BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO KIM TUYẾN SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH ENZYM THỦY PHÂN XYLAN BỀN NHIỆT VÀ HOẠT ĐỘNG Ở MÔI TRƢỜNG AXIT TỪ NẤM MỐC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Tô Kim Anh Hà Nội – Năm 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO KIM TUYẾN SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH ENZYM THỦY PHÂN XYLAN BỀN NHIỆT VÀ HOẠT ĐỘNG Ở MÔI TRƢỜNG AXIT TỪ NẤM MỐC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Tô Kim Anh Hà Nội – Năm 2016 Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm MỤC LỤC MỤC LỤC i LỜI CẢM ƠN v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xylan 1.2 Xylanase 1.2.1 Phân loại xylanase 1.2.2 Cấu trúc chế xúc tác xylanase 1.2.3 Nguồn xylanase từ vi sinh vật 1.3 Nấm mốc chịu nhiệt 1.3.1 Đặc tính sinh lý 1.3.2 Xylanase từ nấm mốc chịu nhiệt 10 1.4 Ứng dụng xylanase 11 1.4.1 Ứng dụng thức ăn chăn nuôi 11 1.4.2 Ứng dụng công nghiệp giấy dệt may 12 1.4.3 Ứng dụng thực phẩm chức dƣợc phẩm 13 1.4.4 Ứng dụng ngành công nghiệp khác nhiên liệu sinh học 14 1.5 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu giới 16 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Đào Kim Tuyến i Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Nguồn mẫu phân lập 19 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị 19 2.2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập mẫu môi trƣờng Czapek pH 2.0 22 2.3.2 Phƣơng pháp nuôi cấy chiết enzyme 23 2.3.2.1 Nuôi chiết enzyme chất rắn 23 2.3.2.2 Nuôi chiết enzyme chất lỏng 23 2.3.3 Xác định hoạt độ enzyme theo phƣơng pháp DNS 24 2.3.4 Đánh giá độ bền nhiệt enzyme 26 2.3.5 Phƣơng pháp xác định protein (Lowry) 26 2.3.6 Phƣơng pháp điện di protein SDS-PAGE 27 2.3.7 Phƣơng pháp điện di Zymogram 28 2.3.8 Tách chiết DNA tổng số 29 2.3.9 Định tên chủng nấm mốc dựa vào giải trình tự DNA 30 2.3.10 Sắc ký trao đổi ion cột DEAE Sepharose Fast Flow 30 2.3.11 Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc cột Butyl Sepharose High Performance 31 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập sàng lọc chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân xylan 33 3.2 Định tên giải trình tự DNA 34 3.3 Xác định pH hoạt động xylanase từ chủng Thielavia sp 36 3.4 Khảo sát tính bền nhiệt xylanase từ chủng Thielavia sp 37 Đào Kim Tuyến ii Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm 3.5 Tinh chế enzyme xylanase 38 3.5.1 Lựa chọn chủng giống 38 3.5.2 Nuôi tách chiết enzyme 38 3.5.4 Sắc ký trao đổi ion cột DEAE Sepharose Fast Flow 40 3.5.5 Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc cột Butyl Sepharose High Performance 42 3.5.6 Xác định nhiệt độ tối ƣu độ bền nhiệt enzyme tinh 44 3.5.7 Xác định pH tối ƣu độ bền pH enzyme tinh 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC………………………………………………………………… 54 Đào Kim Tuyến iii Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Sàng lọc phân tích đặc tính enzyme thủy phân xylan bền nhiệt hoạt động môi trƣờng axit từ nấm mốc” PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS TS Tô Kim Anh hƣớng dẫn công trình nghiên cứu thân số kết cộng tác với học viên khác Các kết công bố luận văn trung thực, xác xin chịu trách nhiệm hoàn toàn số liệu, nội