Nghiên cứu công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường bằng tế bào cố định theo phương pháp lên men liên tục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH THU NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG TẾ BÀO CỐ ĐỊNH THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LIÊN TỤC LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Công nghệ Sinh học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành Hà Nội - 2010 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết báo cáo trung thực chưa sử dụng Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực báo cáo ghi rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Minh Thu ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn chân thành tới ThS Nguyễn Thúy Hường - Chủ nhiệm môn Vi sinh, Viện Công nghệ Thực phẩm tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành tập thể cán bộ môn Vi sinh, môn Công nghệ Đồ uống - Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian qua Xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 27 tháng 10 năm 2010 Học viên Nguyễn Minh Thu iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CỒN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Xu phát triển công nghiệp cồn giới 1.1.2 Tình hình sản xuất cồn Việt Nam 1.1.3 Tình hình nghiên cứu công nghệ lên men cồn 1.2 KHÁI QUÁT VỀ LÊN MEN LIÊN TỤC 11 1.2.1 Nguyên tắc hoạt động hệ thống lên men liên tục 12 1.2.2 Đặc điểm phương pháp 12 1.2.3 Các phương pháp lên men liên tục 13 1.3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 14 1.4 RỈ ĐƯỜNG MÍA 16 1.4.1 Thành phần rỉ đường 16 1.4.2 Vi sinh vật tạp nhiễm rỉ đường 17 1.4.3 pH lực đệm rỉ đường mía 18 1.4.4 Các phương pháp xử lý rỉ đường 18 1.5 VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG MÍA 19 1.6 CÁC VI SINH VẬT TẠP NHIỄM THƯỜNG GẶP KHI LÊN MEN CỒN 19 1.7 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN LÊN MEN LIÊN TỤC 21 1.7.1 Nồng độ rỉ đường 21 1.7.2 Tốc độ pha loãng 21 1.7.3 Nhiệt độ 21 1.7.4 pH 22 1.7.5 Tỷ lệ chất lượng tế bào cố định 22 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men tạo cồn cao 23 2.2.1.1 Sơ tuyển chủng nấm men có khả lên men nhiệt độ cao 23 2.2.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men tạo cồn môi trường rỉ đường chứa chất sát khuẩn 24 iv 2.2.2 Xử lý rỉ đường 24 2.2.3 Xác định mật độ tế bào nấm men 24 2.2.4 Cố định tế bào nấm men 25 2.2.5 Xác định số lượng tế bào nấm men cố định hạt gel canxi alginat 25 2.2.6 Xác định lượng đường khử 25 2.2.7 Xác định lượng cồn tạo thành 27 2.2.8 Xác định độ chua dấm chín 28 2.2.9 Xác định thông số trình lên men 28 2.2.10 Hệ thống lên men liên tục 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG RỈ ĐƯỜNG MÍA TAM HIỆP 30 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO CỒN CAO 30 3.2.1 Sơ tuyển chủng nấm men có khả lên men nhiệt độ cao 30 3.2.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men cồn môi trường rỉ đường chứa chất sát khuẩn 32 3.3 XỬ LÝ RỈ ĐƯỜNG 33 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ TẾ BÀO CỐ ĐỊNH/DỊCH LÊN MEN 34 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG MÍA BẰNG TẾ BÀO CỐ ĐỊNH TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN LIÊN TỤC 35 3.5.1 Ảnh hưởng tỉ lệ hạt tế bào cố định/ thể tích bình lên men hệ thống lên men liên tục 35 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hàm lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục 39 3.5.3 