sắc ký lọc gel và ứng dụng

 SẮC KÝ LỌC GEL GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ) GIỚI THIỆU: I Sắc kí gel dùng để tách phân tử dựa khác kích thước phân tử Những phân tử không bị giữ lại liên kết hóa học nên thành phần dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution) Sắc kí gel phù hợp với phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt Hình I.1 Sắc ký gel Hạt gel hình cầu Mẫu đưa vào cột Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột Phân tử khuếch tán vào khỏi lỗ xốp, phân tử nhỏ vào sâu lỗ xốp bị giữ lại lâu 4 Pha động qua cột liên tục, phân tử lớn chui vào lỗ xốp nên khỏi cột trước Những phân tử nhỏ khuếch tán vào khỏi lỗ xốp nên khỏi cột sau Quá trình phân tách phương pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed) Đệm mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học trơ Lớp gel cân với dung dịch qua (buffer) Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp khoảng không hạt Chất lỏng bên lỗ xốp xem pha tĩnh chất lỏng bên xem pha động II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL: II.1 Đặc điểm trình: Kết trình sắc kí gel thường biểu diễn giản đổ giải li hay phổ đồ sắc kí cho thấy khác nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ tia UV vùng 280 nm) thành phần mẫu chúng giải li khỏi cột dựa trật tự kích thước phân tử Trên giản đồ chia làm loại phân tử Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà giải li thẳng khỏi cột với tốc độ dòng lưu chất pha động (buffer) thể tích Vo (xét đơn vị thể tích cột), gọi thể tích khoảng trống (void volume) Những phân tử có phần vào mạng lưới đệm silicagel, giải li khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ trước Và lại phân tử giữ hoàn toàn mạng lưới lỗ xốp khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt (total column volume) pha động qua cột Hình II.1 Phổ đồ sắc ký Trạng thái cấu tử biểu diễn liên quan đến thể tích giải li chúng, V e (elution volume) đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí Có cách để xác định V e: Khi thể tích mẫu nhỏ so với thể tích lớp đệm Ve xác định từ vị trí ban đầu mẫu đến vị trí cao mũi sắc kí Khi thể tích mẫu lớn, bỏ qua so với thể tích lớp đệm Ve xác định từ vị trí thể tích mẫu đến vị trí cao mũi sắc kí Khi thể tích mẫu lớn, tạo nên mũi sắc kí có vùng phẳng ngang, thể tích Ve xác định từ vị trí bắt đầu mẫu đến vị trí điểm uốn phần tăng lên mũi giải li Hình II.2 Cách xác định thể tích giải li Ve Bởi mũi đối xứng phổ biến sắc kí gel, Ve dễ dàng xác định Tuy nhiên Ve không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển cấu tử qua cột Ve thay đổi phụ thuộc vào Vt tổng thể tích lớp đệm cách nhồi cột Sự giải li mẫu đặc trưng hệ số phân bố Kd Kd = = Kd đặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy khuếch tán loại phân tử khác Vo thể tích khoảng trống, thể tích phân tử pha động không chui vào mạng lưới lỗ xốp kích thước lớn di chuyển thẳng qua cột thể tích pha động (buffer) Cột nhồi tốt thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột Vs thể tích pha tĩnh Vi thể tích pha động bên mạng lưới (chỉ chứa phân tử kích thước nhỏ) Trong thực tế Vi khó xác định phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), để thuận tiện Vi thay Vt - Vo Hình II.3 Biểu đồ thể V0 Vt Do thay Vi Vt - Vo, ta có giá trị Kav, không thực với giá trị hệ số phân bố Kd Nhưng loại gel riêng có tỉ lệ Kav:Kd, tỉ lệ không phụ thuộc chất nồng độ mẫu Kav = II.2 Đường cong chọn lọc lựa chọn phương pháp: Hệ số phân bố Kav liên quan đến kích thước phân tử Tỉ trọng kích thước giống phân tử mô tả mối quan hệ giá trị Kav log Mr (khối lượng phân tử) Trên vùng xem xét mối quan hệ đường thẳng Chọn lựa phương pháp sắc kí gel phụ thuộc hoàn toàn vào phân bố kích thước lỗ xốp mô tả đường cong chọn lọc Bằng cách vẽ đường cong qua điểm giá trị Kav ứng với log Mr protein chuẩn xây dựng đường cong chọn lọc Hình II.4: Đường cong chọn lọc superdex 30, Superdex 75, Superdex 200 Phương pháp lọc gel chọn lựa cho khối lượng phân tử lớn giải li thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng thời gian tối thiểu Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ giải li gần giá trị Vt (Kav = 1) + Nếu Kav > 1, phân tử bị mắc kẹt mạng lưới gel kích thước nhỏ (Ve > Vt) + Nếu Kav < 0, cột xuất kênh, rãnh mà phân tử chảy tắt qua cột (Ve < Vo) II.3 Độ giải li: Độ giải li cho biết độ phân tách mũi, chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố tỉ lệ thể tích mẫu thể tích cột, tốc độ dòng, thông số cột, kích thước hạt, phân bố kích thước hạt, tỉ trọng lớp đệm, độ xốp hạt, độ nhớ t pha động Hiệu trình sắc kí gel phụ thuộc vào chủ yếu vào điều kiện lựa chọn cho độ chọn lọc hợp lí tránh mũi giản rộng trình phân tách Độ giải li xác định biểu thức: Rs = + Vr1 Vr2 thể tích giải li mũi gần + W1 W2 độ rộng tương đối mũi Hình II.5: Thông số sử dụng để xác định độ giải li li lọc phương pháp hiệu phương pháp tạo mũi hẹp Độ giải hàm độ chọn Hình II.6: Sự phụ thuộc độ giải li vào độ chọn lọc độ rộng mũi Hiệu c ủ a cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo mũi hẹp đối xứng trình giải li xác định dựa số đĩa lý thuyết đơn vị chiều dài (N): N = 5.54(Ve/W1/2)2 x 1000/L Trong đó: + Ve: thể tích mũi giải li + W1/2: chiều rộng mũi nửa chiều cao mũi + L: chiều cao đệm Hiệu cải thiện cách giảm kích thước hạt, nhiên kích thước hạt nhỏ tạo trở lực lớn tốc độ dòng giảm, dẫn đến thời gian tiến hành kéo dài Độ đồng lớp đệm hạt nhồi ảnh hưởng đến độ đồng dòng chảy qua cột ảnh hưởng đến hình dạng độ rộng mũi Thiết bị sắc kí gel với độ đồng cao cho mũi giải li hẹp Loại sắc kí gel với kích thước hạt nhỏ tạo điều kiện cho phân tử dễ dàng khuếch tán vào khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân pha động pha tĩnh, cải thiện độ giải li giảm chiều rộng mũi Sự pha loãng mẫu tránh khỏi mẫu qua cột trình khuếch tán xảy Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu sử dụng thể tích mẫu tối đa giới hạn khoảng cách phân tách Nếu vùng giản rộng thể tích tối đa mẫu lớn thể tích phân tách: VSep = VeB - VeA Tuy nhiên, dòng khuếch tán xoáy, không cân pha tĩnh pha động, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên có vùng giản rộng Vì thể tích mẫu nhỏ thể tích phân tách III PHÂN LOẠI GEL Việc tách sắc ký gel tùy vào đặc điểm lỗ rỗng hệ mạng không gian ba chiều.hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ mặt hóa học, bền mặt học, lỗ rỗng tong hạt gel phải có hình dạng đồng Mỗi loại gel có khả xác định việc tách loại trọng lượng phân tử , tùy thuộc vào kích thước lỗ rỗng hạt gel.các loại gel thương mại thường không chịu tính acid hay base mạnh , lỗ rỗng không lớn làm giảm độ bền học Có hai loại nguyên liệu để tạo gel la xerogel acrogel Xerogel loại gel cổ điển , polimer tạo mạng ngang ,khi cho tiếp xúc với dung môi , gel trương nở để trở thành mạng gel với lỗ rỗng tương đối mềm.Trong hệ gel lỗ rỗng khoảng trống chuỗi dây hệ thống mạng Nếu dung môi loại khỏi hệ thống mạng ,cấu trúc gel bị xụp đỗ ,nếu cho dung môi trở lại ,đôi khôi phục lại hệ mạng Ngược lại aerogel nguyên liệu rắn gel , thí dụ thủy tinh có lỗ rỗng silica có lỗ rỗng Đó nguyên liệu rắn có lỗ rỗng , dung môi chui vào lỗ rỗng ,nếu dung môi loại khỏi hệ thống mạng , cấu trúc gel không bị sụp đỗ Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố: + Mục tiêu thí nghiệm (phân tích độ phân giải cao hay tách thành nhóm hợp chất) + Khối lượng phân tử protein mục tiêu chất bẩn Trên thị trường có nhóm thông dụng Superdex,Sephacryl, Superose Sphadex Sphadex LH-20 III.1 Superdex Superdex lựa chọn cho độ giải li cao,thời gian ngắn độ thu hồi cao Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp ,Superdex loại gel lựa chọn cho độ giải li cao với thời gian ngắn độ thu hồi tốt Superdex loại composite dựa liên kết ngang hạt rỗng agarose đến mạng dextran liên kết cộng hóa trị Nó có độ bền hóa học cao mạng agarose liên kết ngang có tính chất lọc gel tốt cho chuỗi dextran Độ bền học Superdex cho phép dung môi giải li có độ nhớt cao urea 8M chảy qua Loại gel chịu đựng tốc độ dòng cao suốt trình ổn định hay lúc rửa cột Tính bền giúp loại Superdex phù hợp cho sử dụng công nghiệp với tốc độ dòng cao, nhanh hiệu làm tai chỗ Những tương tác protein gel Superdex bỏ qua sử dụng dung môi với cường độ ion khoảng 0.15 M đến 1.5 M Superdex sản xuất vớt hai loại kích thước hạt với độ chọn lọc khác (Superdex Peptide , superdex 30, Superdex 75, Superdex 200) Sử dụng cột nhồi sẵn hạt kích thước 13 Superdex Peptide, Superdex 30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ Sử dụng cột nhồi sẵn hạt kích thước 34 Superdex perep grade cho qui mô công nghiệp Khi khối lượng protein quan tâm nên bắt đầu với Superdex 200 Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng thể đơn dòng từ ddimerr từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp III.2 Sephacryl Sephacryl lựa chọn cho phân tách nhanh, độ thu hồi cao phòng thí nghiệm qui mô công nghiệp Sephacryl Superdex High Resolution (HR) thay cho superdex prep grade ướng dụng đòi hỏi khoảng tuông đối rộng ,độ bền hóa học chịu tốc độ dòng cao cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng công nghiệp Sephacryl HR loại composite hình thành liên kết ngang cộng hóa trị allyl dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền học cao Lỗ xốp gel xác định thành phần dextran điều khiển để đem lại độ chọn lọc khác Độ bền học Sephacryl HR cho phép dung môi có độ nhớt cao chảy qua Sepacryl S-100 Hrcho hiệu suất 96% cho việc tách chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, lactoglobulin A+B, chymotrypsinogen A, myoglobin, lysozyme, ribonuclease A cytochrome C , cường độ tối thiểu ion nên sử dụng 0,15 M III.3.Superose Superose