích dung môi; chiết kiềm nhanh chóng đạt đến thời điểm cân bằng, hiệu suất chiết cao so với phương pháp chiết xuất acid sulfuric loãng Trong thí nghiệm xác định độ tan berberin, nguyên liệu tiến hành khảo sát berberin clorid Sự có mặt ion clo cấu trúc ảnh hưởng đến độ tan berberin dung dịch kiềm natri bicarbonat nước vôi [25] Để có kết tin cậy cần tiến hành thử độ tan berberin base dung dịch kiềm dung dịch acid sulfuric loãng Từ so sánh độ tan đánh giá tính ưu việt chiết dung dịch kiềm Mục đích thí nghiệm khảo sát tốc độ chiết tìm thời gian cân nồng độ berberin dịch chiết nồng độ berberin dược liệu Sau thời điểm cân bằng, nồng độ berberin dịch chiết không tăng thêm Thời điểm cân thời điểm hợp lý để rút dịch chiết Phương pháp nhanh đạt đến thời điểm cân tức có tốc độ chiết nhanh Khảo sát thời điểm cân phương pháp dịch chiết lần để so sánh tốc độ chiết 46 phương pháp (chiết dung dịch kiềm chiết acid sulfuric) Kết nghiên cứu cho thấy thời gian đạt đến cân phương pháp chiết dung dịch kiềm sau 12 giờ, thời gian đạt đến cân phương pháp chiết dung dịch acid sulfuric 24 Lựa chọn phương pháp chiết xuất dung dịch kiềm giúp tiết kiệm thời gian cách hiệu so với phương pháp chiết dung dịch acid sulfuric loãng Dịch chiết rút tạp chất thời gian ngâm ngắn hơn, dễ dàng thao tác bước xử lý rút dịch chiết, gạn, lọc tinh chế Hiệu suất chiết berberin từ vàng đắng dung dịch kiềm (dung dịch natri bicarbonat 0,2% hỗn dịch vôi 1%) tiến hành chiết lần đạt hiệu suất khoảng 77% Hiệu suất chiết dung dịch acid sulfuric 0,4% sau lần chiết đạt khoảng 82% Như để tiết kiệm dung môi, hóa chất, thời gian công sức lựa chọn chiết lần dung dịch kiềm, đem xử lý dịch chiết lần lần 2, dịch chiết lần làm dung môi lần cho mẻ sau Với dung môi chiết nước vôi, thu tủa thô berberin clorid có hàm lượng cao (khoảng 85%), hiệu suất chiết đạt khoảng 82% Chúng thay đổi nồng độ vôi khảo sát hiệu suất chiết, kết cho thấy hỗn dịch vôi 1% cho khối lượng tủa thô berberin clorid nhiều hàm lượng đạt 85%, hiệu suất chiết đạt khoảng 85% Như khoảng nồng độ khảo sát từ nước vôi bão hòa đến hỗn dịch vôi 1%, hỗn dịch vôi 1% cho hiệu suất chiết cao chưa phải nồng độ vôi tối ưu Cần tiến hành thêm thí nghiệm khảo sát nồng độ vôi Độ tan berberin hỗn dịch vôi 1% cao so với nước vôi Như lựa chọn hỗn dịch vôi 1% để chiết berberin từ vàng đắng với mẻ dược liệu kg Từ xem xét yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất với mẻ dược liệu lớn 47 4.2 Về giai đoạn tinh chế Berberin chiếm lượng lớn thân rễ vàng đắng khó kết tủa (chậm kết tinh), phân lập dịch chiết xử lý lẫn tạp Vì vậy, cần phải xử lý, loại tạp dịch chiết   Lựa chọn dung môi tinh chế yêu cầu phải đảm bảo khả kết tủa hoạt chất, mức độ độc hại tính kinh tế (giá cả, khả thu hồi tái sử dụng, thất thoát) Để berberin clorid kết tinh dung môi tinh chế cần phải giảm dần độ tan berberin (bằng cách thêm đối dung môi giảm nhiệt độ) tạo dung dịch bão hòa (bằng cách làm bay bớt dung môi tinh chế) Tẩy màu kết tinh lại để thu sản phẩm có độ tinh khiết cao Qua thực nghiệm với loại dung môi tinh chế (ethanol 96%, ethanol 50% nước cất) cho thấy ethanol 50% cho hiệu tách berberin tốt (91,98% sau tinh chế lần 98,77% sau tinh chế lần) Đáp ứng yêu cầu: loại nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, độc hại Khi tinh chế ethanol 50%, dịch lọc có độ nhớt lớn, đồng thời berberin clorid khó tan, tan phần ethanol 50%, lượng berberin bị mát dịch lọc làm giảm hiệu suất trình Do cần gộp dịch lọc, dịch rửa, cô thu hồi dung môi, để kết tinh thu hồi berberin