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục 42 3.5.4 Nghiên cứu ổn định trình tạo cồn bình thu sản phẩm F5 theo thời gian hệ thống lên men liên tục 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu từ năm 2008 đến năm 2012 Bảng 1.2 Một số công trình nghiên cứu lên men liên tục giới Bảng 1.3 Phạm vi ứng dụng kỹ thuật cố định tế bào 14 Bảng 1.4 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật 17 Bảng 1.5 Một số vi sinh vật thường dùng sản xuất cồn từ rỉ đường mía 19 Bảng 3.1 Thành phần hóa học vi sinh vật rỉ đường mía Tam Hiệp 30 Bảng 3.2 Khả lên men nhiệt độ 30ºC chủng nấm men 31 Bảng 3.3 Khả chịu chất sát trùng hai chủng nấm men 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng chế độ xử lý rỉ đường tới khả lên men chủng CNTP 7028 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng tỉ lệ tế bào cố định/ thể tích dịch lên men đến khả lên men chủng CNTP 7028 35 Bảng 3.6 Khả lên men tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men 30 % 36 Bảng 3.7 Khả lên men tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men 80 %w/v 37 Bảng 3.8 Khả lên men tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men 50 %w/v 37 Bảng 3.9 Khả lên men tế bào cố định ứng với tỉ lệ hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men 40 %w/v 38 Bảng 3.10 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 170 g/l 39 Bảng 3.11 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 190 g/l 40 Bảng 3.12 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 210 g/l 40 Bảng 3.13 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 230 g/l 41 Bảng 3.14 Khả lên men tế bào cố định ứng với 42 tốc độ pha loãng 0,102 l/l/giờ 42 Bảng 3.15 Khả lên men tế bào cố định ứng với 43 tốc độ pha loãng 0,128 l/l/giờ 43 Bảng 3.16 Khả lên men tế bào cố định ứng với 43 tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ 43 Bảng 3.17 Khả lên men tế bào cố định ứng với 43 tốc độ pha loãng 0,171 l/l/giờ 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Sản lượng cồn nhiên liệu số nước giới (1975 - 2010) Hình 1.2 Quy trình sản xuất cồn từ rỉ đường Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Nelson - Somogi 27 Hình 2.2 Mô hình hệ thống lên men liên tục 29 Hình 3.1 Khả lên men nhiệt độ 37oC chủng nấm men 32 Hình 3.2 Khả lên men nhiệt độ 40oC chủng nấm men 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ tế hạt tế bào cố định : thể tích bình lên men (w/v) đến lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục 38 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất đến khả tạo cồn hiệu suất lên men tế bào cố định hệ thống lên men liên tục 41 Hình 3.5 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến sản lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục 44 Hình 3.6 Thời gian ổn định lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục 45 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào nấm men cố định hạt gel canxi alginat chu kỳ lên men 46 Hình 3.8 Sự phát triển tế bào nấm men S cerevisiae CNTP 7028 hạt gel alginat chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) giai đoạn lên men khác 47 vii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ethanol (rượu cồn) chiếm vị trí đáng kể công nghiệp thực phẩm Ngoài công dụng làm đồ uống, rượu - cồn có khả làm nguyên liệu cho số ngành kinh tế quan trọng như: Làm dung môi hữu cơ, nhiên liệu, dùng y tế, mỹ phẩm pha nước hoa, dược phẩm để trích ly hoạt chất sinh học, sản xuất axit axetic