dung trình bày luận văn Hà Nội, ngày 17 tháng 03 năm 2016 Học viên Đào Kim Tuyến Đào Kim Tuyến iv Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành - Giám đốc Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm PGS.TS Tô Kim Anh - Giảng viên trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, thầy cô ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình trách nhiệm tập thể cán Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, ngƣời truyền đạt kiến thức cho suốt hai năm học Cuối cùng, xin đƣợc cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè bên động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để hoàn tốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 17 tháng 03 năm 2016 Học viên Đào Kim Tuyến Đào Kim Tuyến v Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate AX Arabinoxylan AXOs Oligosaccharides arabinoxylan chuỗi ngắn BSA Bovin serum albumin CS Cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide Triphophates EDTA Ethylene diamine tetra acetate LWX Larch wood xylan (xylan gỗ thông) ITS Internal transcribed spacer IU International Unit kDa Kilo Dalton OD Optical Density OSX Oat spelt xylan (xylan yến mạch) PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED N,N,N’,N’-tetramethylene-ethylenediamine Đào Kim Tuyến vi Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm DANH MỤC BẢNG STT Bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Một vài thuộc tính xylanase từ nấm chịu nhiệt 11 Bảng 3.1 Tổng hợp danh sách chủng nấm mốc chịu nhiệt chịu pH thấp phân lập đƣợc 60 Bảng 3.2 Kết định tên loài 18 chủng dựa vào phƣơng pháp giải trình tự DNA 35 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 58 chủng nấm mốc phân lập đƣợc 62 Bảng 3.4 Độ bền nhiệt 58 chủng nấm mốc phân lập đƣợc 65 Bảng 3.5.3 Hoạt tính xylanase phân đoạn tủa muối (NH4)2SO4 khối lƣợng (NH4)2SO4 cần bổ sung phân đoạn-LM6 39 Bảng 3.5.4.1 Hoạt tính xylanase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu tủa 40% (NH4)2SO4 –LM6 67 Bảng 3.5.4.2 Hoạt tính xylanase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu tủa 40% (NH4)2SO4 –LM7 68 Bảng 3.5.5 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau chạy qua cột Sepharose High Performance (HIC) 68 Đào Kim Tuyến vii Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm DANH MỤC HÌNH STT Hình Nội dung Trang Cấu trúc xylan enzyme xylanolytic liên quan đến thủy phân Hình ảnh khuẩn lạc, hình thái tế bào số 33 chủng nấm mốc phân lập Hình 1.1 Hình 3.1 Hình 3.3 Tỷ lệ hoạt tính xylanase pH 3.0/pH 5.0 chủng thuộc chi Thielavia 36 Hình 3.4 Độ bền nhiệt chủng thuộc chi Thielavia 37 Hình 3.5.1 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FCH 9.3 38 Hình 3.5.3 SDS-PAGE phân đoạn LM6 40 Hình 3.5.4 Sắc ký đồ ảnh điện di SDS-PAGE mẫu tủa 40 % (NH4)2SO4-LM6 sau chạy qua cột DEAE Sepharose FF-Lần 41 Hình 3.5.5.1 Sắc ký đồ ảnh điện di SDS-PAGE, zymogram mẫu qua cột HIC 42 Hình 3.5.5.2 Ảnh SDS-PAGE zymogram bƣớc trình tinh chế 43 10 Hình 3.5.6.1 Nhiệt độ tối ƣu phản ứng enzyme-cơ chất pH 5.0 44 11 Hình 3.5.6.2 Độ bền nhiệt enzyme pH 5.0 12 Hình 3.5.7.1 13 Hình 3.5.7.2 Khảo sát độ bền pH enzyme 65°C Đào Kim Tuyến Ảnh hƣởng pH lên phản ứng enzyme chất 65°C viii 45 46 47 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Identities 