Bài thực tập CNTB đv tiếng việt

THC HNH CễNG NGH SINH HC NG VT Bụ mụn CNSH ụng võt-Khoa Cụng nghờ sinh hoc BI 01 KY THUT C BAN TRONG PHA CH, BO QUN MT S LOI MễI TRNG V CCH S DNG MT S TRANG THIT B CH YU TAI PHềNG TH NGHIM CNSH NG VT Mc ớch bi thc tp: - Sinh viờn bit cỏch t chc, b trớ cỏc khu vc chc nng ca phũng thớ nghim CNSHV - Sinh viờn hiu rừ v thc hin cỏc thao tỏc c bn v s dng trang thit b, dng c thng dựng phũng thớ nghim - Sinh viờn bit cỏch tra cu, chun b v pha ch mt s húa cht c bn dựng nuụi cy t bo ng vt Ni dung 1.1 Pha ch, bo qun v s dng mt s mụi trng thụng dng phũng thớ nghim CNSH ng vt 1.1.1 Mụi trng, húa cht, vt t thụng dng - Mụi trng PBS - Mụi trng DMEM - Mụi trng TCM199 - Mụi trng M12 - Mụi trng M16 - Fetal Bovine Serum - Peniciline-Streptomycine - DMSO, Glycerol - BSA, Hyaluronidase - Trypsin-EDTA - Millipore - Bung m hng cu (Neubauer, Thoma) - Flask nuụi t bo - a thao tỏc v nuụi t bo cỏc loi 1.1.2 Pha ch môi trờng PBS vi thành phần nh sau (dùng pha lít): Hóa chất Khối lợng (gram) NaCl Na pyruvate 0.036 KCl 0.2 Na2HPO4 1.15 KH2PO4 0.2 Glucose MgCl2.6H2O 0.1 CaCl2.2H2O 0.1 Penicillin 100,000 đơn vị Streptomycin 0.05 Bovine Serum Albumin 2-4 1.2 S dng mt s trang thit b ch 1.2.1 Cỏc khu vc chc nng ca phũng thớ nghim - Khu vc x lý mu - Khu vc tin kh trựng - Khu vc thao tỏc v nuụi cy t bo - Khu vc bo qun t bo - Khu vc ph tr (ct gi qun ỏo, vt t, húa cht) 1.2.2 Trang thit b v cỏch hnh: - T hỳt an ton sinh hc cp II - Kớnh hin vi soi ni - Bn m mu - ng h bm giõy - Mỏy hỳt mụi trng cm tay - T nuụi iu chnh CO2 - Bỡnh cha CO2 lng - Kớnh hin vi phn pha - Bỡnh Nit - Cõn phõn tớch, cõn k thut - Mỏy o pH - Mỏy khuy t cú gia nhit - Mỏy ly tõm thng - Mỏy ly tõm lnh - B siờu õm - Mỏy vortex - Mỏy lm m ng nghim - Mỏy bm hỳt mini chõn khụng - T nuụi xỏch tay - Kớnh hin vi quang hc - Bn m trờn kớnh hin vi soi ni - Kớnh hin vi vi thao tỏc - T kh trựng cú ốn cc tớm - T sy - Mỏy xung in BTX - Mỏy ct kim - Mỏy mi kim - Mỏy ct nc - Mỏy kh ion nc - Mỏy PCR - Mỏy Realtime PCR - Mỏy soi gel BI 02 THU NHN, THAO TC V PHN LOI TRNG NG VT BC CAO Mc ớch bi thc tp: - Sinh viờn hỳt trng t bung trng (ln, bũ, dờ, trõu), quan sỏt, thao tỏc v ỏnh giỏ cht lng trng trờn kớnh hin vi soi ni Nikon SMZ1000 i tng: - Bung trng (ln, bũ, dờ, trõu) c thu vt b cht, chuyn v phũng thớ nghim Cỏc trng bờn nang c chc hỳt bng s dng bm tiờm loi 5ml 2.1 Thu nhn trng t bung trng vt nuụi 2.1.1 Trang thit b, dng c, húa cht - Kớnh hin vi soi ni Nikon SMZ1000 - Pipetman loi 1ml, 200ul - a nha NUNC to (02 cỏi) - a nha NUNC (06 cỏi) - Bm tiờm loi 5ml (01 cỏi) - Gng tay (01 