giấm ăn, sản xuất loại este có mùi thơm, tổng hợp cao su nhiều hợp chất khác v.v… Đặc biệt, bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày cạn kiệt ethanol coi nguồn nhiên liệu sinh học thay đầy hứa hẹn Hiện nay, số hãng ô tô giới thử nghiệm thành công mẫu động chạy cồn hỗn hợp xăng pha cồn [29] Ở Việt Nam, bên cạnh nhà máy sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, số nhà máy công ty mía đường tận dụng nguồn nguyên liệu rỉ đường để sản xuất cồn Công nghệ sản xuất cồn áp dụng lên men gián đoạn lên men bán liên tục, sử dụng tế bào tự Sản lượng cồn tạo đáp ứng phần nhu cầu thị trường [5] Trong năm gần đây, công nghệ lên men cồn liên tục, sử dụng tế bào cố định thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Các hệ thống lên men liên tục cho phép tăng hiệu sản xuất, giảm giá thành chế tạo thùng lên men, giảm chi phí bảo dưỡng, giảm công lao động nâng cao hiệu suất lên men Việc bao bọc lớp chất mang giúp tế bào chống chịu với tác nhân bất lợi tốt so với tế bào tự Ngoài ra, việc cố định tế bào giúp cho tế bào giữ lại thiết bị phản ứng không bị thoát theo dịch đầu [20] Cho đến nay, khoảng 30% ethanol sản xuất Braxin theo trình lên men liên tục (Monte et al, 2003) Với mong muốn nâng cao hiệu suất lên men giảm chi phí sản xuất cồn từ rỉ đường, đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường tế bào cố định theo phương pháp lên men liên tục” thực Mục đích đề tài Xây dựng công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường tế bào cố định hệ thống lên men liên tục Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đồi tượng nghiên cứu: - Nấm men Saccharomyces cerevisiae từ Sưu tập giống Vi sinh vật, Viện Công nghiệp Thực phẩm - Rỉ đường mía nhà máy Tam Hiệp - Hà Tây Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu trình lên men cồn từ rỉ đường tế bào nấm men cố định hệ thống lên men liên tục Các luận điểm đóng góp luận văn Các luận điểm bản: - Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men S cerevisiae có khả lên men tạo cồn nhiệt độ cao môi trường chứa chất sát khuẩn - Nghiên cứu quy trình xử lý rỉ đường thích hợp cho trình lên men cồn - Xác định điều kiện lên men cồn tế bào cố định theo công nghệ lên men liên tục Đóng góp luận văn: Ở Việt Nam, công nghệ cố định tế bào giai đoạn nghiên cứu phòng thí nghiệm Rất nghiên cứu thực đối tượng rỉ đường kết chưa đưa quy mô công nghiệp Việc kết hợp kỹ thuật cố định tế bào trình lên men liên tục sản xuất cồn hướng có triển vọng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CỒN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.1.1 Xu phát triển công nghiệp cồn giới Năm 2003, toàn giới sản xuất 38,5 tỷ lít ethanol (châu Mỹ chiếm khoảng 70%, châu Á 17%, châu Âu 10%), 70% dùng làm nhiên liệu, 30% sử dụng công nghiệp thực phẩm, y tế, hoá chất Đến năm 2007, lượng ethanol sản xuất tăng lên 56 tỷ lít, tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên 75% [32] Hình 1.1 Sản lượng cồn nhiên liệu số nước giới (1975 - 2010) [35] Braxin nước tiên phong công tác nghiên cứu sản xuất cồn nhiên liệu Những năm gần đây, phủ Braxin tập trung phát triển, đa dạng hóa nguồn lượng nhằm bảo đảm ổn định phát triển kinh tế đất nước Trong chương trình phát triển kinh tế năm 2007 - 2010, phủ Braxin đầu tư tới 236 tỷ USD vào hạ tầng sở, đó, giao thông vận tải, nhà lượng ưu tiên hàng đầu Trong lĩnh vực lượng, Braxin tập trung đầu tư xây dựng 121 nhà máy sản xuất dầu sinh học nhằm đẩy mạnh phát triển