Thẩm định thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi trong vắc xin sởi bằng phương pháp RT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LÊ THỊ HẢI YẾN THẨM ĐỊNH THỬ NGHIỆM NHẬN DẠNG VI RÚT SỞI TRONG VẮC XIN SỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP RT-PCR Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM PGS.TS NGUYỄN THỊ HỒNG LINH HÀ NỘI, NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Thẩm định thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi vắc xin sởi phương pháp RT-PCR” công trình nghiên cứu cá nhân thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Linh PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Học viên Lê Thị Hải Yến i LỜI CẢM ƠN Trong tr nh nghi n nhi u s gi p đ qu u v ho n th nh uận v n n áu th t i đ nhận đư giáo đ ng nghiệp ng ạn v gi đ nh Trư h t t i in đư t ng nh tr ng v i t ơn s u sắ t i PGS.TS, Nguyễn Thị Hồng Linh, phó viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y t PGS.TS, Nguyễn Thị Xuân Sâm giảng viên trường Bách Khoa Hà Nội , người cô kính m n đ tr t nh tru n đạt i n th u v ho n th nh uận v n T i in h n th nh ảm ơn qu n Giám hiệu h ng o tạo S u đại h giáo ộ m n Sinh h c phân tử - Trường đại h tạo u iện thuận n tận inh nghiệm đ ng thời u n động vi n v tạo u kiện ho t i tr nh nghi n th ti p hư ng i ho t i suốt tr nh h h ho H tập ho t i v ội đ i n áu để ho n th nh uận v n n ng thời t i ng in đư Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y t khoa hóa lý, phòng Khoa h gửi ời ảm ơn t i nh hị m ho iểm định vắc xin vi rút , v đ o tạo, phòng Quản lý chất ng c định đ tạo u iện gi p đ t i tr nh v nn nh đạo Viện Kiểm định iện iểm m việ để t i ho n th nh uận đ ng hạn uối ng h ng phải t i in thương t i gi đ nh người đ ả tr nh h u n nt i nh t nh ảm th n ng hộ động vi n t i tập v ho n th nh uận v n n ột n nữ in h n th nh ảm ơn tất ả s gi p đ qu Lê Thị Hải Yến ii áu đ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích xác (Association of official Analytical Chemists) ASTM Hiệp hội phép thử Mỹ (Americal society for testing of material) ARN Acid ribonucleic ATP Acid adenosin triphosphat bp Base pair (cặp base nitơ) CCID50 Cell culture infective dose 50% dNTP Deoxyribonucleotide DNA Acid Deoxyribo Nucleic DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide ELISA Thử nghiệm miễn dịch gắn men (Enzyme-linked Immunosorbent assay) EU Dược điển châu âu IU Đơn vị quốc tế (Internationnal Unit ISO Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KĐQG Kiểm định quốc gia LOD Giới hạn phát (Limit of dete) GMP Thực hành sản xuất tốt (Europe volume) (Good Manufacturing Practice) HVHQ: Hiển vi huỳnh quang mRNA Messeger RNA (ARN thông tin) MC Mẫu chuẩn MCQT Mẫu chuẩn quốc tế NICVB Viện kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế (National Institute for Control of Vaccine and Biologicals) iii NIBSC Viện sinh phẩm chuẩn quốc gia anh (National Institute for Biologycal Standards and Control) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RT-PCR Reverse transcriptase PCR (kỹ thuậtPCR ngược) TAE Tris acetic acid- EDTA TE Tris EDTA TRS Hồ sơ kỹ thuật ((Technical Report Series) TCYTTG Tổ chức y tế giới (World Health Organization) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam USP US Pharmacopeia SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) SOP Qui trình chuẩn ((Standard Operating Procedure) iv DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1: Các thông số cần xác định thẩm định qui trình Bảng 2: Bảng thống kê giai đoạn sản xuất vắc xin Mỹ 12 Bảng 3:Bảng tiêu chuẩn xuất xưởng, đăng ký vắc xin sởi 19 Bảng 4: Các vắc xin ngừa bệnh sởi lưu hành Việt Nam 23 Bảng 5: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR vi rút sởi 31 Bảng 6: Thành phần phản ứng RT-PCT (Invitrogen) 40 Bảng 7: Thành phần phản ứng RT-PCT (Qiagen) 40 Bảng : Qui trình nhiệt phản ứng RT-PCR nhận dạng vi rút sởi 41 Bảng 9: Kết nghiên cứu độ mạnh 44 Bảng 10: Kết nghiên cứu giới hạn phát 45 Bảng 11: Kết khảo sát tính đặc hiệu 47 v DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Hình minh họa độ độ xác Hình 1.2 :Hình ảnh vi rút sởi 10 Hình 1.3: Hình ảnh người mắc bệnh sởi 11 Hình 1.4: Hình ảnh phiến dùng kiểm tra vi rút sởi phương pháp trung hòa vi lượng Hình 1.5: Hình ảnh tế bào Vero dùng nhận dạng vi rút sởi phương pháp trung hòa vi lượng 25 25 Hình1.6: Hình ảnh vi rút sởi làm hủy hoại tế bào Vero 26 Hình1.7: Hình ảnh minh hoạ phát vi rút kính huỳnh quang 29 Hình 1.8: Hình minh họa xác định kháng nguyên phương pháp Elisa 30 Hình 1.9 Hình minh họa xác định kháng nguyên phươn pháp DNA probe 30 Hình 1.10 Hình minh họa phản ứng PCR 31 Hình 2.1 Hình ảnh thực phản ứng RT-PCR 41 Hình 3.1 Hình đánh giá độ mạnh thử nghiệm 43 Hình 3.2 Hình đánh giá giới hạn phát thử nghiệm 45 Hình 3.3 Hình đánh giá độ đặc hiệu thử nghiệm 46 Hình 4.1 Hình ảnh mồi xuôi ngân hàng gen 48 Hình 4.2 Hình ảnh mồi ngược ngân hàng gen 49 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số khái niệm thẩm định phƣơng pháp 1.1.1Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình 1.1.2Yêu cầu chung 1.1.3Các tiêu thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định 1.1.3.1 Độ (Accuracy) 1.1.3.2 Độ xác (Precision) 1.1.3.3 Độ tuyến tính (Linearity): 1.1.3.4 Vùng tuyến tính (Range): 1.1.3.5 Độ đặc hiệu (Specificity): 1.1.3.6 Độ mạnh (Ruggedness): 1.1.3.7 Giới hạn phát (LOD - Limit of Detection): 1.1.3.8 Giới hạn định lượng (LOQ - Limit of Quantitation): 1.2.Vi rút sởi vắc xin sởi 1.2.1 Vi rút sởi, bệnh sởi 1.2.1.1 Lịch sử phát vi rút sởi 1.2.1.2 Hình thái đặc tính sinh học 1.2.2 Vắc xin Sởi 12 1.2.2.1 Lịch sử vắc xin Sởi 12 1.2.2.2 Các giai đoạn phát triển vắc xin sởi 12 1.2.2.3.Qui trình sản xuất vắc xin sởi 13 vii 1.3 Kiểm định chất lƣợng vắc xin sởi 18 1.3.1 Yêu cầu chung 18 1.3.2 Tiêu chuẩn đăng ký xuất xưởng vắc xin sởi sống giảm độc lực 19 1.3.3Các vắc xin phòng ngừa bệnh sởi lưu hành Việt Nam 23 1.3.4 Các phương pháp kiểm tra thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi vắc xin sởi [12] [38] 24 2.3.4 Các Phương pháp miễn dịch học 24 2.3.4.1 Phương pháp trung hòa vi lượng 24 2.3.4.2 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 27 1.3.4.3 Phương pháp Elisa 29 1.3.4.4 Phương pháp sinh học phân tử (RT-PCR ) 30 Chƣơng : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 32 2.2 Nguyên vật liệu 32 2.2.1 Mẫu chuẩn 32 2.2.2 Mẫu thử nghiệm 32 2.2.3 Hóa chất: 33 2.2.4 Thiết bị, dụng cụ 33 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Thiết kế thử nghiệm cách xác định độ mạnh, độ đặc hiệu giới hạn phát 34 2.3.1.1 Xác định độ mạnh 34 2.3.1.2 Xác định giới hạn phát 36 2.3.1.3 Xác định độ đặc hiệu 37 2.3.2 Các bước tiến hành cho lần thử nghiệm 38 2.3.2.3 Điện di đánh giá kết 41 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43 3.1 Độ mạnh 43 viii 3.2 Giới hạn phát 45 3.3 Độ đặc hiệu 46 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 48 4.1 Đánh giá mồi sử dụng 48 4.2 Độ mạnh 51 4.3 Giới hạn phát 52 4.4 Độ đặc hiệu quy trình 52 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đình Bảng cộng (2003), "Vắc xin ch phẩm miễn dịch ph ng v u trị" Nhà xuất Y học, tr.193 - 194 Hoàng Thanh Dương (2009), "Xác nhận giá trị sử dụng c phương pháp" Văn phòng Công nhận chất lượng, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng Bộ Khoa học Công nghệ, "Hư ng d n đánh giá độ h ng đảm bảo đo phân tích hóa h định ng", (AGL18) Văn phòng Công nhận chất lượng (lần ban hành 1.04), Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng Bộ Khoa học Công nghệ (1996) " o ường h c thuật ngữ v ản", TCVN 6165, mục 2.4; 2.5 Bộ Y tế (2009), "Dư điển Việt Nam IV" Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 664 Đặng Đức Hậu (2008) “Xác xuất thống kê” nhà xuất giáo dục, y tế, tr 8089, 141-143 Đoàn Huy Hậu (2009)” ánh giá t nh n to n v t nh sinh miễn dịch c a vắc xin sởi polyvac sản xuất từ bán thành phẩm c a viện Kitasato Nhật Bản (giai đoạn 1,2 3)”, y tế tr 19,20 Lê Văn Hiệp (2006) “Vắc xin học vấn đề bản” nhà xuất y học, tr 289 Học viện quân y,(1992) “Vi sinh vật h c”, nhà xuất giáo dục đào tạo chuyên nghiệp, Hà nội tr 242-243 10 Học viện quân y, (2007) “Dịch tễ h c”, nhà xuất Quân đội nhân dân tr 8793 11 Học viện quân y,(1999) “Bệnh h c truy n nhiễm”, nhà xuất y học, Hà hội tr 171-174 12 Lê Quang Hòa,(2012) giảng chuẩn đoán mức độ sinh học phân tử 55 13 Viện Kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế (2006), "Sổ tay xuất ưởng" Tài liệu lưu hành nội bộ, tr.51 - 57 14 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia “Thẩm định phương pháp phân tích hóa h c vi sinh vật”, nhà xuất khoa học kỹ thuật 15 Phạm Hoàng Phiệt Đỗ Đại Hải (1999), "Miễn dịch h c" Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh, tr.27 - 39 16 Khuất Hữu Thanh (2006)” Kỹ thuật gen nguyên lý ng dụng”, nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 162-163 17 Lê Anh Thư (2010), "Hư ng d n thẩm định thử nghiệm" Tài liệu lưu hành nội Viện Kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế 18 Lê Thị Hải Yến (2010), "Nhận dạng vi rút sởi vắc xin sởi phương pháp RT-PCR" Tài liệu lưu hành nội Viện Kiểm định quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế 19 Lê Thị Hải Yến (2012), Đề tài sở “Thẩm định nhận dạng vi rút sởi phương pháp trung h vi ng” Tiếng Anh 20 CDC, “Vaccines and Immunization” Chapter 7, pp: 63 21 EU, (2002), “Measles