clorid nhằm tăng hiệu suất trình Với dung môi tinh chế nước cất, lượng berberin clorid thu hồi từ dịch lọc không đáng kể 4.3 Về quy trình thao tác Với quy trình chiết xuất berberin từ vàng đắng dung dịch kiềm đề xuất (hình 3.8.), thao tác thực dễ dàng, thiết bị đơn giản, sử dụng nước vôi làm dung môi chiết ethanol 50% làm dung môi tinh chế dễ kiếm, rẻ tiền, độc hại Quy trình thử nghiệm với cỡ mẻ 1kg Đánh 48 giá yếu tố ảnh hưởng đến quy trình áp dụng chiết cỡ mẻ dược liệu lớn: thiết bị, máy móc, thao tác khuấy trộn, rút dịch chiết, gạn, lọc, ép bã dược liệu, ly tâm thu tủa thô… Ngoài ra, tiến hành chiết xuất, bước như: rút dịch chiết, lọc, rửa tủa thô trình thao tác với dung môi nước vôi dễ dàng tốn thời gian nhiều so với dung dịch acid sulfuric 0,4% dung dịch natri bicarbonat 0,2% với dung môi acid dung dịch natri bicarbonat dịch chiết nhớt lẫn nhiều tạp chất nên khó rút kiệt, tủa thô nhiều chất nhày nên khó rửa hơn, hàm lượng berberin sản phẩm thô hơn, hay bị tắc giấy lọc Khi sử dụng nước vôi, ion canxi nước vôi có khả làm đông vón nhiều tạp chất tan nước (gôm, chất nhầy, pectin…), ta dễ dàng gạn bỏ tạp chất nên dịch chiết có độ nhớt thấp, tạp dễ dàng thao tác bước So sánh với phương pháp chiết xuất dung dịch acid sulfuric 0,4%, dùng dung môi chiết nước vôi có ưu điểm sau: • Dung môi chiết phổ biến, rẻ tiền • Hòa tan tốt berberin, tiết kiệm dung môi, dịch chiết đậm đặc hoạt chất • Thời gian chiết xuất ngắn • Dụng cụ chiết không cần dùng vật liệu đặc biệt (chịu acid) • Các thao tác tiến hành dễ dàng (rút dịch chiết, gạn, lọc, rửa) Sản phẩm thô dễ tinh chế hơn, sản phẩm tinh khiết hơn, tốn hóa chất để tinh chế Sử dụng dung môi chiết nước vôi cho hiệu cao sử dụng dung môi dung dịch acid sulfuric 0,4% 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Đã khảo sát sử dụng dung dịch kiềm để chiết xuất berberin từ vàng đắng Các thông số chiết thích hợp là: • Dung môi: hỗn dịch vôi 1% • Tỉ lệ dung môi: dược liệu (8 : 1) • Phương pháp chiết: ngâm lạnh • Thời gian ngâm: 12 • Số lần chiết: lần (xử lý dịch chiết lần 1, 2; dịch chiết lần dùng làm dung môi chiết mẻ dược liệu tiếp theo) • Kết tủa berberin từ dịch chiết natri clorid (khoảng 5% so với lượng dịch chiết), acid clohydric 5% Với thông số chiết xuất trên, sản phẩm berberin thô đạt hiệu suất chiết 85% có độ tinh khiết 85,3% Đã khảo sát dung môi để tinh chế berberin ethanol 96%, ethanol 50% nước cất Kết cho thấy: ethanol 50% thích hợp (berberin clorid có độ tinh khiết cao, dễ thao tác) Sau tẩy màu kết tinh lại lần thu berberin clorid tinh khiết có hàm lượng 98,77% hiệu suất toàn quy trình 80,2% Sản phẩm berberin clorid tinh chế gửi kiểm nghiệm Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đạt yêu cầu chất lượng theo dược điển Việt Nam 50 Kiến nghị: Xác định độ tan sử dụng nguyên liệu berberin base Khảo sát xác định nồng độ vôi tối ưu Tiếp tục triển khai phương pháp chiết xuất berberin từ vàng đắng dung dịch kiềm quy mô lớn           51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Công nghiệp Dược (2009), Thực tập Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường đại học Dược Hà Nội, tr.46-49 Bộ môn Dược liệu (2007), Bài giảng dược liệu tập 2, Đại học Dược Hà Nội, tr.102-104 Bộ Y tế (1994), Dược điển Việt Nam II - tập 3, NXB Y học, tr.303-72-73 Võ Văn Chi (1999), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học Nguyễn Văn Đàn (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr.102-104 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam - Quyển I, NXB Trẻ, tr.333 