nhiên liệu ethanol Theo kế hoạch, tới năm 2015, Braxin dự kiến sản xuất 36,9 tỷ lít ethanol, tương đương với 636 nghìn thùng xăng/ngày, với hy vọng nguồn nhiên liệu thay cạnh tranh với thị trường xăng giới [15, 32, 33, 34] Nếu so sánh mặt thiết bị, lên men với tỉ lệ hạt tế bào cố định/dịch lên men 40 %w/v, 50 %w/v 80 %w/v giảm tải thiết bị lên men độ cồn cao đạt bình lên men số (F3) Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi cồn không cao lên men với tỉ lệ 30% nên tỉ lệ hạt tế bào cố định/ dịch lên men 30 % w/v lựa chọn cho thí nghiệm 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hàm lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục Thí nghiệm tiến hành hệ thống lên men liên tục gồm bình lên men nhau, bình tích lít pH ban đầu 5,0 Nhiệt độ lên men 30ºC Tốc độ pha loãng đạt 0,128 l/l/giờ Tỉ lệ hạt tế bào nấm men cố định/thể tích bình lên men 30%w/v Môi trường rỉ đường thay đổi nồng độ 22ºBx, 24ºBx, 26ºBx 28ºBx (tương ứng với 170 g/l, 190 g/l, 210 g/l 230 g/l) Theo dõi trình lên men (trong ngày sau dòng dịch nuôi cấy ra), kết trình bày bảng 3.10, 3.11, 3.12 3.13 Bảng 3.10 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 170 g/l Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 5,4 6,25 7,2 7,2 7,2 110,58 88,46 40,00 36,51 26,14 4,7 4,7 4,6 4,5 4,4 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 1,31 x 108 1,69 x 108 1,03 x 108 7,30 x 107 7,00 x 107 1,88 x 107 1,80 x 107 1,50 x 107 52,12 60,33 69,50 69,50 69,50 Kết bảng 3.10 cho thấy, bình lên men số độ cồn đạt 7,2 %v/v Tại bình lên men này, lượng đường sót 40 g/l nên đủ dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng mà không chuyển hóa đường thành cồn Chính vậy, bình lên men sau độ cồn không tăng nữa, cao đạt 7,2 %v/v ứng với hiệu suất lên men 69,50% 39 Bảng 3.11 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 190 g/l Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 6,4 7,95 8,2 8,4 8,4 88,46 75,41 69,70 43,40 39,66 4,4 4,4 4,3 4,3 4,2 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 3,90 x 108 1,32 x 108 1,16 x 108 8,00 x 107 7,88 x 107 2,18 x 107 1,75 x 107 1,25 x 107 52,07 64,69 66,72 68,35 68,35 Bảng 3.11 cho thấy, tăng nồng độ rỉ đường lên 190 g/l, độ cồn cao thu 8,4 %v/v bình lên men số Mặc dù lượng đường sót bình 43,4 g/l không đủ cung cấp lượng đường cần thiết cho nấm men sinh trưởng chuyển hóa thành cồn Tại bình thu sản phẩm F5, hiệu suất lên men đạt 68,35 % Bảng 3.12 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 210 g/l Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 5,8 6,4 7,5 8,7 8,7 124,32 75,41 67,65 31,94 28,75 4,5 4,5 4,4 4,4 4,4 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 4,26 x 108 3,24 x 108 1,90 x 108 8,12 x 107 1,72 x 108 1,09 x 108 7,22 x 107 3,08 x 107 42,65 47,06 55,15 63,97 63,97 Bảng 3.12 cho thấy, độ cồn thu bình F5 tiếp tục tăng lên 8,7 %v/v nồng độ chất 210 g/l Mật độ tế bào nấm men cố định hạt gel alginat tăng lượng tế bào sống lẫn tế bào chết Ở bình lên men cuối F4, mật độ tế bào sống đạt 8,12 x 107 CFU/g, tế bào chết 9,08 x 107 CFU/g Hiệu suất lên men bình thu sản phẩm đạt 63,97 % 40 Bảng 3.13 Khả lên men tế bào cố định ứng với nồng độ chất 230 g/l Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 5,3 7,1 8,2 8,9 8,9 109,52 80,70 67,65 41,82 38,33 4,4 4,4 4,4 4,3 4,3 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 4,58 x 108 4,04 x 108 1,82 x 108 8,42 x 107 1,92 x 108 1,09 x 108 9,10 x 107 2,78 x 107 