ụi) - Mụi trng PBS b sung khỏng sinh, 10% FBS 2.1.2 Phng phỏp tin hnh Bc 1: - Hỳt 20 ml mụi trng PBS cho vo a NUNC to s 01 bng pipetman loi 1ml Bc 2: - Hỳt 02 ml mụi trng PBS t a NUNC to 01 núi trờn vo bm tiờm Bc 3: - Tay eo gng cm bung trng, nh nhng va chc va hỳt cỏc nang trờn b mt bung trng (lp li vi ln n hỳt ht tt c cỏc nang) Bc 4: - Thao kim tiờm, bm rt cn thn mụi trng cú trng, dch nang, cỏc loi t bo t bm tiờm vo a NUNC to s 01 Bc 5: - Lp li bc v vi ln n hỳt ht tt c cỏc nang trờn b mt bung trng 2.2 Thao tỏc vi trng ng vt bc cao Bc 6: - Chun b 06 a NUNC nh (ỏnh s t 01 n 06, mi s tng ng 01 sinh viờn), mi a np 03 ml mụi trng PBS (cú b sung khỏng sinh, 10% FBS) - Soi tỡm trng (a NUNC to 01) trờn kớnh hin vi soi ni NIKON SMZ1000 theo nguyờn tc hỡnh ch chi - Hỳt ton b trng cú a NUNC to 01 bng s dng pipetman loi 200ul, chuyn vo a mụi trng NUNC nh s 01 (sinh viờn lm chung bc ny) Bc 07: - T a NUNC nh 01, sinh viờn s 01 chuyn ton b trng sang a NUNC nh 02 - T a NUNC nh 02, sinh viờn s 02 chuyn ton b trng sang a NUNC nh 03 - Tng t vi cỏc sinh viờn khỏc 2.3 Phõn loi trng bng kớnh hin vi soi ni Bc 08: - Phõn loi trng loi A, B, C da trờn c im lp t bo cumulus bao quanh, kt hp trng thỏi ca nguyờn sinh cht Bc 09: - Nhúm sinh viờn hi ý, ghi v bỏo cỏo kt qu - Giỏo viờn hng dn thc kim tra kt qu: sai khỏc < 20% so vi kt qu ca giỏo viờn thỡ nhúm sinh viờn c ỏnh giỏ l t yờu cu, > 20% thỡ khụng t yờu cu (phi thc hnh li vo bui khỏc) BI 03 NHN NUễI IN VITRO VA BAO QUAN LANH T BO NG VT Mc ớch bi thc tp: - Sinh viờn bit tỡm thụng tin v chn lc cỏc phng phỏp, dng c, vt t, húa cht nhõn nuụi in vitro t bo ng vt (www.invitrogen.com) - Sinh viờn quan sat, thu nhn, thao tỏc, m t bo bng s dng bung m hng cu, nhõn nuụi, bao quan lanh tờ bao granulose, cumulus i tng: - Trang web: www.invitrogen.com - T bo granulose, cumulus ca ng vt 3.1 Thu thp, ỏnh giỏ s lng v cht lng t bo 3.1.1 Trang thit b, dng c, húa cht - T hỳt an ton sinh hc cp II - Kớnh hin vi quang hc NIKON E200 - Kớnh hin vi phn pha NIKON TS100 - ốn cn, bt la - T nuụi iu chnh CO2 - Mỏy ly tõm - Pipetman loi 1ml, 200ul - a nha NUNC to (01 cỏi) - a nha NUNC (02 cỏi) - a nha l NUNC (01 cai) - ng ly tõm cú np y loi 15ml (06 cỏi) - Mụi trng PBS b sung khỏng sinh, 10% FBS - Mụi trng DMEM b sung khỏng sinh, 10% FBS - Trypsin-EDTA - Hyaluronidase - Dõu khoang - Dimethyl Sulfoxide (DMSO) - Khang sinh Penni/Strep - Fetal Bovine Serum 3.1.2 Phng phỏp tin hnh Bc 1: - Dựng pipetman loi ml hỳt dung dch v t bo a NUNC ln 01 ca bi thc hnh s 02, chia u vo 02 ng ly tõm loi 15 ml (a co sn 03ml PBS, 10%FBS va khang sinh), y