Phan Quốc Kinh (1997), Nghiên cứu Alcaloid chiết xuất từ thuốc Việt Nam, ĐH Dược khoa Hà Nội, tr.10-42 Nguyễn Liêm (1980), “Chiết xuất Berberin áp lực nóng”, Tạp chí Dược học, số(3), tr.10 Nguyễn Liêm (1981), Góp phần nghiên cứu thực vật hóa học vàng đắng - Luận án Phó Tiến sĩ khoa học, Học viện Quân y, tr.116 10 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.195 11 Phạm Viết Trang, Nguyễn Liêm (2000), “Góp phần nghiên cứu thực vật hóa học vàng đắng”, Tạp chí dược liệu, tập 5, số (5), tr.131 12 Hồ Đắc Trinh, Viện dược liệu “ Chiết berberin clorid vàng đắng dung dịch acid sulfuric loãng” Tạp chí dược học, số 3,1983, BYT xuất tr.19 13 Trường ĐH Dược Hà Nội – Sản xuất berberin clorid từ vỏ Hoàng Bá Việt Nam – Thực tập kỹ thuật chiết xuất, tr.21 Tiếng anh 14 Bhutada P et al (2010), “Anticonvulsant activity of berberine, an isoquinoline alkaloid in mice”, Epilepsy & Behavior, 18, pp 207-210 15 Battu S K (2010), “Physicochemical Characterization of Berberine Chloride: A Perspective in the Development of a Solution Dosage Form for Oral Delivery”, AAPS PharmSciTech, 11(3), pp.1466-1475 16 Ben Liu a et al (2006), “Extraction of berberine from rhizome of Coptis chinensis Franch using supercritical fluid extraction”, journal of phamaceutical and biomedical analysis, 49, pp1056-1060 17 Eng Shi Ong et at (2003), “Pressurized hot water extraction of berberine, baicalein and glycyrrhizin in medicinal plants”, Centre for Analytical Science, 248, pp 28-31 18 Gábor Blaskó et al (1988), “Carbon-13 Nmr Assignments of Berberine and Sanguinarine”, Heterocycles, 27(4), pp 911-916 19 Kong Wei-Jia et al (2008), “Combination of simvastatin with berberin improves the lipid-lowering efficacy”, Metabolism Clinical and Experimental, 57, pp 1029-1037 20 Kulkarni S K (2008), “On the mechanism of antidepressant-like action of berberine chloride”, European Journal of Pharmacology, 589, pp.163172 21 Merck & Company Incorporated (2001), The Merk Index, 13th edition, pp.197,1252-1253 22 Patil J B et al (2010), “Berberine induces apoptosis in breast cancer cells (MCF-7) through mitochondrial-dependent pathway”, European Journal of Pharmacology, 645, pp.70-78 23 Pharmaceutical Press (1996), Martindale - The extra pharmacopoeia - 31th Edition, p.1678 24 Singh A et al (2010), “Berberin: Alkaloid with wide spectrum of pharmacological activities”, I Journal of Natural Products, 3, pp.64-75 25 University of the Sciences in Philadelphia (2006), The Science And Practice of Pharmacy, Office of the Librarian of Congress, USA 26 Yang-Cheng Lu et al (2006), “Solubility of Berberine Chloride in Various Solvents”, State Key Lab of Chemical Engineering, 51, pp 642-644 27 Zhou- Xi-Qiao et al (2008), “Neuroprotective effects of berberine on stroke modes in vitro and vivo”, Neuroscience Letters, 447, pp 31-36 28 Zong et al.(2000) “Pressurized liquid extraction of berberine and aristolochic acids in medicinal plants”, Journal of Chromatography, 313, pp 57-64 PHỤ LỤC Phiếu kiểm nghiệm sản phẩm berberin clorid tinh chế lần Dữ liệu phổ IR , 1H-NMR 13 C-NMR berberin clorid Sắc ký đồ HPLC berberin clorid thực phòng kiểm nghiệm nguyên liệu- Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương PL1 Phiếu kiểm nghiệm sản phẩm berberin clorid tinh chế lần PL2 Dữ liệu phổ IR berberin clorid PL3 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR berberin clorid PL4 Sắc ký đồ HPLC berberin clorid thực phòng kiểm nghiệm nguyên liệu- Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương