Sắc ký gel và ứng dụng

Bài trình bày về "Sắc ký gel và ứng dụng"

Trang 1

BỘ MÔN HÓA HÓA HỮU CƠ

TIỂU LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

Trang 2

MỤC LỤC

I GIỚI THIỆU 3

II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL 5

II.1 Đặc điểm của quá trình 5

II.2 Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp 8

II.3 Độ giải li 9

III PHÂN LOẠI GEL 11

III.1 Superdex 11

III.2 Sephacryl 13

III.3 Superose 15

III.4 Sephadex 16

III.5 Sephadex LH-20 18

IV ỨNG DỤNG 19

IV.1 Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein 19

IV.2 Sắc ký gel trong chiến lược tinh chế 21

IV.3 Xác định khối lượng phân tử và phân tích sự phân bố khối lượng phân tử 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

Trang 3

Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 3

I GIỚI THIỆU

Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution) Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt

 Quá trình phân tách bằng phương pháp sắc kí gel (gel filtration)

Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed)

Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ

Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer) Dung dịch điền đầy vào mạng lưới

lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt

Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động

1 hạt gel hình cầu

2 mẫu được đưa vào cột 3 Pha động kéo mẫu di

chuyển qua cột Phân tử

sẽ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân

tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn

4 Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên đi ra khỏi cột trước Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau

Hình I.1 Quá trình sắc kí gel

Trang 4

 Ứng dụng của phương pháp sắc kí gel

Tách loại bỏ những nhóm phân tử (Group separation)

Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối, protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử lớn Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi Sephadex G-10, G-25, G-50 được sử dụng cho nhóm này

Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation)

Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng của mẫu

Phù hợp cho bước tách cuối cuối cùng của việc tinh chế Monomer có thể được tách khỏi tủa và mẫu có thể thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dự trữ

Trang 5

II LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL

II.1 Đặc điểm của quá trình

Kết quá của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ

đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật

tự về kích thước phân tử Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích Vo (xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume) Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột

Vt (total column volume) của pha động đi qua cột

Hình II.1 Phổ đồ sắc kí

Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng,

Ve (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí Có 3 cách để xác định Ve:

Khi thể tích của mẫu quá nhỏ

so với thể tích lớp đệm thì Veđược xác định từ vị trí ban đầu của mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc kí

Trang 6

Cách xác định Ve đã được nêu ở trên

Vo là thể tích khoảng trống, chính là thể tích của những phân tử trong pha động không chui vào được mạng lưới lỗ xốp do kích thước lớn và di chuyển thẳng qua cột bằng thể tích của pha động (buffer) Cột được nhồi tốt thì thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột

Vs là thể tích pha tĩnh bằng Vi là thể tích pha động bên trong mạng lưới (chỉ chứa các phân tử kích thước nhỏ) Trong thực tế Vi rất khó xác định do phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), do đó để thuận tiện thì Vi được thay thế bằng Vt – Vo

Khi thể tích của mẫu lớn, không thể bỏ qua so với thể tích lớp đệm thì Ve được xác định từ

vị trí một nữa thể tích mẫu đến

vị trí cao nhất của mũi sắc kí

Khi thể tích mẫu quá lớn, tạo nên mũi sắc kí có vùng phẳng ngang, thể tích Ve được xác định từ vị trí bắt đầu của mẫu đến vị trí của điểm uốn ở phần đang tăng lên của mũi giải li

Trang 7

Do thay Vi bằng Vt – Vo, do đó ta có giá trị Kav, nó không thực sự đúng với giá trị

hệ số phân bố Kd Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giửa Kav:Kd, và tỉ lệ này không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu

Hình II.4 Mối quan hệ giữa các biểu thức đƣợc sử dụng quá trình giải li

Trang 8

II.2 Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp

Hệ số phân bố Kav liên quan đến kích thước của phân tử Tỉ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị Kav và log Mr (khối lượng phân tử) Trên một vùng xem xét thì mối quan hệ này là đường thẳng Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc

Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt (Kav =1)

 Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (Ve > Vt)

 Nếu Kav < 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các phân tử có thể chảy tắt qua cột (Ve < Vo)

Hình II.5 Đường cong chọn lọc của Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade và

Superdex 200 prep grade

Trang 9

II.3 Độ giải li

Độ giải li cho biết độ phân tách giữa các mũi, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tỉ lệ giữa thể tích mẫu và thể tích cột, tốc độ dòng, thông số cột, kích thước hạt, sự phân bố kích thước hạt, tỉ trọng lớp đệm, độ xốp của hạt, độ nhớt của pha động Hiệu quả của quá trình sắc kí gel phụ thuộc vào chủ yếu vào các điều kiện lựa chọn sao cho độ chọn lọc hợp lí và tránh những mũi giản rộng trong quá trình phân tách

Độ giải li được xác định bằng biểu thức:

 Vr1 và Vr2 là thể tích giải li của 2 mũi gần nhau

 W1 và W2 là độ rộng tương đối của mũi

Hình II.6 Thông số đƣợc sử dụng để xác định độ giải li

Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương pháp tạo ra những mũi hẹp

Hình II.7 Sự phụ thuộc của độ giải li vào độ chon lọc và độ rộng của mũi

Trang 10

Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trình giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N):

Loại sắc kí gel với kích thướt hạt nhỏ tạo điều kiện cho các phân tử dễ dàng khuếch tán vào và ra khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân bằng giữa pha động và pha tĩnh, vì vậy cải thiện được độ giải li do giảm chiều rộng mũi

Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán xảy ra Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối

đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách:

VSep = VeB - VeA

Tuy nhiên, do dòng khuếch tán xoáy, sự không cân bằng giữa pha tỉnh và pha động, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên luôn có vùng giản rộng Vì vậy thể tích mẫu luôn nhỏ hơn thể tích phân tách

Hình II.8 Đường cong giải li cho thể tích mẫu khác nhau

Thể tích mẫu nhỏ

Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách nếu không có vùng giản rộng

Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách trong điều kiện thực nghiệm

Trang 11

III PHÂN LOẠI GEL

Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian

ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất

Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại trọng lượng phân tử, tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel Các loại gel thương mại thường không chịu được tính acid hay base quá mạnh, lỗ rỗng không quá lớn vì sẽ làm giảm độ bền cơ học

Có hai loại nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel Xerogel là loại gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng Nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel bị xụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi khi có thể khôi phục lại hệ mạng đó

Ngược lại aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel, thí dụ như thủy tinh có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng Đó là nguyên liệu rắn có lỗ rỗng, dung môi có thể chui vào các lỗ rỗng này, nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel không

bị xụp đổ

Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố:

 Mục tiêu của thí nghiệm (phân tách độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất)

 Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn

Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex, Sephacryl, Superose và Sephadex và Sephadex LH-20

III.1 Superdex

Superdex là lựa chọn cho độ giải li cao, thời gian ngắn và độ thu hồ cao

Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp, Superdex là loại gel được lựa chọn đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt

Superdex là một loại composite dựa trên liên kết ngang giữa các hạt rỗng agarose đến mạng dextran bằng liên kết cộng hóa trị Nó có độ bền vật lý và hóa học cao bởi mạng agarose liên kết ngang và có tính chất lọc gel tốt do chuỗi dextran Độ bền cơ học của Superdex cho phép những dung môi giải ly có độ nhớt cao như urea 8M vẫn chảy qua được Loại gel này có thể chịu đựng tốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn định hay lúc rửa cột Tính bền giúp loại Superdex phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp với tốc độ dòng cao, nhanh và hiệu quả làm sạch tại chỗ Những tương tác giữa protein và gel Superdex được bỏ qua khi sử dụng dung môi với cường độ ion trong khoảng 0,15 M đến 1,5M

Trang 12

Hình III.1 Mạng lưới liên kết trong Superdex

Superdex được sản xuất với hai loại kích thước hạt (13 m và 34 m) với 4 độ chọn lọc khác nhau (Superdex Peptide, Superdex 30, Superdex 75 và Superdex 200)

Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 m của Superdex Peptide, Superdex

30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ

Trang 13

Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 34 m của Superdex prep grade cho qui

mô công nghiệp

Khi không biết khối lượng của protein quan tâm thì nên bắt đầu với Superdex 200 Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng thể đơn dòng từ đimer và từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp

Superdex Peptide hay Superdex 30 prep grade dành cho việc phân tách peptides, oligonucleotides và phân tử protein nhỏ (Mr < 10000)

Bảng III.1 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superdex

Sephacryl HR là một loại composite được hình thành bởi liên kết ngang cộng hóa trị giữa allyl dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền

cơ học cao Lỗ xốp của gel được xác định bởi thành phần dextran được điều khiển để đem lại 5 độ chọn lọc khác nhau Độ bền cơ học của Sephacryl HR cho phép những dung

Trang 14

môi có độ nhớt cao chảy qua Sephacryl S-100 HR cho hiệu suất 96% cho việc tách những chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, -lactoglobulin A+B, chymotrypsinogen A, myoglobin, lysozyme, ribonuclease A và cytochrome C Cường độ tối thiểu ion nên sử dụng là 0,15 M

Hình III.3 Một phần cấu trúc của Sephacryl High Resolution

Hình III.4 Đường cong chọn lọc của gel Sephacryl High Resolution

Trang 15

Bảng III.2 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephacryl HR

Bảng III.3 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superose

Trang 16

Sephadex G-10 phù hợp cho việc tách những phân tử sinh học như peptides (Mr > 700) ra khỏi những phân tử nhỏ (Mr < 100)

Sephadex G-50 phù hợp tách những phân tử có Mr > 30000 ra khỏi những phân tử

Mr < 1500 như protein được đánh dấu hay DNA Loại gel này còn được sử dụng để loại

bỏ nucleotides nhỏ ra khỏi acids nucleic mạch dài

Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu Loại gel này hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có Mr >

5000

Trang 17

Hình III.6 Một phần cấu trúc của gel Sephadex Bảng III.4 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Sephadex

Trang 18

III.5 Sephadex LH-20

Sephadex LH-20 được sản xuất dành riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung môi hữu cơ để duy trì độ bền của chúng Các hợp chất tự nhiên này là steroids, lipids và peptides có khối lượng phân tử thấp (khoảng

35 amino acids) Các hợp chất thường được phân tách bằng sắc kí phân chia lỏng/lỏng hay sắc kí hấp thu Sephadex LH-20 có độ chọn lọc rất cao cho hợp chất có vòng thơm (aromatic) Nó được sử dụng trong phân tích và trong qui mô công nghiệp để phân tách những nhóm chất có tính chất tương tự nhau

Sephadex LH-20 được tạo nên từ những chuỗi hydroxypropylated dextran mà có liên kết ngang đến mạng lưới polysaccharide Loại này có thể trương nở trong nước và dung môi hữu cơ

Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers)

Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước

Hình III.7 Một phần cấu trúc của gel Sephadex LH-20