Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học trong vỏ cây hoa sữa

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG VỎ CÂY HOA SỮA Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2011 Footer Page of 126 Header Page of 126 Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: PGS.TS PHẠM VĂN HAI Phản biện 2: PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 25 tháng năm 2011 * Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Lý chọn ñề tài Việt Nam ta nước nhiệt ñới, nóng, ẩm mưa nhiều, có nguồn dược liệu phong phú, ña dạng y học dân tộc phát triển lâu ñời Từ xa xưa, ông cha ta ñã biết cách sử dụng nhiều loại thảo dược việc dưỡng thương, trị bệnh bồi bổ thể Như vậy, thuốc dân gian ñóng vai trò quan trọng ñời sống ngày người Ngày nay, thuốc biệt dược y học hiên ñại ñược sử dụng rộng rãi, nhiều loài cỏ tự nhiên ñược sử dụng dân gian ñể chữa bệnh có hiệu Rất nhiều loại bệnh tật ñã ñược chữa khỏi nhờ thảo dược, nhiều thực vật ñược dùng ñể chế biến thành thực phẩm chức quý giá Trong thời gian qua, hợp chất tự nhiên ñược phân lập từ cỏ ñã ñược ứng dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng ñược dùng ñể sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm v.v Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày ñã phát triển mạnh mẽ, tạo biệt dược khác sử dụng công tác phòng, chữa bệnh, song nhu cầu sử dụng cỏ xung quanh ñể làm thuốc ngày tăng lên, khoa học hiên ñại ñã chứng minh ñược chúng có chứa biệt dược khó tổng hợp, có tác dụng phụ Có nhiều môn khoa học nghiên cứu thuốc ñời Việc nghiên cứu thuốc ñã giúp cho hiểu rõ thành phần cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí thuốc Trên sở nghiên cứu ñó Footer Page of 126 Header Page of 126 tạo chất có hoạt tính sinh học cao mong muốn ñể làm thuốc chữa bệnh Hoa sữa, hay gọi mò cua, mù cua (danh pháp khoa học: Alstonia scholaris L R Br.; ñồng nghĩa: Echites scholaris L Mant., Pala scholaris L Roberty) loài thực vật nhiệt ñới thuộc chi Hoa sữa, họ La bố ma (Apocynaceae).Vỏ hoa sữa ñược nhân dân số nước Đông Nam Á sử dụng làm thuốc Thường vỏ sữa ñược dùng làm thuốc bổ, chữa sốt, ñiều kinh chữa lỵ tiêu chảy Với mục ñích nghiên cứu tìm hiểu thành phần hóa học, hợp chất có hoạt tính sinh học hoa sữa, góp phần làm tăng thêm hiểu biết thành phần hoá học nguồn thực vật làm thuốc phong phú quý giá Việt Nam Chúng chọn hoa sữa làm ñối tượng nghiên cứu cho công trình Tên ñề tài là: “Nghiên cứu, xác ñịnh thành phần hóa học vỏ hoa sữa” Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh thành phần hoá học hợp chất vỏ hoa sữa - Xây dựng qui trình chiết tách indol ankaloit vỏ hoa sữa - Xác ñịnh cấu trúc hợp chất alkaloid có vỏ hoa sữa Đối tượng phạm vi nghiên cứu Vỏ hoa sữa, ñược lựa chọn cách ngẫu nhiên ñịa bàn Đà Nẵng Các phương pháp nghiên cứu + Nghiên cứu lý thuyết: + Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Footer Page of 126 Header Page of 126 - Phương pháp chọn mẫu - Xác ñịnh ñộ ẩm phương pháp trọng lượng - Xác ñịnh hàm lượng hữu phương pháp tro hoá mẫu - Xác ñịnh hàm lượng kim loại phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) - Chiết phương pháp soxhlet - Khảo sát ñiều kiện chiết thích hợp - Xác ñịnh thành phần hợp chất axit béo dịch chiết từ vỏ hoa sữa dung môi chiết phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS - Dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp - phổ khối liên hợp (LC-MS), với hỗ trợ phần mềm ChemSketch ñể xác ñịnh thành phần, công thức cấu tạo hợp chất alkaloid có dịch chiết Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài - Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích cách khoa học kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho việc ứng dụng thuốc chữa bệnh - Ý nghĩa khoa học: Cung cấp thêm thông tin hoa sữa số tiêu hóa lý, khảo sát thành phần hóa học cấu tạo số hợp chất có Bố cục luận văn Ngoài phần mở ñầu kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục luận văn chia làm chương sau : Chương 1- Tổng quan Chương 2- Những nghiên cứu thực nghiệm Chương 3- Kết bàn luận Footer Page of 126 Header Page of 126 CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hoa sữa 1.1.1 Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật 1.1.2 Cây hoa sữa 1.2 Một số nghiên cứu thành phần hoá học yên hoa sữa Những nghiên cứu cho thấy hoa sữa chứa nhiều alkaloid, Iridoids, tanin (thuộc nhóm tanin pyrogalic), flavonoid, coumarin, ankaloit (có nhiều rễ), antraquinon, glucoxit, saponin, axit béo, nhựa 1.2.1 Thành phần hóa học hoa sữa Từ phận hoa sữa Alstonia scholaris, nhà khoa học nhiều nước khác giới ñã phân lập chất alkaloid sau: picirinin, vallesamin scholaricin, 19-E-picrinine (1), 19-E-akuammidine (2), 19-E-vallesamine (3), 19-S-scholaricine, akuammiginone (1), glycosidici idole alkaloid, echitamidine-Noxide19-O- β -D-glucopyranoside (2), với alkaloid ñã biết, echitaminicacid (3), echitamidine N-oxide (4), Nb-demethylalstogustine N-oxide (5), akuammicine N-oxide(6), Nb-demethylalstogustine, Alstonoside, a secoiridoid glucoside, isoboonein (5), alyxialactone (6), and loganin 1.2.2 Thành phần hóa học vỏ hoa sữa Thành phần hóa học vỏ hoa sữa gồm: chất alkaloid, alkaloid toàn phần vỏ 0,16-0,27% Các chất alkaloid echitenine, ditamine, echitamine, echitamidine số alkaloid khác alstonidine, alstonine, ellipatamine, Footer Page of 126 Header Page of 126 alstovenine, echicaoutchin, echicerin, echiretin, O-methyl- macralstonine, macralstonine O-acetylmacralstonine, villalstonine, macrocarpamine, corialstonine and corialstonidine Ngoài có số chất khác steroids, triterpenoid: lupeol linoleate, lupeol palmitate and alpha-amyrin linoleate, flavonoids acid phenolic, axit béo khác 1.3 Giá trị sử dụng hoa sữa 1.4 Tình hình nghiên cứu 1.5 Hợp chất alkaloid 1.5.1 Khái niệm 1.5.2 Danh pháp 1.5.3 Phân bố alkaloid 1.5.4 Sự phân bố alkaloid tổ chức 1.5.5 Sinh tổng hợp alkaloid 1.5.6 Cấu trúc phân loại alkaloid 1.5.7 Một số alkaloid vỏ hoa sữa 1.5.8 Tính chất chung alkaloid 1.5.9 Chiết tách alkaloid 1.5.10 Thuốc thử phát alkaloid 1.6 Flavonoid số chất khác Có loại flavonoid hoa sữa gồm: kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol-3-0-beta-D-galactopyranoside, quercetin-3-0-beta-D-galactopyranoside, isorhamnetin-3-0-beta-D- galactopy-ranoside,kaempferol-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(2-1)-0beta-D-galac-topyranoside, quercetin-3-0-beta -D-xylopyranosyl -(21)-0-beta-D-galac-topyranoside Footer Page of 126 Header Page of 126 Ngoài vỏ hóa sữa có số axit béo như: octanoic acid, decanoic acid, dodecanoic acid, tetradecanoic acid, hexanethioic acid, adipic acid, phthalic acid, palmitic acid, canxi oxalat, axít crystallizable, vài loại chất béo nhựa gọi là: Echicaoutchin (C25H40O2), echicerin (C30H48O2), echitin (C32H52O2), echitein (C42H70O2), echiretin (C35H56O2) CHƯƠNG – NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất 2.1.1 Nguyên liệu Vỏ thân hoa sữa (cây mù