vaccine”, volum2, pp 2196 22 Griffin D.E (2001),”Measles virus” Virology, chappter 37 volum 1, pp.1041 1441 23 Handout of References for measles vaccine, (1999) third courtry training program on quality assurance of live attenuated polio and measles vaccine Pp 5-17 24 ICH Q2A (1994), "Guideline for Validation of Analytical Methods Definitions and Terminology" European Agency for the Evaluation of Medicinal products 25 ICH Q2B (1996), "Guideline for Validation of Analytical Procedure Methodology" European Agency for the Evaluation of Medicinal products 56 26 Kataoka Tetsuro (1996), "Quality assurance of vaccines" Vaccine handbook Maruzen Tokyo, pp.15 - 21, 66 - 68 27 Lonneke Levels (2010), "Method validation, part one" Nederlands Vaccin Institute (NVI) 28 Martin E.W (2001), “The fourth disease, 1900-2000”, The Lancet, volume 357, pp 299-301 29 Maruzen (1996) “Vaccine Handbook” first edition, pp 114-126 30 National Institute of Infectious Diseases, Japan (2006)”Minimum requiments for i ogi pro u t” pp180-184 31 Teeranart Jivapaisarnpong (2006), "Validation of bioassay" Training course on quality control of vaccines used in EPI, Ha Noi 32 Plotkin – Orenstein, (2004) “Vaccine” fourth edition, pp 389 33 USP (2013)”Validation and Verification of Analytical procedures” Training course, Hà nội pp 3-7 34 WHO/IVB/07.01, (2007), “Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection ”, pp 41-53 35 WHO (1994), "Requirements for measles, mump, rubella vaccines and combined vaccine", Technical Report Series No.848 36 WHO, (2000), “Supplementary information on vaccine safety”, departmnet of vaccines and biologys, pp55 37 WHO (1992), "Good manufacturing practices for biological products WHO expert committee on biological standardization" Technical Report Series No.822, forty - second Report 38 WHO (1997), "Manual of laboratory methods " For testing of vaccines used in the WHO Expanded programe on Immunization, pp 72-86 39 WHO (2001), "Part 2: Validation", A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 85 40 WHO (2004), "Part 2: Validation", A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 87 57 Bài báo 41 Armando Zuniga, Zili Wang, Mattias Lini Wang, Mattias Liniger, Lars Hangartner, Michael Caballero, Jovan Pavlovic, Peter Wild, Jean Francois Viret, Reinhard Glueck, Martin A Billeter, Hussein Y.Naim, “Attenuated measles virus as a vaccine vector” ELSERVIER 42 Diane Waku- Kouomou, Amal Alla, Bari Blanquier, Damien Jeante, Hayat Caidi, Ahmed Rguig, Francoi Feymuth, and Fabian T Wild “Gnnotiping Meales Virus by Real-Time Amplification Refractorry Mutation System PCR Represents a Rapid Approach for Measles Outbreak Investigation ” Journal of clinical microbiology, Feb, 2006, p 478-494 43 H.S.El Mubararak, R.L De Swart, A.D.M.E Osterhaus, M.Schutten “Development of a semi-quantitative real-time RT-PCR for the dection of measles virus ” Journal of Clininical Virology 44 J.A.C Schalk, C.G.J.C.A de Vries, P.M.J.M Jongen “Potency estimation of measles, mump and rubella trivalent vaccine with quantitative PCR infectivity assay” Biologicals Trang web 45 http://measles.emedtv.com/measles/history-of-measles.html 46 http://www.cdc.gov/measles/about/overview.html 47 http://www.historyofvaccines.org/content/timelines/measles 58 PHỤ LỤC SOP NHẬN VI DẠNG VI RÚT SỞI MỤC ĐÍCH SOP mô tả quy trình kiểm tra có mặt vi rút Sởi vắc xin Sởi PHẠM VI ÁP DỤNG Áp dụng cho khoa Kiểm định vắc xin Vi rút – Viện Kiểm định Quốc Gia Sinh Phẩm Y tế thực thử nghiệm kiểm tra nhận dạng kháng nguyên sởi vắc xin Sởi TRÁCH NHIỆM - Nhân viên khoa KĐVXVR phân công có trách nhiệm thực thử nghiểm tuân thủ theo SOP - Trưởng khoa người có trách nhiệm giám sát tuân thủ nhân viên khoa theo SOP THUẬT NGỮ VÀ ĐỊNH NGHĨA - QM: Quality Management Dept.(Khoa Quản lý chất lượng) - SOP: Standard Operating Procedure (Quy trình thực hành chuẩn) - PCR: Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) - RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chép ngược) - TAE: Tris – acetate - ARN: Axit ribonucleic - EtBr: Ethidium bromide - Dye: Loading dye - BP: base pair NỘI DUNG 5.1 Vật liệu: - Mẫu vắc xin Sởi thử nghiệm - Nước hồi chỉnh vắc xin - Vắc xin Sởi mẫu chuẩn 5.2 Hóa chất: - Bộ kít tách chiết ARN: QIAp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) - Bộ kit chạy RT-PCR gồm: dNTP, Enzym mã ngược, nước, mồi xuôi, mồi ngược Sởi (Invitrogen, QIAGEN) - Marker chuẩn (Invitrogen) - Agarose (Ultrapure- Spain) - Dung dịch đệm UltraPureTm 10X TAE buffer (Invitrogen) - Thuốc nhuộm Ethidium bromide - Ethanol (96-100%) cất -200C - Bromonophenol blue 1% - Glycerol 100% - Nước cất vô trùng - Nước khử ion dùng cho phản ứng RT-PCR 5.3 Trang thiết bị: - Máy lắc Voltex MS1 Minishaker (VT-03-VR) - Máy li tâm lạnh Marathon 21000R (CF-02-VR) - Lò vi sóng (MO-02-VR) - Máy PCR (Eppendorf , realphlex - HL) - Bể điện di (Maxfill- HL) - Máy soi gen UUP Biodoc-ItTM Imaging System Benchtop UVTM Transilluminator (HL) - Pipetman đơn loại 10µl, 20µl, 50 µl, 100-200µl, 1000 µl, 5000 µl - Đầu côn loại 10µl, 20µl, 50 µl, 100-200µl, 1000 µl (vô trùng) - Týp Eppendof 1,5ml, 200µl (vô trùng) - Týp Eppendof không nắp 2ml (vô trùng) - Cốc thủy tinh (Trung Quốc) - Bút dạ, panh, băng dán, găng tay vô trùng, kéo, xilanh (Việt Nam) 5.4 Qui trình thực 5.4.1 Thủ tục bảo hộ Mặc quần áo blu, đeo găng tay trang thực thử nghiệm 5.4.2 Chuẩn bị dung dịch pha loãng AW1, AW2, AVL Pha AW1 44ml = 19ml AW1 gốc + 25ml Ethanol (giữ 2-80C) Pha AW1 44ml = 19ml AW1 gốc + 25ml Ethanol (giữ 2-80C) Đệm AVL: Hoàn nguyên chất mang ARN đệm AVL (giữ 2-80C, ổn định tháng , không làm tan băng lần 800C) 5.4.3 Tách vắc xin 5.4.3.1 Nguyên lý: Phá vỡ màng tế bào, loại bỏ chất tạp nhiễm protein, màng tế bào, muối… thu sản phẩm 5.4.3.2 Qui trình: c 1: Hút 560µl đệm AVL có chứa chất mang ARN vào týp eppendof có nắp 1,5ml (týp 1) c 2: Thêm 140µl mẫu cần tách vào týp 1, trộn máy Voltex khoảng 15 giây để nhiệt độ phòng (15-250C) 10 phút c 3: Chuẩn bị týp 2ml không nắp (3 cái/ mẫu) vào cột hấp phụ RNA (cột QIA) c 4: Thêm 560µl Ethanol vào týp 1, trộn 15 giây c 5: Lấy 630µl hỗn dịch bước cho vào týp có chứa cột hấp thụ RNA , ly tâm 8000 vòng/phút phút 30 giây, 40C c 6: Loại bỏ dung dịch phía dưới, nhấc cột QIA sang týp lặp lại bước c 7: Thêm 500µl dung dịch AW1 lên cột QIA, ly tâm 8000 vòng/phút phút 30 giây, 40C c 8: Loại bỏ dung dịch phía dưới, nhấc cột QIA sang týp 2ml khác thêm 500µl dung dịch AW2, ly tâm 13000 vòng/ phút phút 30 giây, 4oC c 9: Loại bỏ dung dịch phía nhấc cột QIA sang túp 1,5ml có nắp, nhỏ 60 µl AVE lên cột QIA (để RNA) ủ phút nhiệt độ phòng cho vào ly tâm 8000 vòng / phút phút 30 giây, 40C c 10: Loại bỏ cột QIA, giữ phần dị ch có chứa RNA cần thu, bảo quản -20oC Lưu ý: trình tách RNA cần đeo găng tay để tránh tạp nhiễm 5.4.4 Chạy phản ứng RT-PCR 5.4.4.1 Nguyên lý: RT-PCR dựa nguyên tắc kết hợp trình phiên mã ngược PCR 5.4.4.2 Qui trình th c Trình tự cặp mồi sử dụng: Forward primer: 5‟-GCT ATG CCA TGG GAG TAG GAG TGG-3‟ Reverse primer: 5‟-CCT CGG CCT CTC GCA CCT AGT-3‟ c 1: Thành phần phản ứng 2X Reaction Mix 25µl Nước 17µl Enzyme mã ngược 1µl Mồi xuôi 1µl Mồi ngược 1µl Khuôn RNA 5µl (Đối với kít hãng Invitro) 5X onestep 10µl Nước 23µl Enzyme mã ngược 2µl Mồi xuôi 1,5µl Mồi ngược 1,5µl Khuôn RNA 10µl dNTP µl (Đối với kít hãng QIAGEN) Lưu ý: Đối với chứng dương dùng RNA vắc xin chuẩn Đối với chứng âm dùng RNA nước c 2: Ly tâm để đảm bảo týp phản ứng trộn c 3: Đặt vào máy PCR đặt chu trình nhiệt sau: Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Chu trình (chu kỳ) 50 30 95 15 (*) 94 57 72 72 10 α 40 (*) : ý lưu ý vào khuyến cáo kít sử dụng Quá trình RT-PCR kết thúc mang điện di 5.4.5 Điện di 5.4.5.1 Nguyên lý: Điện di chuyển động phân tử tích điện tác dụng điện trường Điện di gel Agarose phương pháp sử dụng giá thể gel agarose với nồng độ khác để phân tách phân tử có kích thước, trọng lượng khác 5.4.5.2 Qui trình th c hiện: c 1: Pha Dye: Bromor phenol 1% + glycerol 100% + Nước c 2: Đổ gel 1,5% ; 1,5gam Agarose + 100ml TEA, đun nóng để thạch tan c 3: Để gel nguội khoảng 50-600C, vệ sinh bể đổ gel lược, đặt cân bàn điện di c 4: Tiến hành đổ gel cho ngập lược khoảng 2mm, đợi gel đông sau 30 phút rút lược Bản gel tốt gel phải đồng nhất, lỗ giếng vuông vắn, bọt c 5: Cho giá chứa gel vào bể điện di, đổ ngập dung dịch đệm TAE 1X c 6: Tiến hành tra mẫu, mẫu lấy 10µl + dye, thay đầu côn cho mẫu để tránh tạp nhiễm c 7: Tra maker vừa đủ theo lượng pha c 8: Cài chương trình điện di: 80V, thời gian 90 phút Bật máy điện di, kiểm soát xem chiều cắm điện cực c 9: Pha dung dịch nhuộm gel 5µl Ethidium Bromide + 100-200 ml nước c 10: Lấy gel bể điện di ngâm dung dịch nhuộm 10 phút c 11: Tiến hành soi gen máy soi chụp ảnh, lưu lại 5.4.6 Tiêu chuẩn đánh giá : Sản phẩm PCR đặc hiệu Sởi có kích thước 594bp Chứng dương: cho kết dương tính với vi rút Sởi Chứng âm: cho kết âm tính với vi rút Sởi Thử nghiệm giá trị chứng dương có kết âm tính chứng âm có kết dương tính HỒ SƠ - Ghi chép toàn trình thực vào biểu mẫu theo yêu cầu (xem phần phụ lục) - Gửi kết tới trưởng khoa - Trưởng khoa thẩm định, ký xác nhận gửi kết tới khoa QM - Báo cáo phân tích xu hướng hàng năm phải gửi cho khoa QM lưu Khoa Kiểm định - Trong trình thực xảy cố bất thường nào, phải ghi chép vào biểu mẫu QM01-05-F1: Báo cáo cố chuyển tới trưởng khoa xem xét, giải gửi phó viện trưởng phụ trách QC sau chuyển khoa QM TÀI LIỆU VIỆN DẪN - Hướng dẫn sử dụng kit tách RNA - Hướng dẫn sử dụng kít dùng cho phản ứng RT-PCR - Hướng dẫn báo cáo cố: QM 01-05 - SOP: Hướng dẫn sử dụng máy lắc Voltex (số VR-01 ) - SOP: Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm (số VR-01-01) PHỤ LỤC - Phiếu báo cáo cố: KĐQG 01-05-F1 - Phiếu chuẩn bị dụng cụ DCVR-01-01 - Biểu mẫu VR-05-06-F1 PHỤ LỤC BIỂU MẪU NHẬN DẠNG VI RÚT SỞI TRONG VẮC XIN SỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP RT-PCR Mã NICVB : ………… Mã số TN : ……… Tên thương mại : …………………… …… Lô vắc xin : ……………… Hạn sử dụng: Lô nước pha tiêm : Hạn sử dụng: Nơi sản xuất : …………………………… Ngày nhận mẫu : …….…………… Số lượng mẫu TN:……… Lần thử nghiệm : Phiếu chuẩn bị dụng cụ: Ngày kiểm tra : Ngày đọc kết quả: Người thực : 1.………………… QUI TRÌNH THỰC HIỆN Tách vắc xin thu ARN Thời gian thực Mẫu - VX mẫu thử ( .) μl - VX mẫu chuẩn ( ) μl Tiến hành VX mẫu chuẩn VX mẫu thử   (Sử dụng kit QIAamp® Viral RNA Qiagen) B1 560μl AVL+ 140μl mẫu= Dung dịch A B2 Ủ nhiệt độ phòng (10 „) B3.Thêm 560μl cồn tuyệt đối = Dung dịch B B4 Lấy 630 μl dung dịch B ly tâm 8000v/phút (1‟30‟‟) Từ đến  Từ đến Từ .đến  Từ đến  B5 Giữ phần cột, loại bỏ nước nổi, thêm 630  μl dung dịch B B6 Ly tâm 8000 vòng/ phút (1‟30‟‟) Từ đến  B7 Giữ phần cột, loại bỏ nước nổi, thêm 500μl Từ đến  AW1 B8 Ly tâm 8000 vòng/ phút (1‟30‟‟) Từ đến  B9 Giữ phần cột, loại bỏ nước nổi, thêm 500μl Từ đến  AW2 B10 Ly tâm 13000 vòng/ phút (1‟30‟‟) Từ đến  B11 Giữ phần cột loại bỏ nước nổi, thêm 60μl Từ đến  AVE B12 Ủ nhiệt độ phòng (2‟) Từ đến Từ .đến B13 Ly tâm 8000 vòng/ phút (1‟30‟‟) Từ đến Từ đến  B14 Bảo quản mẫu nhiệt độ - 200C  Phản ứng RT-PCR Thời gian thực  Trình tự cặp mồi: 5‟-AGTAGTGTCGATGATCTCAT-3‟ 5‟-GCTCAAGCCTTGATCATTGA-3‟ Theo Kít: VX mẫu chuẩn VX mẫu thử             Trộn phản ứng:     Chu trình nhiệt 500C: 30 phút – chu kỳ 950C: … phút – chu kỳ Từ đến Từ đến 940C: phút – 40 chu kỳ 570C: phút – 40 chu kỳ 720C: phút – 40 chu kỳ 720C: 10 phút – chu kỳ 40C: ∞ Điện di Thời gian thực B1 Cân 1,5g Agarose + 100ml TAE 1X  B2 Đung nóng 1-2 „  B3 Để gel nguội đến 50-600C, vệ sinh khay đổ  gel lược B4 Đổ gel ngập lược khoảng 2mm  B4 Sau 30 phút rút lược  B5 Cho gel vào bể điện di, đổ ngập đệm TAE  1X B6 Tiến hành tra mẫu  VX chuẩn VX thử   Tra 10 µl giếng Dòng điện: 80V, thời gian 80-90 phút Kết Mẫu Chứng Âm Từ đến Định tính Từ đến Kích thước (bp) Chứng dương (VX mẫu chuẩn) Vắc xin loạt: Nhận xét thử nghiệm: - Có giá trị  - Không có giá trị  Kết luận: Hà Nội ng tháng n m 20 ... lượng vắc xin sởi vi c nhận dạng vi rút sởi Để thực tốt vi c xác định vi rút sởi cần có qui trình đánh giá có độ tin cậy cao Hiện nay, khu vực giới sử dụng phổ biến nhiều qui trình nhận dạng vi rút. .. trình kiểm định vắc xin sởi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Thẩm định qui trình nhận dạng vi rút sởi vắc xin sởi phương pháp RTPCR" với mục sau: 1- Xác định độ mạnh qui trình 2- Xác định độ đặc... 23 1.3.4 Các phương pháp kiểm tra thử nghiệm nhận dạng vi rút sởi vắc xin sởi [12] [38] 24 2.3.4 Các Phương pháp miễn dịch học 24 2.3.4.1 Phương pháp trung hòa vi lượng