35,59 47,68 55,07 59,77 59,77 Bảng 3.13 cho thấy, tăng nồng độ mật rỉ lên 230 g/l độ cồn thu tăng thêm 0,2 %v/v, đạt 8,9 %v/v Tuy nhiên hiệu suất lên men lại giảm mạnh, đạt 59,77% Như vậy, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất đến khả tạo cồn hiệu suất lên men tế bào cố định hệ thống lên men liên tục, kết thể hình 3.4 sau Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất đến khả tạo cồn hiệu suất lên men tế bào cố định hệ thống lên men liên tục 41 Có thể nhận thấy rằng, lên men liên tục, tăng nồng độ chất rỉ đường, lượng cồn thu tăng Tuy nhiên xét hiệu suất lên men, tăng nồng độ mật rỉ hiệu suất lên men giảm xuống Cụ thể, nồng độ rỉ đường tăng từ 170 - 210 g/l hiệu suất lên men giảm 5,53 % độ cồn tăng từ 7,2 - 8,7 %v/v; nồng độ rỉ đường tăng từ 170 - 230 g/l hiệu suất lên men giảm 9,73 % độ cồn tăng từ 7,2 8,9 %v/v Như vậy, xét hiệu sử dụng thiết bị tổn thất nhiệt trình chưng cất sau việc lên men nồng độ đường cao kinh tế Do vậy, nồng độ chất khô 26ºBx (tương ứng 210 g/l) lựa chọn cho nghiên cứu 3.5.3 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục Thí nghiệm tiến hành hệ thống lên men liên tục gồm bình lên men nhau, bình tích lít pH ban đầu 5,0 Nhiệt độ lên men 30ºC Tỉ lệ hạt tế bào nấm men cố định/ thể tích bình lên men 30 %w/v Môi trường rỉ đường thay đổi nồng độ 26ºBx (tương ứng 210 g/l) Tốc độ pha loãng thay đổi 0,102; 0,128; 0,154; 0,171 l/l/giờ (tương ứng với tốc độ dòng chảy 1,2; 1,5; 1,8; 2,0 ml/phút Theo dõi trình lên men (trong ngày sau dòng dịch nuôi cấy ra), kết trình bày bảng 3.14, 3.15, 3.16 3.17 Bảng 3.14 Khả lên men tế bào cố định ứng với tốc độ pha loãng 0,102 l/l/giờ Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 4,7 7,6 8,1 8,8 8,8 124,32 75,41 67,65 31,94 28,75 4,4 4,4 4,4 4,3 4,3 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 2,26 x 108 4,24 x 108 2,86 x 108 8,12 x 107 1,72 x 108 1,09 x 108 9,55 x 107 9,08 x 107 34,56 55,88 59,56 64,71 64,71 Ở tốc độ pha loãng này, độ cồn cao đạt 8,8 %v/v ứng với hiệu suất lên men đạt 64,71 % Tuy vậy, tốc độ pha loãng nhỏ khiến sản lượng cồn thu 42 thấp Chính vậy, nên lựa chọn tốc độ pha loãng thích hợp để đảm bảo hiệu sử dụng thiết bị hiệu suất chuyển hóa đường thành cồn Tiếp tục tiến hành lên men tốc độ pha loãng lớn hơn, kết sau Bảng 3.15 Khả lên men tế bào cố định ứng với tốc độ pha loãng 0,128 l/l/giờ Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 5,8 6,4 7,5 8,7 8,7 115,00 88,46 75,41 47,92 38,33 4,4 4,4 4,4 4,3 4,3 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 3,86 x 108 3,24 x 108 1,86 x 108 8,24 x 107 1,40 x 108 1,12 x 108 8,05 x 107 4,18 x 107 42,65 47,06 55,15 64,71 64,71 Bảng 3.16 Khả lên men tế bào cố định ứng với tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 3,9 7,5 8,0 8,7 8,7 138,55 61,33 54,12 41,82 38,33 4,4 4,4 4,4 4,3 4,3 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 4,02 x 108 3,52 x 108 1,95 x 108 8,72 x 107 1,52 x 108 1,09 x 108 6,22 x 107 3,08 x 107 28,68 55,15 58,82 63,97 63,97 Bảng 3.17 Khả lên men tế bào cố định ứng với tốc độ pha loãng 0,171 l/l/giờ Bình lên men F1 F2 F3 F4 F5 Cồn (%v/v) Đường sót (g/l) pH 3,6 6,2 7,0 7,8 7,8 140,24 83,64 74,19 41,82 38,33 4,5 4,5 4,5 4,4 4,4 Lượng tế bào nấm men sống (CFU/g) Lượng tế bào nấm men bị chết (CFU/g) Hiệu suất lên men (%) 3,40 x 108 3,20 x 108 1,67 x 108 9,62 x 107 1,32 x 108 1,29 x 108 7,60 x 107 3,88 x 107 26,47 45,59 51,47 57,35 57,35 43 Kết bảng 3.15, 3.16 3.17 cho thấy, tăng tốc độ pha loãng lên 0,128 0,154 l/l/giờ, độ cồn cao đạt nhau, đạt 8,7 %v/v không thấp đáng kể so với lên men với tốc độ pha loãng 0,102 l/l/giờ Khi tốc độ pha loãng tăng lên 0,171 l/l/giờ độ cồn thu giảm hẳn xuống 7,8 %v/v Để lựa chọn tốc độ pha loãng thích hợp, cần vào sản lượng cồn thu Kết thể hình 3.5 Hình 3.5 Ảnh hưởng tốc độ pha loãng đến sản lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục So sánh sản lượng cồn thu nhận thấy, độ cồn đạt cao tốc độ pha loãng 0,102 l/l/giờ sản lượng cồn thu thấp hẳn so với tốc độ pha loãng khác Sản lượng cồn cao đạt 13,42 độ/l/giờ tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ Vì vậy, tốc độ pha loãng lựa chọn cho thí nghiệm 3.5.4 Nghiên cứu ổn định trình tạo cồn bình thu sản phẩm F5 theo thời gian hệ thống lên men liên tục Thí nghiệm tiến hành hệ thống lên men liên tục gồm bình lên men nhau, bình tích lít pH ban đầu 5,0 Nồng độ chất rỉ đường đạt 26ºBx (tương ứng 210 g/l) Nhiệt độ lên men 30ºC Tỉ lệ hạt tế bào nấm men cố định/thể tích bình lên men 30 %w/v Tốc độ pha loãng 0,154 l/l/giờ Theo dõi ổn 44 định độ cồn đạt b ình thu F5 theo thời gian Kết trình bày hình 3.6 Hình 3.6 Thời gian ổn định lượng cồn thu hệ thống lên men liên tục Nhận thấy, độ cồn thu 8,7 %v/v ổn định ngày đầu (sau dòng dịch nuôi cấy khỏi thiết bị) Sau đó, độ cồn giảm xuống 8,6 - 8,5 %v/v ngày Đến ngày thứ 16, độ cồn thu lại trì tương đối ổn định mức 8,7 %v/v Trong suốt trình lên men, pH lượng đường sót ổn định (pH dao động từ 4,3 - 4,4 đường sót khoảng 34,20 - 36,89 g/l) Sở dĩ độ cồn thu thay đổi nguồn chất rỉ đường cấp vào Nhìn chung, lượng cồn thu ổn định khoảng thời gian 31 ngày Trong trình lên men, phát triển tế bào nấm men cố định gel alginat chụp ảnh quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kết thể hình 3.7 3.8 45 3.7.a 3.7.b 3.7.c Hình 3.7 Hình ảnh tế bào nấm men cố định hạt gel canxi alginat chu kỳ lên men 3.7.a Hạt gel canxi alginat trước lên men 3.7.b Hạt gel canxi alginat trình lên men 3.7.c Hạt gel canxi alginat cuối chu kỳ lên men Nhận thấy, hạt gel canxi alginat bị teo nhỏ theo thời gian lên men Điều ảnh hưởng đến cấu trúc, xếp tế bào nấm men bên hạt gel Để hiểu rõ phân bố tế bào nấm men bên hạt, tiến hành quan sát cấu trúc bên hạt gel kính hiển vi điện tử quét (SEM) Nhận thấy, đường kính trung bình tế bao nấm men S cerevisiae CNTP 7028 khoảng 7,7 µm, mật độ tế bào cố định gel canxi alginat khoảng 6,12 x 107 CFU/g hạt Trong giai đoạn trình lên men, nấm men sinh trưởng phát triển đạt 7,6 x 108 CFU/g hạt, số lượng tế bào nấm men bị chết 3,2 x 107 CFU/g Thời kỳ cuối chu kỳ lên men, tế bào nấm men bị chết nhiều, cấu trúc gel canxi alginat lỏng lẻo, tạo thành nhiều mảnh vỡ Điều khiến tế bào nấm men dễ bị thoát theo dòng dịch Đây có lẽ nguyên nhân khiến độ cồn thu giảm dần theo thời gian 46 3.8.a 3.8.b 3.8.c Hình 3.8 Sự phát triển tế bào nấm men S cerevisiae CNTP 7028 hạt gel alginat chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) giai đoạn lên men khác 3.8.a Tế bào nấm men trước đưa vào lên men (Độ phóng đại 750, 1000, 2000) 3.8.b Tế bào nấm men chu kỳ lên men (Độ phóng đại 750, 1000, 2000) 3.8.c Tế bào nấm men cuối chu kỳ lên men (Độ phóng đại 750, 1000, 2000) 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã chọn chủng nấm men chịu nhiệt chất sát khuẩn thích hợp cho lên men cồn Saccharomyces cerevisiae ký hiệu CNTP 7028 Đã chọn phương pháp xử lý rỉ đường thích hợp là: Rỉ đường ban đầu pha loãng lần xử lý