503/503(100%) >LPH 159 ITS5 15B4RAA003_H4 TTCTGAGGGATTGCTCCAGATCTCTCGACCTTTTATTTTACATATTTGATTGACTGTTGTT TAACAAATTGAAAGTTTTGGATCAGAAATGATTCAAGACGATAAAATTTCAAAACAACTTT AAGCAATGGATCACTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAATTGCGAAAAGTAATG CGATCTGCAGCCTTTGCGAATCATCGAATTCTCGAACGCACCTTGCACCCTTTGGTTCATC CATTGGGTACGTCTAGTTCAGTATCTTTATTAACCCCTAAAGGTTTATTTTTTGATAAATC TTTGGATTTGCGGTGCTGATGGATTTTCATCCGTTCAAGCTACCCGAACAATTTGTATGTT GTTGACCCTTGATATTT Rhizomucor pusillus Sequence ID: gb|JN206311.1| Identities 383/383(100%) Rhizomucor tauricus Sequence ID: gb|JN206310.1| Identities 383/383(100%) >LPH 172 ITS5 15B4RAA003_G5 GAGTTGTAAGACTCCTAAACTACTATGGACCTTACCTAACTATTGCTTCGGCGGGCGACGC CAGGGCCCCTACGGGCCTACCAGCGTGCCCCCCGGCCCCCCTCGCAGGGGCGCTCGTCGAA GGCTCCAAACCATTCTTATATATATAAGGCCTCTCTAAGTCTTTTGTACTGAATAAGTTAA AACTTTCAATAACGGATCTCTTGGTTCTAGTATCGATAAAGAACATAGCAAAATACGATAA ATAATGTGAATTGTAGAATTCTATAAATCATCGAATCTTTGAATATACATTGCGCTCGCTA GCATTCCAGCGGGTATACCTATCCGAACGTCATTTCGACCATCAAGCCCTAGGCTTATATT GGGGATCTACGGCTATTCATAGGCCTCGAAAACTAGTAGCGGTGCCTACTATCACCCTGAG CGTAGTAGCAACCACCTCGCTCAGGGCGTGCTCCAGGTCCCGGCCATTAAATGGAAAGCAA CCCCCTAAAGGTTGACCTCGGATTAGGTAAAAGGACCCACTGAACTTA Thielavia sp Thielavia terrestris Sequence ID: gb|CP003011.1| Identities 461/536 (86%) >LPH 176 ITS5 15B4RAA003_H8 TCTATTGGTGAGCCGCGATTCTCTCCTTTTTGTGAAATGTTCTGAGGGATTGCTCCAGATC TCTCGACCTTTTATTTTACATATTTGATTGACTGTTGTTTAACAAATTGAAAGTTTTGGAT CAGAAATGATTCAAGACGATAAAATTTCAAAACAACTTTAAGCGATGGATCACTTGGTTCT CGCATCGATGAAGAGCGTAGCAAATTGCGAAAAGTAATGCGATCTGCAGCCTTTGCGAATC ATCGAATTCTCGAACGCACCTTGCACCCTTTGGTTCATCCATTGGGTACGTCTAGTTCAGT ATCTTTATTAACCCCTAAAGGTGTATTTTTTGATAAATCTTTGGATTTGCGGTGCTGATGG ATT Rhizomucor pusillus Sequence ID: gb|JN206311.1| Đào Kim Tuyến 58 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Identities 563/564 (100%) Rhizomucor tauricus Sequence ID: gb|JN206310.1| Identities 563/564 (100%) >LPH 180 1st_BASE_1860042_143_ITS4 GATCATTAAAATATCTGCTGGCTAGCAGAACCCCTAGATTATATGTTTTTTGGTTGGACCA AAAAAGCACGATGGCTAGGTAGTTCGTAATTTAATGAAAATTACAAAGAGGCTGTATTTTA GACAATCGGTATAATAATTAAATTTAACCGAGCTTGTCCATCACCACATAAAATAAATTTT ATGTGTGGGTTGGTTATGATACTGAAGCAAGCGTACTCTATAGAAGATCCATAGAGTGCAA GCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGAATATGCAATTCACACTAGTTATCGCACTTTGC TACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCATTGTTAAAAGTTGTTATTATATTATA CTTTCAATTCTGAATTCATGGTATATGGTAAAGGGTACCAGGCACCTTCCTTCCCAAAGGA AGAAAGGTAATCCTGATTGGCATCGATCAAACCCCAGAACAGGCCTACCCATTATAGCCTA TATGTCCTGAGTCTCTCCCGAAGGTCAGTTACGACCTTCATCGCCAGAGGTTCACAGTATA GAAGCAAACAATACTGAGAAGTAAATCCCAGTAAAGTGCCAATACATTAGTTAATGATCCT TCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC Rhizopus azygosporus Sequence ID: gb|DQ119008.1| Identities 630/630(100%) Rhizopus microsporus Sequence ID: gb|KC206548.1| Identities 641/641 (100%) >LPH 182 ITS5 15B4RAA003_G7 AGTTGTAAGACTCCTAAACTACTATGGACCTTACCTAACTATTGCTTCGGCGGGCGACGCC AGGGCCCCTACGGGCCTACCAGCGTGCCCCCCGGCCCCCCTCGCAGGGGCGCTCGTCGAAG GCTCCAAACCATTCTTATATATATAAGGCCTCTCTAAGTCTTTTGTACTGAATAAGTTAAA ACTTTCAATAACGGATCTCTTGGTTCTAGTATCGATAAAGAACATAGCAAAATACGATAAA TAATGTGAATTGTAGAATTCTATAAATCATCGAATCTTTGAATATACATTGCGCTCGCTAG CATTCCAGCGGGTATACCTATCCGAACGTCATTTCGACCATCAAGCCCTAGGCTTATATTG GGGATCTACGGCTATTCATAGGCCTCGAAAACTAGTAGCGGTGCCTACTATCACCCTGAGC GTAGTAGCAACCACCTCGCTCAGGGCGTGCTCCAGGTCCCGGCCATTAAATGGAAAGCAAC CCCCTAAAGGTTGACCTCGGATTAGGTAAAAGGACCCACTGAACTTAAGCATATC Thielavia terrestris Sequence ID: gb|CP003011.1| Identities 468/543 (86%) Đào Kim Tuyến 59 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Tổng hợp kết sàng lọc II Bảng 3.1 Tổng hợp danh sách chủng nấm mốc chịu nhiệt chịu pH thấp phân lập đƣợc STT 10 11 12 13 14 15 16 Địa điểm Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Phú Xuyên Phú Xuyên Phú Xuyên Lạng Sơn Lạng Sơn Lạng Sơn Phú Xuyên Phú Xuyên Ba Vì Ba Vì Ba Vì Đặc điểm mẫu Phân ủ (ẩm) Phân ủ (nhiều rác) Mùn cƣa(đen ẩm) Mùn cƣa (đen ẩm, trống mộc nhĩ) Bông (ẩm, trồng nấm sò) Rơm mục(giữa đống, ẩm) Mùn cƣa (màu nâu, ẩm) Phân gà ủ (ẩm, lẫn trấu, đống) Thân vải mục Thân mít mục Gỗ mục Trấu ủ (ẩm) Trấu ủ (ẩm) Gỗ mục (ẩm, màu nâu) Gỗ mục (ẩm, màu đen) Gỗ mục (ẩm) 17 Ba Vì Gỗ mục (ẩm, nâu) 18 19 20 21 22 Ba Vì Tuyên Quang Tuyên Quang Thái Nguyên Bắc Giang Gỗ mục (vàng, ẩm) Gỗ mục (nâu xám) Mùn cƣa (hơi ẩm) Đất quanh gốc dừa Gỗ mục (đen, ẩm) 23 Bắc Giang Gỗ mục (đen, ẩm) 24 Bắc Giang Nấm mục (đen, ẩm) 25 26 27 28 29 30 31 32 Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Đất quanh gốc tre (ẩm) Mùn mỏ (mục, ẩm, xám) Mùn cám trấu (mục, ẩm, đen) Mùn cơm nguội(mục, xám) Mùn gốc phong lan (ẩm, đen) Mùn gốc xoan (mục, ẩm) Rễ xoan (mục, ẩm) Gốc phong lan (mục, đen) Đào Kim Tuyến 60 Kí hiệu chủng LPH 150 LPH 151 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 152, LPH 153 Không có khuẩn lạc LPH 154,LPH 156 Không có khuẩn lạc LPH 134, LPH 159 LPH 136, LPH 157 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 128 Không có khuẩn lạc LPH 129, LPH 130 LPH 135, LPH 155 LPH 131, LPH 132, LPH 133, LPH 158 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 160, LPH 161, LPH 163 LPH 137, LPH 138, LPH 139, LPH 162 Không có khuẩn lạc LPH 164 LPH 141, LPH 165 Không có khuẩn lạc LPH 142 Không có khuẩn lạc LPH 140 Không có khuẩn lạc Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT 33 34 Địa điểm Bắc Ninh Tuyên Quang Đặc điểm mẫu Giá thể trồng nấm sò (ẩm, vàng) Gỗ mục (đen, ẩm) 35 Bắc Giang Gỗ đào mục (đen, ẩm) 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Bắc Giang TP Bắc Giang Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Lạng Sơn Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Rễ tre (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, đen) Gỗ mục (mục, đen, ẩm) Gỗ mục (mục, đen, ẩm) Gốc dứa mục (đen, ẩm) Lá mục (đen, ẩm) Rơm mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (nâu đen, ẩm) Gỗ mục (ẩm, nâu, vàng) Gỗ mục (khô, trắng) Gỗ mục (ẩm, nâu đen) Gỗ mục (hơi ẩm, xốp đen) 55 Hƣng Yên Gỗ cứng (hơi ẩm, đen) 56 Hƣng Yên Rơm mục (xám nâu, ẩm) 57 Hƣng Yên Gỗ mục (đen ẩm) 58 59 60 61 Hƣng Yên Hƣng Yên Hƣng Yên Hƣng Yên Gỗ mục (xốp, nâu đen ẩm) Thân dừa (ẩm mục nâu) Trấu mục (ẩm, đen mốc) Gỗ mục (trắng ẩm, xốp) 62 Hƣng Yên Gỗ mục (ẩm, đen) Đào Kim Tuyến 61 Kí hiệu chủng Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 166, LHP 167, LHP 174 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 168 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 169 LPH 170 LPH 171 LPH 143, LPH 182 LPH 172 Không có khuẩn lạc LPH 144, LPH 173 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 145 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 176, LPH 177, LPH 178, LPH 179 LPH 146, LPH 147 LPH 175, LPH 183, LPH 184, LPH 185 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 148, LPH 149, LPH 180, LPH 181 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 58 chủng nấm mốc phân lập đƣợc Xylanase, IU/ml Mẫu STT pH3 pH5 pH7 Rate Rate pH3/pH5, % pH7/pH5, % LPH 128 5.87 11.03 1.98 53.21 17.99 LPH 129 1.72 2.49 0.77 68.96 30.99 LPH 130 14.05 15.47 3.40 90.79 22.01 LPH 131 0.03 0.03 0.01 99.81 53.75 LPH 132 0.03 0.03 0.02 85.43 48.54 LPH 133 4.47 9.55 1.53 46.76 16.04 LPH 134 1.68 3.57 0.64 46.92 17.77 LPH 135 0.02 0.03 0.02 66.92 82.80 LPH 136 0.01 0.04 0.02 32.21 46.88 10 LPH 137 5.85 14.48 2.18 40.41 15.09 11 LPH 138 0.03 0.03 0.02 94.97 53.42 12 LPH 139 0.02 0.03 0.01 65.90 42.87 13 LPH 140 9.62 21.74 4.61 44.25 21.21 14 LPH 141 0.02 0.01 0.01 165.56 130.98 15 LPH 142 3.53 9.59 4.65 36.77 48.53 16 LPH 143 3.36 5.09 1.03 65.99 20.23 17 LPH 144 3.26 4.02 0.80 80.95 19.91 18 LPH 145 6.97 143.85 46.25 4.84 32.15 19 LPH 146 0.03 0.05 0.03 58.97 52.32 20 LPH 147 6.28 8.88 1.97 70.76 22.21 21 LPH 148 1.63 1.84 0.42 88.63 22.59 22 LPH 149 0.03 0.04 0.02 60.64 54.13 23 LPH 150 0.02 0.03 0.02 73.22 66.81 Đào Kim Tuyến 62 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Xylanase, IU/ml Mẫu STT pH3 pH5 pH7 Rate Rate pH3/pH5, % pH7/pH5, % 24 LPH 151 0.64 10.19 7.48 6.26 73.41 25 LPH 152 2.81 39.83 50.04 7.06 125.64 26 LPH 153 1.14 16.01 7.77 7.14 48.53 27 LPH 154 1.13 1.8 0.29 63.21 16.37 28 LPH 155 4.69 9.13 1.68 51.42 18.39 29 LPH 156 7.74 200.14 65.87 3.87 32.91 30 LPH 157 0.01 0.03 0.03 44.07 77.44 31 LPH 158 10.84 18.75 3.65 57.82 19.49 32 LPH 159 7.22 16.82 3.23 42.96 19.18 33 LPH 160 0.04 0.05 0.02 77.24 48.21 34 LPH 161 10.73 13.92 2.92 77.09 20.96 35 LPH 162 15.44 21.98 3.45 70.25 15.71 36 LPH 163 0.03 0.04 0.01 69.70 30.32 37 LPH 164 0.06 0.11 0.04 49.14 36.45 38 LPH 165 13.87 19.91 3.36 69.67 16.89 39 LPH 166 0.13 0.17 0.08 73.34 45.50 40 LPH 167 3.04 80.52 21.42 3.78 26.60 41 LPH 168 0.02 0.01 0.02 114.98 116.47 42 LPH 169 0.02 0.03 0.02 64.23 76.73 43 LPH 170 9.32 11.91 2.63 78.27 22.06 44 LPH 171 0.07 0.08 0.04 87.64 52.43 45 LPH 172 3.48 7.36 2.46 47.29 33.43 46 LPH 173 6.40 10.59 1.81 60.41 17.06 47 LPH 174 15.34 21.50 4.11 71.34 19.10 48 LPH 175 7.22 11.45 2.67 63.03 23.35 49 LPH 176 0.08 0.56 0.18 13.59 31.71 Đào Kim Tuyến 63 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Xylanase, IU/ml Mẫu STT pH3 pH5 pH7 Rate Rate pH3/pH5, % pH7/pH5, % 50 LPH 177 12.89 18.01 3.57 71.57 19.80 51 LPH 178 0.12 0.18 0.06 67.49 32.28 52 LPH 179 6.62 11.47 2.74 57.70 23.94 53 LPH 180 1.63 2.40 0.49 67.85 20.26 54 LPH 181 0.07 0.31 0.05 24.05 15.25 55 LPH 182 2.06 5.47 2.18 37.63 39.84 56 LPH 183 6.25 99.28 57.78 6.29 58.20 57 LPH 184 5.75 105.50 68.25 5.45 64.70 58 LPH 185 3.56 70.73 55.23 5.03 78.09 Đào Kim Tuyến 64 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Bảng 3.4 Độ bền nhiệt 58 chủng nấm mốc phân lập đƣợc Xylanase, IU/ml Mẫu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 LPH 128 LPH 129 LPH 130 LPH 131 LPH 132 LPH 133 LPH 134 LPH 135 LPH 136 LPH 137 LPH 138 LPH 139 LPH 140 LPH 141 LPH 142 LPH 143 LPH 144 LPH 145 LPH 146 LPH 147 LPH 148 LPH 149 LPH 150 LPH 151 LPH 152 LPH 153 LPH 154 LPH 155 LPH 156 LPH 157 LPH 158 LPH 159 LPH 160 LPH 161 LPH 162 LPH 163 LPH 164 Đào Kim Tuyến D 50 20 50 100 100 80 100 100 50 50 50 50 100 50 40 20 20 400 50 20 50 100 50 10 40 200 100 80 40 50 80 50 Nhiệt độ phòng (30˚C) 3.72 1.95 11.08 12.27 9.30 9.28 14.80 14.52 3.42 7.29 5.55 7.15 17.66 3.50 5.15 1.97 2.68 66.28 0.00 3.51 0.54 0.01 2.78 0.01 7.76 22.70 8.27 0.73 3.95 20.45 0.00 13.59 7.42 5.94 8.15 11.82 7.46 65 70˚C 4.01 0.58 11.11 11.78 10.62 8.35 13.76 15.34 3.68 1.67 5.02 6.32 17.41 3.03 0.84 1.86 2.60 5.39 0.00 0.12 0.42 0.00 0.20 0.00 0.26 0.49 1.15 0.61 4.17 19.71 0.01 13.57 7.38 5.60 8.34 11.14 7.09 Rate,% 70˚C/30˚C 107.81 29.59 100.21 96.02 114.25 89.98 92.94 105.60 107.82 22.97 90.38 88.46 98.55 86.71 16.25 94.56 97.22 8.13 0.00 3.31 78.40 21.05 7.18 20.83 3.29 2.15 13.90 83.54 105.65 96.36 200.00 99.83 99.50 94.21 102.43 94.18 95.02 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Xylanase, IU/ml Mẫu STT 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 LPH 165 LPH 166 LPH 167 LPH 168 LPH 169 LPH 170 LPH 171 LPH 172 LPH 173 LPH 174 LPH 175 LPH 176 LPH 177 LPH 178 LPH 179 LPH 180 LPH 181 LPH 182 LPH 183 LPH 184 LPH 185 LPH 128 Đào Kim Tuyến D 80 300 120 50 50 20 50 100 50 70 50 80 50 20 300 200 200 Nhiệt độ phòng (30˚C) 0.01 10.37 0.03 48.38 16.73 3.76 6.61 0.04 3.17 5.28 10.97 6.17 0.38 9.32 0.07 6.18 12.62 4.67 1.67 62.05 40.53 20.45 66 70˚C 0.00 10.23 0.04 48.66 17.18 5.34 6.51 0.03 0.98 5.28 11.39 6.00 0.26 8.85 0.06 5.87 0.87 4.38 0.07 3.56 1.16 19.71 Rate,% 70˚C/30˚C 72.73 98.57 105.41 100.58 102.67 141.98 98.42 61.24 30.94 100.00 103.81 97.18 68.39 94.94 76.58 94.92 6.92 93.78 3.89 5.73 2.87 96.36 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội III Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Kết phần tinh chế Bảng 3.5.4.1 Hoạt tính xylanase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu tủa 40% (NH4)2SO4 –LM6 Mẫu 40 LM6 D I W E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 1 1 1 10 10 10 50 100 100 100 20 10 1 1 1 1 1 1 1 1 Đào Kim Tuyến LẦN Xylanase T IU Σ IU/ml 0.085 0.172 3.616 0.029 0.102 0.000 0.001 0.066 0.165 0.045 0.122 0.305 0.047 0.125 0.311 0.567 0.777 1.941 0.238 3.633 9.083 0.3449 4.976 12.440 0.5456 7.493 18.733 0.2511 18.999 47.498 0.3878 55.142 137.854 0.4758 66.178 165.444 0.278 41.410 103.524 0.438 12.282 30.706 0.304 4.463 11.158 0.277 2.063 5.157 0.519 0.715 1.788 0.352 0.507 1.268 0.261 0.392 0.980 0.194 0.308 0.771 0.163 0.270 0.675 0.138 0.238 0.594 0.120 0.215 0.538 0.091 0.179 0.448 0.084 0.171 0.426 0.072 0.155 0.388 0.062 0.143 0.357 0.044 0.121 0.301 0.044 0.121 0.301 0.029 0.102 0.255 0.031 0.104 0.260 0.035 0.109 0.273 67 D 1 1 20 20 50 100 100 100 100 50 10 1 1 1 1 1 1 1 1 LẦN Xylanase T IU Σ IU/ml 0.117 0.212 3.497 0.089 0.177 3.539 0.046 0.122 0.306 0.127 0.224 0.560 0.342 2.470 6.175 0.264 7.928 19.821 0.433 12.172 30.430 0.2181 16.930 42.325 0.2492 37.760 94.401 0.4047 57.261 143.153 0.4967 68.799 171.996 0.3102 45.410 113.525 0.193 15.331 38.328 0.235 3.594 8.985 0.227 1.748 4.369 0.294 0.867 2.167 0.376 0.537 1.342 0.289 0.427 1.068 0.220 0.341 0.854 0.194 0.308 0.770 0.154 0.258 0.645 0.118 0.213 0.534 0.118 0.213 0.532 0.090 0.178 0.446 