dùng khoảng khối lượng phân tử rộng không phù hợp cho phân tách qui mô công nghiệp Superose loại gel bền vật lí hóa học cao, hình thành dựa liên kết ngang phân tử lỗ xốp agarose Một vài tương tác kị nước với gel làm cho phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins lipoproteins giải li chậm dự đoán Tuy nhiên, vài ứng dụng , tương tác giúp làm tăng độ giải li trình phân tách III.4.Sephadex Sephadex dùng để tách nhanh nhóm có khối lượng phân tử nhỏ , khử muối, đổi dạng dung môi làm mẫu Sephadex tạo thành liên kết ngang dextran với epichlorohydrin Những loại khác Sephadex mức độ khác liên kết ngang có mức độ trương nở độ chọn lọc khác cho kích thước phân tử đăc trưng III.5.Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 sản xuất dành riêng cho việc phân tách tinh chế hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi có mặt dung môi hữu để trì độ bền chúng Các hợp chất tự nhiên steroids, lipids peptides có khối lượng phân tư thấp ( khoảng 35 amino acids) Các hợp chất thường phân tách sắc kí phân chia lỏng/lỏng hay sắc kí hấp thu Sephadex LH-20có độ chọn lọc cao cho hợp chất có vòng thơm (aromatic) Nó sư dụng phân tích qui mô công nghiệp để phân tách nhóm chất có tính chất tương tự Sephadex LH-20 tạo nên từ chuỗi hydroxypropylated dextran mà có liên kết ngang đến mạng lưới polysacharide Loại costheer trương nở nước dung môi hữu Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước tinh chế với độ tinh khiết cao sắc kí tao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đồng phân không đối quang (diastereoisomers) Sephadex LH-20có thể tách cấu tử phân chia mạng gel dung môi hữu Gel Sephadex LH-20 có tính ưu nước kị nước IV ỨNG DỤNG Ứng dụng phương pháp sắc kí gel • Tách loại bỏ nhóm phân tử (Group separation) Loại bỏ phân tử nhỏ muối, protein đánh dấu khỏi nhóm phân tử lớn Thường sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối đổi dung môi Sephadex G-10, G-25, G-50 sử dụng cho nhóm • Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation) Phân tách nhiều cấu tử mẫu dựa khác kích thước Mục đích phân lập nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử phân tích phân bố khối lượng mẫu Phù hợp cho bước tách cuối việc tinh chế Monomer tách khỏi tủa mẫu thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay trữ IV.1 Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein Sự thẩm tách (Dialysis) kỹ thuật thường sử dụng việc loại bỏ muối hay phân tử nhỏ thay đổi dung môi Tuy thẩm tách xảy chậm, đòi hỏi lượng dung môi lớn có nhiều khả làm mẫu trình tiến hành, hay đứt gãy protein bị phân giải liên kết khó kiểm soát mẫu màng thẩm tách Một kỹ thuật đơn giản nhanh sử dụng cột sắc kí gel để phân tách dựa khác biệt khối lượng phân tử để loại bỏ muối phân tử nhỏ Cột nhồi với SephadexTM G-25 Chỉ bước, mẫu loại bỏ muối, phân tử nhỏ đổi dung môi Thể tích mẫu cần loại muối lên tới 30% tổng thể tích cột Tốc độ suất cao phương pháp cho phép thể tích mẫu lớn tiến hành nhanh hiệu Để loại muối cho lượng mẫu lớn sử dụng nhiều cột bán sẵn HiTrap Desalting hay HiPrep 26/10 Desalting Ví dụ: + cột HiTrap Desalting thể tích mẫu sử dụng ml hay cột thể tích mẫu lên tới 7,5 ml + cột HiPrep 26/10 Desalting thể tích mẫu sử dụng 60 ml