axit pH 3,5 sau gia nhiệt cách đun sôi 30 phút Sau đó, dịch xử lý làm lạnh để lắng Gạn lấy phần dịch để làm môi trường lên men Nghiên cứu trình lên men liên tục sản xuất cồn từ rỉ đường mía tế bào cố định, lựa chọn chế độ thích hợp với thông số sau: - Nồng độ đường thích hợp cho lên men liên tục 210 g/l - Tốc độ pha loãng phù hợp lên men liên tục 0,154 l/l/giờ - Tỉ lệ hạt tế bào cố định đưa vào bình lên men liên tục 30 %w/v - Độ cồn đạt lên men liên tục 8,7 %v/v - Quá trình lên men liên tục ổn định khoảng thời gian 31 ngày KIẾN NGHỊ Trong trình lên men liên tục, nhận thấy hạt tế bào cố định sau thời gian sử dụng bị teo nhỏ nhiều bị cặn rỉ đường bám dính, ảnh hưởng đến khả lên men Chính thế, cần tiếp tục nghiên cứu khả năng, thời điểm phương pháp hoạt hóa tế bào cố định để chu kỳ lên men kéo dài 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Hồng Hạnh, Phùng Anh Tiến (2009), “Năng lượng giới tới năm 2030”, Tổng luận Khoa học công nghệ, 66 (11), tr 33 - 46 Nguyễn Ninh (1992), “Nghiên cứu sử dụng cồn etylic động Zil - 130”, Tạp chí hoạt động khoa học, (2), tr 26 - 32 Lương Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Hoàng Văn Thông (2005), “Nhiên liệu sinh học - Nguồn lượng quan trọng tương lai”, Thông tin Kinh tế Công nghiệp hóa chất, 35 (3), tr 55 - 68 Nguyễn Như Thiện (2003), “Nghiên cứu trình lên men liên tục sản xuất cồn từ rỉ đường mía”, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia, Hà Nội Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2005), Công nghệ sản xuất cồn kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lê Ngọc Tú, Trần Thị Ân (1976), Giáo trình sinh hóa đại cương, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh: Bayrock D and Michael Ingledew (2001), “Application of multistage continuous fermentation for production of fuel alcohol by very - high - gravity fermentation technology”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnologgy 27, pp 87 93 10 Denis D.G., Mater Barbotin Jean Noel (1995), “Effect of gelation temperature and gel-dissolving solution on cell viability and recovery of two Pseudomonas putida 49 strains co-immobilizied within calcium alginat or κ-carrageenan gel bead”, Biotechnology techniques, Volumn No.10, pp 747 - 752 11 Mai N.D., Dong T.T (2008), “Use of immobilized yeast cell in alcohol fermatation from molasses”, Science and Technology Development, Vol 11, No 09, pp 90 - 99 12 Gilson C D and Thomas A (1995), “Ethanol production by alginat immobilized yeast in a fluidized bed bioreactor”, Journal of Chemiscal Technology and Biotechnology 62, pp 38 - 45 13 Goksungur Y., Zorlu N.(2001), “Production of ethanol from beet molasses by CaAlginat immobilized yeast cells in a packed-bed bioreator”, Turk Journal of Biotechnology 25, pp 265 - 275 14 Kangama C O., Rumei X (2005), “Production of crystal sugar and alcohol from sweet sorghum”, African Journal of Food Agriculture and Nutritional Development, (2), pp 673 - 679 15 Koizumi T.(2003), “The Braxinian ethanol programme: impact on world ethanol and sugar markets”, Fao commodity and trade policy research working paper 1, pp - 16 Lin Y., Tanaka S (2006), “Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects”, Application of Microbiology and Biotechnology 69, pp 627 642 17 Molek I., “Continious cultivation of microorganisms”, Proc 4th sysposium held in Prague, June 1968 18 Nagashima M., Azuma M., Noguchi S., Inuzuka K.