0.075 0.159 0.397 0.067 0.149 0.372 0.050 0.128 0.319 0.046 0.123 0.307 0.042 0.118 0.294 0.033 0.107 0.267 0.032 0.105 0.264 0.030 0.102 0.255 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Bảng 3.5.4.2 Hoạt tính xylanase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu tủa 40% (NH4)2SO4 –LM7 Mẫu LM7 I W E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 D T 5 10 50 100 100 100 100 50 20 10 1 0.281 0.284 0.310 0.415 0.373 0.132 0.185 0.199 0.297 0.234 0.206 0.239 0.206 0.448 0.375 0.240 Xylanase IU Σ IU/ml 2.086 50.053 2.109 37.957 0.907 2.267 2.929 7.322 5.330 13.325 11.556 28.891 29.722 74.304 31.515 78.787 43.792 109.481 35.816 89.541 16.140 40.350 7.294 18.234 3.229 8.073 1.253 3.132 0.535 1.337 0.365 0.914 Mẫu LM7 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 D T 1 1 1 1 1 1 1 1 0.163 0.130 0.084 0.072 0.030 0.036 0.046 0.038 0.064 0.018 0.015 0.012 0.013 0.010 0.001 0.006 Xylanase IU/ml 0.270 0.228 0.170 0.155 0.103 0.110 0.123 0.113 0.145 0.088 0.084 0.080 0.081 0.078 0.066 0.073 IU Σ 0.674 0.570 0.426 0.388 0.258 0.276 0.308 0.282 0.362 0.220 0.209 0.199 0.202 0.195 0.166 0.183 Bảng 3.5.5 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau chạy qua cột Sepharose High Performance (HIC) STT Mẫu 10 11 12 13 14 I W E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 Đào Kim Tuyến Volume Mid Volume 115.5 118 120.5 123 125.5 128 130.5 133 135.5 138 140.5 143 7.5 80 116.75 119.25 121.75 124.25 126.75 129.25 131.75 134.25 136.75 139.25 141.75 144.25 68 Xylanase IU/ml 0.193 0.106 0.062 0.046 0.073 0.074 0.099 0.071 0.063 0.059 0.059 0.059 0.060 0.073 IU Σ 0.155 0.115 0.184 0.186 0.248 0.177 0.157 0.148 0.148 0.147 0.151 0.182 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Volume Mid Volume 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 145.5 148 150.5 153 155.5 158 160.5 163 165.5 168 170.5 173 175.5 178 180.5 183 185.5 188 190.5 193 195.5 198 200.5 203 205.5 208 210.5 213 215.5 218 220.5 223 225.5 228 230.5 233 235.5 238 240.5 243 146.75 149.25 151.75 154.25 156.75 159.25 161.75 164.25 166.75 169.25 171.75 174.25 176.75 179.25 181.75 184.25 186.75 189.25 191.75 194.25 196.75 199.25 201.75 204.25 206.75 209.25 211.75 214.25 216.75 219.25 221.75 224.25 226.75 229.25 231.75 234.25 236.75 239.25 241.75 244.25 Đào Kim Tuyến 69 Xylanase IU/ml 0.106 0.066 0.056 0.053 0.064 0.049 0.058 0.075 0.064 0.079 0.693 0.749 0.069 0.068 0.070 0.068 0.063 0.099 0.097 0.072 0.094 0.070 0.101 0.079 0.092 0.095 0.083 0.116 0.381 0.418 0.447 0.510 0.583 0.724 0.833 1.063 1.266 1.356 1.395 1.825 IU Σ 0.265 0.165 0.141 0.133 0.159 0.124 0.145 0.188 0.159 0.198 1.733 1.872 0.174 0.170 0.176 0.171 0.159 0.247 0.241 0.181 0.235 0.176 0.253 0.197 0.229 0.237 0.206 0.290 0.954 1.044 1.119 1.276 1.458 1.810 2.084 2.658 3.165 3.390 3.488 4.563 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Volume Mid Volume 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 E83 E84 E85 E86 E87 E88 E89 E90 E91 E92 245.5 248 250.5 253 255.5 258 260.5 263 265.5 268 270.5 273 275.5 278 280.5 283 285.5 288 290.5 293 295.5 298 300.5 303 305.5 308 310.5 313 315.5 318 320.5 323 325.5 328 330.5 333 335.5 338 340.5 343 246.75 249.25 251.75 254.25 256.75 259.25 261.75 264.25 266.75 269.25 271.75 