thời gian tiến hành 20 – 30 phút Quá trình khử muối đổi dung môi thường tốn khoảng phút mẫu với 95% mẫu thu hồi (đối với hầu hết protein) Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl dung môi để chống lại tương tác ion Nồng độ mẫu không ảnh hưởng trình phân tách miễn nồng độ protein không vượt 70 mg/ml sử dụng dung môi có nước thông thường Mẫu nên hòa tan hoàn toàn, ly tâm lọc bỏ phần rắn sót Ví dụ trình khử muối: Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6 + Mẫu khử muối cột HiTrap Desalting ml với chương trình AKTA prime cài đặt sẵn + Dung môi giải li sodium photsophate 20 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0 + Tính hiệu đầu protein xác định tia UV (280 nm) tín hiệu đầu chỗi xác định độ dãn điện Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu + Mẫu 20 mg/ml BSA 50 mM sodium photsphate, 0,5 M sodium phloride, pH 7,0 + Sử dụng cột khử muối HiTrap Desalting (5 ml), sử dụng 1,3,5 cột để tăng thể tích mẫu + Dung mối giải li sodium photsphate 50 mM, sodium chloride 0,5 M, pH 7,0 + Tốc độ dòng ml/phút + Tín hiệu đầu protein xác định tia UV (280 nm) tín hiệu tín hiệu đầu muối xác định độ dẫn điện Hình IV.3 Quá trình scale up ghép nối tiếp nhiều cột cho ứng dụng khử muối IV.2 Sắc kí gel chiến lược tinh chế Để tinh chế mức độ cao hay không tìm phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế giai đoạn cột lực, phương pháp nhiều giai đoạn hiệu phát triển để sử dụng cho trình tinh chế Nó bao gồm bắt giữ (Capture), tinh chế trung gian (Intermediate Purication) tinh chế mức độ cao (Polishing), phương pháp gọi tắc CIPP CIPP sử dụng cho công nghệ dược nghiên cứu phòng thí nghiệm để đảm bảo phát triển phương pháp nhanh, hiệu chất lượng cao Bắt giữ (Capture): mục tiêu cô lập làm tăng nồng độ làm bền sản phẩm cần tinh chế Tinh chế trung gian (Intermediate): loại bỏ chất bẩn lớn protein, acids nucleic, endotoxins viruses Tinh chế mức độ cao (Polishing): Ở giai đoạn vết bẩn loại bỏ, lại chất lỏng dạng vết hay có tính chất gần giống với chất Mục tiêu giai đoạn thu chất lỏng hoàn toàn tinh khiết cách loại bỏ hoàn toàn vết bẩn lại Trong sắc kí gel sử dụng việc khử muối đổi dung môi trình chuẩn bị mẫu trình bày sử dụng cho giai đoạn tinh chế mức độ cao • Lựa chọn kết hợp kỹ thuật tinh chế Năng suất (Capaciti): liên quan đến lượng mẫu sử lí tinh chế Trong số trường hợp lượng mẫu giới hạn tính thể tichs phương pháp sắc kí gel hay lượng chất bẩn nhiều lượng mẫu Tốc độ (Speed): quan trọng thời điểm bắt đầu tinh chế, chất bẩn proteases phải loại bỏ nhanh Thu hồi (Recovery): khả thu hồi bị ảnh hưởng đến điều kiện hoạt động thiết bị làm phá vỡ cấu trúc mẫu Là yêu cầu quan trọng, làm tăng giá trị sản phẩm tinh chế Độ giải li (Resolution): đạt nhờ vào việc lựa chọn kĩ thuật hiệu trình sắc kí Độ giải li thường khó đạt yêu cầu bước cuối tính chất mẫu tạp chất gần giống Lựa chọn phương pháp đáp ứng mục tiêu cho giai đoạn tinh chế Chọn lựa kết hợp phương pháp với dựa ưu điểm phương pháp điều kiện mẫu thời điểm ban đầu kết thúc Lượng mẫu tối thiểu xử lí phải bước tinh chế để tránh yêu cầu điều kiện mẫu không phù hợp bước xử lí Sản phẩm giải li cột phải điều kiện phù hợp cho việc xử lí cột Ammonium sulfate thường sử dụng cho việc