(1984), “Continuous ethanol fermentation using immobilized yeast cell”, Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, pp 992 - 997 19 Palmqvist E., Galbe M., Hahn Hagerdal B (1998), “Evalution of cell recycling in continuous fermentation of enzymatic hydrolysates of spruce Sacchromyces cerevisiae and on-line monitoring of glucose and ethanol”, Application of Microbiology and Biotechnology 50, pp 545 - 551 50 20 Peiter J V., Schutter D P., Delvaux F., Kevin J V (2006), “Immobilized yeast cell systems for continuous fermentation applications”, Biotechnology Letter 28, pp 1515 - 1525 21 Sanches E N., Alhadeff E M., Rocha-Leao M H M and Pereira Jr N (1996), “Performance of a continuous bioreactor with immobilized yeast cells in the ethanol fermentation of molasses-stillage medium”, Biotechnology Letter 18, pp 91 - 94 22 Sheoran A., Yaday B S., Nigam P and Singh D (1998), “Continuous ethanol production from sugarcane molasses using a column reactor of immobilized Sacchromyces cerevisiae HAU-1”, Journal of Basic Microbiology 38, pp 123 128 23 Taylor F., Kurantz M J., Goldberg N., Craig Jr J C (1997), “Effects of ethanol concentration and stripping temperature on continuous fermentation rate”, Application of Microbiology and Biotechnology 48, pp 311 - 316 24 Wendhausen R., Fregonesi A., Moran P J S., Joekes I., Augusto J A R., Tonella E and Althoff K (2001), “Continuous fermentation of sugar cane syrup using immobilized yeast cells”, Journal of Bioscience and Bioengineering 91, pp 48 52 25 Wheals A E., Basso L C., Alvesand D M G and Amorim H V (1999), “Fuel ethanol after 25 years”, Trends in Biotechnol 17, pp 482 - 487 26 Wieczorek A and Michalski H (1994), “Continuous ethanol production by flocculating yeast in the fluidized bed bioreator”, FEMS Microbiology Review 14, pp 69 - 74 27 Yu J., Zhang X., Tan T (2007), “An novel immobilization method of Sacchromyces cerevisiae to sorghum bagasses for ethanol production”, Journal of Biotechnology 129, pp 415 - 420 Internet: 28 http://www.ecchcm.gov.vn/?menu=81&submenu=81&detail=270&language 51 29 http://www.sinhhocvietnam.com/vn 30 http://www.thanhnien.com.vn/News/0109/Pages/200903/20090117001804.aspx 31 http://www.tietkiemnangluong.com.vn/show.asp?cat=008002&item=5067 32 http://www.washingtonpost.com/wpdyn/content/article/2007/02/07/AR2007020702316.html 33 http://www.cuocsongviet.com.vn/index.asp?act=detail&mabv=7944&/Braxincuong-quoc-xuat-khau-con-nhien-lieu.csv 34 http://www.cuocsongviet.com.vn/index.asp?act=detail&mabv=7944&/Braxincuong-quoc-xuat-khau-con-nhien-lieu.csv 35 http://www.marketresearchanalyst.com/2008/01/26/world-ethanol-productionforecast-2008-2012/ 52 PHỤ LỤC Hình ảnh tạo hạt gel alginat cố định tế bào nấm men S cerevisiae CNTP 7028: Hình ảnh hệ thống lên men liên tục phòng thí nghiệm: 53 ... Nghiên cứu công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường tế bào cố định theo phương pháp lên men liên tục thực Mục đích đề tài Xây dựng công nghệ sản xuất cồn từ rỉ đường tế bào cố định hệ thống lên men. .. TỈ LỆ TẾ BÀO CỐ ĐỊNH/DỊCH LÊN MEN 34 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CỒN TỪ RỈ ĐƯỜNG MÍA BẰNG TẾ BÀO CỐ ĐỊNH TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN LIÊN TỤC 35 3.5.1 Ảnh hưởng tỉ lệ hạt tế bào cố định/ ... sản xuất cồn Công nghệ sản xuất cồn áp dụng lên men gián đoạn lên men bán liên tục, sử dụng tế bào tự Sản lượng cồn tạo đáp ứng phần nhu cầu thị trường [5] Trong năm gần đây, công nghệ lên men cồn