274.25 276.75 279.25 281.75 284.25 286.75 289.25 291.75 294.25 296.75 299.25 301.75 304.25 306.75 309.25 311.75 314.25 316.75 319.25 321.75 324.25 326.75 329.25 331.75 334.25 336.75 339.25 341.75 344.25 Đào Kim Tuyến 70 Xylanase IU/ml 2.421 3.698 6.011 7.306 11.191 11.683 24.153 16.797 18.515 14.231 15.049 11.748 10.650 7.223 6.703 4.271 1.687 1.724 2.673 1.371 1.383 1.054 0.583 0.520 0.488 0.453 0.388 0.386 0.376 0.460 0.451 0.415 0.426 0.459 0.426 0.453 0.435 0.422 0.407 0.442 IU Σ 6.052 9.246 15.027 18.266 27.978 29.207 60.384 41.993 46.288 35.578 37.622 29.370 26.624 18.059 16.758 10.678 4.217 4.311 6.683 3.429 3.459 2.635 1.458 1.300 1.219 1.131 0.970 0.965 0.939 1.151 1.126 1.039 1.066 1.148 1.064 1.133 1.087 1.056 1.018 1.105 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Volume Mid Volume 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 134 135 E93 E94 E95 E96 E97 E98 E99 E100 E101 E102 E103 E104 E105 E106 E107 E108 E109 E110 E111 E112 E113 E114 E115 E116 E117 E118 E119 E120 E121 E122 E123 E124 E125 E126 E127 E128 E129 E130 E131 E132 345.5 348 350.5 353 355.5 358 360.5 363 365.5 368 370.5 373 375.5 378 380.5 383 385.5 388 390.5 393 395.5 398 400.5 403 405.5 408 410.5 413 415.5 418 420.5 423 425.5 428 430.5 433 435.5 438 440.5 443 346.75 349.25 351.75 354.25 356.75 359.25 361.75 364.25 366.75 369.25 371.75 374.25 376.75 379.25 381.75 384.25 386.75 389.25 391.75 394.25 396.75 399.25 401.75 404.25 406.75 409.25 411.75 414.25 416.75 419.25 421.75 424.25 426.75 429.25 431.75 434.25 436.75 439.25 441.75 444.25 Đào Kim Tuyến 71 Xylanase IU/ml 0.430 0.373 0.344 0.325 0.300 0.287 0.267 0.246 0.235 0.250 0.273 0.217 0.216 0.204 0.242 0.237 0.227 0.214 0.244 0.253 0.200 0.273 0.255 0.279 0.255 0.257 0.302 0.603 0.626 0.283 0.302 0.286 0.257 0.209 0.214 0.218 0.185 0.208 0.178 0.180 IU Σ 1.076 0.932 0.860 0.814 0.750 0.719 0.667 0.616 0.586 0.626 0.683 0.543 0.540 0.511 0.606 0.592 0.567 0.536 0.610 0.631 0.499 0.682 0.637 0.697 0.639 0.643 0.754 1.507 1.564 0.708 0.754 0.716 0.644 0.522 0.535 0.546 0.463 0.520 0.445 0.450 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trƣờng ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Volume Mid Volume 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 E133 E134 E135 E136 E137 E138 E139 E140 E141 E142 E143 E144 E145 445.5 448 450.5 453 455.5 458 460.5 463 465.5 468 470.5 473 475.5 446.75 449.25 451.75 454.25 456.75 459.25 461.75 464.25 466.75 469.25 471.75 474.25 476.75 Đào Kim Tuyến 72 Xylanase IU/ml 0.204 0.199 0.177 0.186 0.164 0.160 0.185 0.170 0.192 0.199 0.186 0.198 0.191 IU Σ 0.509 0.497 0.442 0.465 0.410 0.401 0.463 0.425 0.481 0.497 0.464 0.495 0.478 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật ... 14 1.5 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu giới 16 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Đào Kim... 19 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị 19 2.2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị 22 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Phƣơng pháp phân... với xu nghiên cứu giới Tuy nhiên, ý nghĩa khoa học mà công trình nghiên cứu đem lại chúng chƣa đạt đƣợc hiệu tối đa mặt ứng dụng thực tế hay quy mô công nghiệp 1.5.2 Tình hình nghiên cứu giới