làm tăng nồng độ mẫu để mẫu môi trường nồng độ muối cao Do nên chọn HIC giai đoạn bắt giữ HIC đòi hỏi lượng muối cao để tăng liên kết với đệm, nồng độ muối tổng thể tích mẫu giảm đáng kể sau giải li khỏi HIC pha loãng phân đoạn mẫu hay đổi dung môi dùng cột sắc kí gel (khử muối) trước cho vào cột IEX AC Sắc kí gel liên kết chất mạng lướ gel, không bị ảng hưởng điều kiện dung môi, bị hạn chế thể tích mẫu Sắc kí gel phù hợp cho viếc sử dụng sau kĩ thuật làm tăng nồng độ IEX, HIC, AC protein mục tiêu giải li với thể tích giảm thành phần từ dung môi không ảnh hưởng trình lọc gel Ở bước bắc giữ, nên lựa chọn kỹ thuật có liên kết hiệu với protein mục tiêu liên ket với chất bẩn Một mẫu tinh chế cần kết nối kĩ thuật có nhiều phương án lựa chọn Ví dụ chiến lược IEX-HIC-GF , giai đoạn bắt giữ lựa chọn theo khác điện tích (IEX), giai đoạn tinh chế trung gian dựa khác tính kị nước (HIC), giai đoạn tinh chế cuối dựa sưh khác kích thước (GF) • Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối Hầu hết phân tách dựa điện tích, tính kị nước, hay lực hóa học sử dụng cho giai đoạn trước bước cuối chiến lược CIPP để phương pháp sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối Sản phẩm tinh chế dổi dung môi rong bước dimer kết tủa loại bỏ Sắc kí gel kĩ thuật sắc kí chậm kích thước cột xác định thể tích mẫu Việc sử dụng sắc kí gel sau kĩ thuật khác phần để giảm thể tích mẫu để coa thể sử dụng cột kích thước nhỏ Loại gel cho bước thường dung Superdex • Tinh chế kháng thể đơn dòng humainised IgG4 theo kỹ thuật CIPP Humainesed IgG4 lấy từ nuôi cấy tế bào u tủy tinh chế kết hợp sắc kí lực lọc gel Kháng thể bắt giữ sắc kí lực sử dụng MabSelect TM.Sắc kí gel cột Superdex 200 prep grade sử dụng để tách monomer từ diner polymer lớn Trên phổ đồ sắc kí ta thấy sau tách mẫu bang sắc kí lực (đường số 3) ta nhận thấy vết IgG4 rõ rang, hoàn toàn tách khỏi vết mẫu ban đầu, khác biệt mẫu sau khỏi cột sắc kí gel (đã tách monomer khỏi dimer) mẫu đường số không rõ rang SDS-PAGE Nhưng giảm thể tích mẫu, vết H-chain đường số đường số ta nhận thấy vết đường số ( giải li khoie cột sắc kí lực) đuôi dơ phía sau kéo theo đường số trở (giải li khỏi cột sắc kí gel) không thấy Điều cho thấy khả tinh chế bước cuối cột sắc kí gel IV.3 Xác định khối lượng phân tử phân tích phân bố khối lượng phân tử Không giống kỹ thuật điện di, sắc kí gel cung cấp phương ơphaps để xác định khối lượng phân tử hay kích thước protein tự nhiên hay protein biến tính điều kiện khác PH,nhiệt độ, lực ion Để xác định khối lượng phân tử, vài mô hình lí thuyết đưa để mô tả trạng thái chất tan trình sắc kí gel Hầu hết mô hình sử dụng phân bố phân tử chất tan hạt gel chất lỏng xung quanh hoàn toàn hiệu ứng không gian Tuy nhiên thực tế hợp chất tương đòng mô tả mối quan hệ hình chữ S thể tích li giải khác chúng logarit khối lượng phân tử chúng Do việc xác định khối lượng phân tử phương pháp sắc kí gel thực cách so sánh thông số thể tích giải li (Vc) hay Kav chất quan tâm với giá trị thu từ chất chuẩn biết trước Đường cong chuẩn xây dựng cách đo tích giải li vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương ứng vẽ giá trị K av tương ứng với logarit khối lương phân tử chúng Khối lượng phân tử chất chưa biết