np Cõn bng va t i xng 02 ng trờn vo mỏy ly tõm Bc 2: - Ly tõm 1200 rpm/5 phỳt Bc 3: 3a - Hỳt b mụi trng bờn trờn mt cỏch cn thn t trờn xung, cũn khong 0,5 ml thỡ dng li 3b - Thờm mụi trng PBS (a cú b sung khỏng sinh v 10% FBS) vo ng ly tõm ờn vach 5ml, hỳt trn u mu Bc 4: - Lp li bc v 3a Bc 5: - Dung pipet loai 200ul suc ờu mõu tờ bao di ay ụng ly tõm - Ly 50 ul mu dung dch cú t bo t bc 3a, cho lờn a NUNC nh, t lờn kớnh hin vi phn pha NIKON TS100 quan sỏt - Thờm 05ul Trypsin-EDTA/05ul Hyaluronidase phõn tỏch t bo (02-03 phut/370C) (nờu cõn) Bc 6: - Dựng mụi trng PBS pha loóng v m s lng t bo bng s dng bung m Thoma, kớnh hin vi quang hc NIKON E200 (chia 02 lng tờ bao ang co: ẵ nuụi in vitro (bc 7-9), ẵ bao quan lanh (bc 10-12)) 3.2 Nhõn nuụi in vitro t bo t nuụi Bc 7: - Chun b dung dch 05 ml DMEM cú t bo vi nng 1x10 cho vo l ca a nuụi 04 giờng NUNC, phu dõu khoang (0,5 ml/ giờng) Bc 8: - y np v cho a nuụi 04 giờng NUNC vo t nuụi ó iu chnh 37OC, 5%CO2 Bc 9: - anh gia kha nng sụng cua tờ bao vao kờ tiờp bng soi kinh hiờn vi phan pha NIKON TS100 3.3 Bo qun lnh t bo Bc 10: - Chun b dung dch 02 ml DMEM co bụ sung 10% DMSO, 10% FBS Bc 11: - Cho tờ bao vao dung dich DMEM noi trờn Put cells in to fluid DMEM mentioned above Bc 12: - Ha nhiờt ụ (+40C 30 phỳt, -200C 30 phỳt) va bao quan lanh tờ bao -1960C Giai ụng 370C-01 phut, kiờm tra chõt lng tờ bao BI 04 NH GI MT S CH TIấU CA TINH TRNG NG VT Mc ớch bi thc tp: - Sinh viờn bit phng phỏp pha loóng, xỏc nh mt s ch tiờu ỏnh giỏ cht lng tinh trựng vt nuụi i tng: - Tinh trựng ln, bũ 4.1 Chun b bung m v mu tinh trựng 4.1.1 Tớnh toỏn nng t bo bng cỏch s dng bung m: C: Nng t bo ban u (s lng t bo/ml) N: S lng t bo m c 05 ụ ln H: H s pha loóng (gi s l 20 ln) Bung m Thoma, Neubauer cú ba thụng s c ban sau: - Mt ụ ln gm 16 ụ nh - sõu ca cỏc ụ nh v ln: 0,1mm - Din tớch mt ỏy ca mt ụ nh: 1/400 mm2 C=? - Sau hi ý, nhúm sinh viờn in kt qu sau du ? v bỏo cho giỏo viờn hng dn thc kt qu - Giỏo viờn hng dn tip nhn kt qu 4.2 Xỏc nh s lng tinh trựng - Bt hot tinh trựng bng dung dch NaCl 10% - Cho 07 ul mu lờn bung m ó gn lamen ỳng tiờu chun - Xỏc nh v trớ ụ m trờn kớnh hin vi Nikon, vt kớnh t nh n ln (t 04 n 40) - Vi chnh kớnh hin vi nhỡn rừ tinh trựng v cỏc ụ ca bung m - m s lng tinh trựng 05 ụ ln (lp li 03 ln cho mi mu tinh trựng) v tớnh trung bỡnh 4.3 Xỏc nh tinh trựng k hỡnh - Tinh trựng k hỡnh: l nhng tinh trựng cú hỡnh dng khỏc thng so vi tinh trựng bỡnh thng v khụng hoc cú kh nng th thai kộm - kim tra tinh trựng k hỡnh, ngi ta dựng phng phỏp soi trc tip hoc nhum bng xanh metylen, tớm violet, Giờm xa,