Sắc ký gel và ứng dụng

Bài trình bày về "Sắc ký gel và ứng dụng"

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HÓA HỮU CƠ TIỂU LUẬN CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ TÊN ĐỀ TÀI: SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Giảng viên: TS. Huỳnh Khánh Duy Học viên thực hiện: Nguyễn Quốc Khƣơng Anh – 13053071 Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 1 năm 2014 MỤC LỤC I. GIỚI THIỆU 3 II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL 5 II.1. Đặc điểm của quá trình 5 II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp 8 II.3. Độ giải li 9 III. PHÂN LOẠI GEL 11 III.1. Superdex 11 III.2. Sephacryl 13 III.3. Superose 15 III.4. Sephadex 16 III.5. Sephadex LH-20 18 IV. ỨNG DỤNG 19 IV.1. Khử muối - đổi dung môi - làm tăng nồng độ protein 19 IV.2. Sắc ký gel trong chiến lƣợc tinh chế 21 IV.3. Xác định khối lƣợng phân tử và phân tích sự phân bố khối lƣợng phân tử . 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 3 I. GIỚI THIỆU Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution). Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt.  Quá trình phân tách bằng phƣơng pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed). Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động. 1. hạt gel hình cầu 2. mẫu được đưa vào cột 3. Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột. Phân tử sẽ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn 4. Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên đi ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau. Hình I.1. Quá trình sắc kí gel SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 4  Ứng dụng của phƣơng pháp sắc kí gel Tách loại bỏ những nhóm phân tử (Group separation) Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối, protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử lớn. Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi. Sephadex G-10, G-25, G-50 được sử dụng cho nhóm này Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation) Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng của mẫu. Phù hợp cho bước tách cuối cuối cùng của việc tinh chế. Monomer có thể được tách khỏi tủa và mẫu có thể thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dự trữ. SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 5 II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL II.1. Đặc điểm của quá trình Kết quá của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích V o (xét trên 1 đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume). Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột V t (total column volume) của pha động đi qua cột. Hình II.1. Phổ đồ sắc kí Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng, V e (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí. Có 3 cách để xác định V e : Khi thể tích của mẫu quá nhỏ so với thể tích lớp đệm thì V e được xác định từ vị trí ban đầu của mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc kí. SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 6 Hình II.2. Cách xác định thể tích giải li V e Bởi vì mũi đối xứng phổ biến trong sắc kí gel, do đó V e dễ dàng xác định. Tuy nhiên V e không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển của các cấu tử khi qua cột bởi vì V e sẽ thay đổi phụ thuộc vào V t tổng thể tích của lớp đệm và cách nhồi cột. Sự giải li của mẫu được đặc trưng bởi hệ số phân bố K d .                         K d đặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy ra sự khuếch tán của những loại phân tử khác nhau. Cách xác định V e đã được nêu ở trên. V o là thể tích khoảng trống, chính là thể tích của những phân tử trong pha động không chui vào được mạng lưới lỗ xốp do kích thước lớn và di chuyển thẳng qua cột bằng thể tích của pha động (buffer). Cột được nhồi tốt thì thể tích V o xấp xỉ 30% thể tích cột. V s là thể tích pha tĩnh bằng V i là thể tích pha động bên trong mạng lưới (chỉ chứa các phân tử kích thước nhỏ). Trong thực tế V i rất khó xác định do phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), do đó để thuận tiện thì V i được thay thế bằng V t – V o . Khi thể tích của mẫu lớn, không thể bỏ qua so với thể tích lớp đệm thì V e được xác định từ vị trí một nữa thể tích mẫu đến vị trí cao nhất của mũi sắc kí. Khi thể tích mẫu quá lớn, tạo nên mũi sắc kí có vùng phẳng ngang, thể tích V e được xác định từ vị trí bắt đầu của mẫu đến vị trí của điểm uốn ở phần đang tăng lên của mũi giải li. SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 7 Hình II.3. Biểu đồ thể hiện thể tích V o và V t Do thay V i bằng V t – V o , do đó ta có giá trị K av , nó không thực sự đúng với giá trị hệ số phân bố K d . Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giửa K av :K d , và tỉ lệ này không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu.              Hình II.4. Mối quan hệ giữa các biểu thức đƣợc sử dụng quá trình giải li SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 8 II.2. Đƣờng cong chọn lọc và lựa chọn phƣơng pháp Hệ số phân bố K av liên quan đến kích thước của phân tử. Tỉ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị K av và log M r (khối lượng phân tử). Trên một vùng xem xét thì mối quan hệ này là đường thẳng. Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị K av ứng với log M r của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc. Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống V o (K av = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị V t (K av =1)  Nếu K av > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (V e > V t )  Nếu K av < 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các phân tử có thể chảy tắt qua cột (V e < V o ). Hình II.5. Đƣờng cong chọn lọc của Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade và Superdex 200 prep grade SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 9 II.3. Độ giải li Độ giải li cho biết độ phân tách giữa các mũi, chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như tỉ lệ giữa thể tích mẫu và thể tích cột, tốc độ dòng, thông số cột, kích thước hạt, sự phân bố kích thước hạt, tỉ trọng lớp đệm, độ xốp của hạt, độ nhớt của pha động. Hiệu quả của quá trình sắc kí gel phụ thuộc vào chủ yếu vào các điều kiện lựa chọn sao cho độ chọn lọc hợp lí và tránh những mũi giản rộng trong quá trình phân tách. Độ giải li được xác định bằng biểu thức:                  V r1 và V r2 là thể tích giải li của 2 mũi gần nhau.  W 1 và W 2 là độ rộng tương đối của mũi. Hình II.6. Thông số đƣợc sử dụng để xác định độ giải li Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương pháp tạo ra những mũi hẹp. Hình II.7. Sự phụ thuộc của độ giải li vào độ chon lọc và độ rộng của mũi SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 10 Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trình giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N):           Trong đó:  V e : thể tích mũi giải li  W 1/2 : chiều rộng mũi tại một nữa chiều cao mũi.  L: chiều cao đệm Hiệu quá có thể được cải thiện bằng cách giảm kích thước hạt, tuy nhiên kích thước hạt nhỏ tạo trở lực lớn và tốc độ dòng giảm, dẫn đến thời gian tiến hành kéo dài. Độ đồng đều của lớp đệm và hạt nhồi sẽ ảnh hưởng đến độ đồng đều của dòng chảy qua cột và do đó sẽ ảnh hưởng đến hình dạng và độ rộng của mũi. Thiết bị sắc kí gel với độ đồng đều cao luôn cho mũi giải li hẹp. Loại sắc kí gel với kích thướt hạt nhỏ tạo điều kiện cho các phân tử dễ dàng khuếch tán vào và ra khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân bằng giữa pha động và pha tĩnh, vì vậy cải thiện được độ giải li do giảm chiều rộng mũi. Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách: V Sep = V eB - V eA Tuy nhiên, do dòng khuếch tán xoáy, sự không cân bằng giữa pha tỉnh và pha động, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên luôn có vùng giản rộng. Vì vậy thể tích mẫu luôn nhỏ hơn thể tích phân tách. Hình II.8. Đƣờng cong giải li cho thể tích mẫu khác nhau Thể tích mẫu nhỏ Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách nếu không có vùng giản rộng Thể tích mẫu tối đa có thể phân tách trong điều kiện thực nghiệm [...]...SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG III PHÂN LOẠI GEL Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách một loại trọng lượng phân tử, tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel. .. tế bào u tủy và tinh chế bằng sự kết hợp sắc kí ái lực và lọc gel Kháng thể được bắt giữ bởi sắc kí ái lực sử dụng MabSelectTM Sắc kí gel trên cột Superdex 200 prep grade được sử dụng để tách các monomer từ dimer và các polymers lớn Trên phổ đồ sắc ký ta thấy sau khi tách mẫu bằng sắc kí ái lực ta thu được mũi IgG4 tinh khiết, tách riêng so với phần còn lại Nhưng nó vẫn lẫn các dimers và monomer với... được tinh chế và đổi dung môi trong một bước và dimers và các kết tủa được loại bỏ Sắc kí gel là kĩ thuật sắc kí chậm và kích thước cột sẽ xác định thể tích mẫu Việc sử dụng sắc kí gel sau những kĩ thuật khác một phần là để giảm thể tích mẫu để có thể sử dụng cột kích thước nhỏ hơn Loại gel cho bước này thường dùng là Superdex Hình IV.7 Phổ đồ tách dimers và multimers ra khỏi ZZ-brain IGF trên Superdex... hợp các kỹ thuật sắc kí  Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối cùng Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 24 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hầu hết sự phân tách dựa trên điện tích, tính kị nước, hay ái lực hóa học được sử dụng cho những giai đoạn trước bước cuối cùng trong chiến lược CIPP để phương pháp sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối Sản phẩm có thể được tinh chế và đổi dung môi... muối), trước khi cho vào cột IEX và AC Sắc kí gel không có liên kết giữa chất và mạng lưới gel, do đó không bị ảnh hưởng bởi điều kiện dung môi, nhưng bị hạn chế bởi thể tích mẫu Sắc kí gel phù hợp cho việc sử dụng sau bất cứ kỹ thuật làm tăng nồng độ như IEX, HIC, AC bởi vì protein mục tiêu được giải li với thể tích giảm đi và thành phần từ dung môi không ảnh hưởng quá trình lọc gel Ở bước bắt giữ,... với gel làm cho những phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li chậm hơn dự đoán Tuy nhiên, trong một vài ứng dụng, những tương tác này có thể giúp làm tăng độ giải li của quá trình phân tách Bảng III.3 Thông số kỹ thuật của các loại cột nhồi sẵn gel Superose Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 15 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình III.5 Đƣờng cong chọn lọc của gel. .. một vài mô hình lý thuyết được đưa ra để mô tả trạng thái của chất tan trong quá trình sắc kí gel Hầu hết mô hình đều giả sử sự phân bố Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 26 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG của phân tử chất tan giữa hạt gel và chất lỏng xung quanh hoàn toàn là hiệu ứng không gian Tuy nhiên trong thực tế những hợp chất tương đồng mô tả mối quan hệ hình chữ S giữa thể tích giải li khác nhau của chúng và. .. trong hạt gel Các loại gel thương mại thường không chịu được tính acid hay base quá mạnh, lỗ rỗng không quá lớn vì sẽ làm giảm độ bền cơ học Có hai loại nguyên liệu chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel Xerogel là loại gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm Trong hệ gel này các lỗ rỗng là... protein được đánh dấu hay DNA Loại gel này còn được sử dụng để loại bỏ nucleotides nhỏ ra khỏi acids nucleic mạch dài Sephadex G-25 được ứng dụng chính để tách nhóm protein dạng cầu Loại gel này hiệu quả trong việc khử muối hay những chất bẩn nhỏ ra khỏi những phân tử có Mr > 5000 Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 16 SẮC KÍ GEL - ỨNG DỤNG Hình III.6 Một phần cấu trúc của gel Sephadex Bảng III.4 Thông số kỹ... bằng sắc kí trao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers) Sephadex LH-20 có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước Hình III.7 Một phần cấu trúc của gel Sephadex LH-20 Nguyễn Quốc Khương Anh Trang 18 SẮC KÍ GEL - ỨNG . chính để chế tạo gel là xerogel và aerogel. Xerogel là loại gel cổ điển, là một polymer được tạo mạng ngang, khi cho tiếp xúc với dung môi, gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ rỗng. kí gel (gel filtration) Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed). Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung. đối mềm. Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng. Nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng, cấu trúc gel bị xụp đổ, nếu cho dung môi trở lại, đôi