xác định từ đường cong chuẩn đo giá trị Vc tính giá trị Kav chúng Thông số giải li khác V 0, Vc/Vo, Kd sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn giá trị K av thường sử dụng bị ảnh hưởng sai số khác thông số chuẩn bị cột; không đòi hỏi xác định xác giá trị Vi Kd Để xác định khối lượng phân tử xác chất chuẩn phải có mối quan hệ khối lượng phân tử kích thước phân tử chất cần xác định Bộ chuẩn Amersham Biosciences có chất chuẩn protein dạng cầu tốt để xác định khối lượng phân tử protein Độ chuẩn cho sắc kí gel chất khối lượng phân tử nhỏ chứa protein riêng biệt làm khô lạnh với khối lượng phân tử khoảng 13700-67000 Blue Dextran 2000 (Để xác định thể tích V0) Bộ chuẩn cho lọc gel mối quan hệ khối lượng phân tử kích thước phân tử chất cần xác định Bộ chuẩn cho lọc gel chất có khối lượng phân tử lớn chứa protein riêng biệt làm khô lạnh với khối lượng phân tử khoảng 158000 – 669000 Blue Dextran 2000 (để xác định thể tích V0) Nhiều thông số quan trọng ảnh hưởng đến trình xác định khối lượng phân tử + Sử dụng phương pháp vùng khối lượng phân tử phù hợp với phân tử quan tâm Giá trị khối lượng phân tử mong muốn nên rơi vào phần đường thẳng đường chọn lọc + Nên sử dụng cột nhồi sẵn, tự nhồi tsy phải cẩn thận + Sử dụng chất chuẩn nhất, chọn lựa khối lượng phân tử mong muốn đảm bảo nằm vùng chuẩn Luôn bọc Blue Dextran trước sử dụng, sử dụng lượng mẫu 2% nhỏ thể tích cột + Sử dụng độ pah động cho trình sắc kí mẫu chất chuẩn Sử dụng tốc độ dòng đề nghị cột nhồi sẵn + Nếu khối lượng phân tử chưa biết sử dụng phương pháp với khối lượng phân tử khoảng rộng Sephacryl HR + Thực việc xác định khối lượng phân tử từ urea, guanidine hydrochloride hay SDS biến đổi polypeptides protein để duỗi mạch protein tránh cấu trúc xoắn ngẫu nhiên giúp giảm khác cấu trúc protein + Sai lệch tỉ số Kav/logM xảy phân tử quan tâm hình dạng giống chất chuẩn + Cột chuẩn sử dụng thời gian dài miễn cột giữ điều kiện tốt không bị khô TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quốc Khương Anh Luận văn: “ Sắc ký gel ứng dụng” Nguyễn Chí Dũng Luận văn: “ Sắc ký lọc gel” MỤC LỤC I GIỚI THIỆU II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL I.1 Đặc điểm trình .2 I.2 Đường cong chọn lọc lựa chọn phương pháp I.3 Độ giải li III PHÂN LOẠI GEL I.1 Superdex I.2 Sephacyl I.3 Superose I.4 Sephadex I.5 Sephadex LH-20 .9 IV ỨNG DỤNG I.6 Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein 10 I.7 Sắc kí gel chiến lược tinh chế 11 I.8 Xác định khối lượng phân tử phân tích phân bố khối lượng phân tử 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 16 MỤC LỤC 17 ... chuẩn sử dụng thời gian dài miễn cột giữ điều kiện tốt không bị khô TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quốc Khương Anh Luận văn: “ Sắc ký gel ứng dụng Nguyễn Chí Dũng Luận văn: “ Sắc ký lọc gel MỤC... lực lọc gel Kháng thể bắt giữ sắc kí lực sử dụng MabSelect TM .Sắc kí gel cột Superdex 200 prep grade sử dụng để tách monomer từ diner polymer lớn Trên phổ đồ sắc kí ta thấy sau tách mẫu bang sắc. .. dùng cột sắc kí gel (khử muối) trước cho vào cột IEX AC Sắc kí gel liên kết chất mạng lướ gel, không bị ảng hưởng điều kiện dung môi, bị hạn chế thể tích mẫu Sắc kí gel phù hợp cho viếc sử dụng sau