cua, mò cua) ñược thu ñịa bàn thành phố Đà Nẵng Họ : họ La bố ma (Apocynaceae) 2.1.2 Thu mẫu phương pháp xử lí Vỏ thân hoa sữa ñược thu vào tháng 10-11 năm 2010 ñường 2-9, thành phố Đà Nẵng Mẫu vỏ tươi ñem phơi khô bảo quản ngày, sau ñó sấy nhiệt ñộ 50-600C tới ñộ ẩm 10% Mẫu ñược say nhuyễn thành bột mịn 2.1.3 Thiết bị - dụng cụ hóa chất 2.1.3.1 Thiết bị - dụng cụ 2.1.3.2 Hóa chất Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2 Sơ ñồ nghiên cứu Chiết alkaloid dươi dạng muối Vỏ thu, xử lý Loại tạp ete dầu hỏa Định danh thành phần ete dầu hỏa Xác ñịnh ñộ ẩm hàm lượng hữu cơ, hàm lượng kim loại Bột vỏ khô Khảo sát ñiều Chiết nóng etanol Chiết lại dung môi nước, etylaxetat Dịch chiết: ñuổi dung môi Lắc dịch với dung dịch axit HCl 5% Định danh thành phần hóa học số hợp chất khác vỏ hoa sữa Dịch axit kiềm hóa NH3 chiết pH CHCl3 chiết Loại H2O Na2SO4 khan Đuổi dung môi thu cặn Alkaloid thô Định danh chất alkaloid phương pháp phổ Footer Page of 126 10 Header Page 10 of 126 Chiết alkaloid dươi dạng bazơ Vỏ thu, xử lý Xác ñịnh ñộ ẩm hàm lượng hữu cơ, hàm lượng kim loại Bột vỏ khô tẩm dung dịch NH3 Bột vỏ khô Loại tạp ete dầu hỏa Chiết nóng CHCl Thời gian chiết Dịch chiết: ñuổi dung môi 1/3 V Lắc dịch với dung dịch HCl 5% Dịch axit kiềm hóa pH chiết CHCl Loại H2O Na2SO4 khan Đuổi dung môi thu cặn Ancaloit toàn phần Định danh chất alkaloid phương pháp phổ Footer Page 10 of 126 12 Header Page 12 of 126 3.1.2 Hàm lượng tro Vậy hàm lượng tro trung bình là: 13,685% Trong thành phần tro vô có mặt muối số kim loại K, Na, Ca, Fe, Cu, Pb, Zn… Sự có mặt kim loại ảnh hưởng ñến tính chất dịch chiết từ vỏ hoa sữa với phương pháp chiết khác 3.1.3 Hàm lượng số kim loại Bảng 3.3 Bảng hàm lượng số kim loại vỏ hoa sữa Kim loại Zn2+ Hàm lượng (mg/l) 0,3721 TCVN (mg/l) 3,102 Cu2+ Pb2+ As2+ 0,1052 0,1900 0,1364 3,102 3,102 3,313 Qua bảng 3.3 cho thấy hoa sữa có số kim loại nặng Zn2+, Cu2+, Pb2+, As2+ hàm lượng tương ñối nhỏ Căn vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo ñịnh y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng năm 1992) hàm lượng kim loại nặng tối ña cho phép rau sấy khô Pb: 3,102 mg/kg, Zn: 3,102mg/kg, Cu: 3,102mg /kg, As: 3,313mg/kg hàm lượng kim loại nặng có vỏ hoa sữa nhiều so với hàm lượng tối ña cho phép 3.2 Xác ñịnh thành phần, hàm lượng công thức cấu tạo số axit béo vỏ hoa sữa Bột vỏ hoa sữa loại tạp ete dầu hỏa Dịch chiết ete dầu hỏa ñem xác ñịnh thành phần hàm lượng chất béo vỏ hoa sữa Từ kết bảng 3.4 cho thấy vỏ hoa sữa chứa nhiều thành phần axit béo Vì vậy, vỏ hoa sữa có nhiều Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 13 axit béo cản trở ñến việc chiết tách alkaloid nên việc loại tạp trước tiến hành chiết dung môi việc làm cần thiết Trong axit béo ñó có số axit béo có hàm lượng lớn axit tetradecanoic acid (30,92%), hexadecanoic acid (12,44%), octadecenoic acid (918,03%), octadecadienoic acid (23,51%) Bảng 3.4 Kết thành phần hàm lượng số axit béo vỏ hoa sữa Đặc biệt axit Octadecadienoic acid (Linoleic acid) tiền chất tổng hợp prostaglandin ñộng vật Việc thiếu acid linolenic, acid linoleic axít béo khác, loài ñộng vật hoại da tổn thương thận, vô sinh Linoleic acid kết hợp với ester cholesterol, biến ñổi, suy thoái cholesterol acid sau ñó tiết Footer Page 13 of 126 14 Header Page 14 of 126 giảm vai trò chất béo trung tính Trong y học ñể phòng ngừa ñiều trị thuốc xơ vữa ñộng mạch có sử dụng nguyên liệu axit béo Trong công nghiệp, linoleic acid ñược sử dụng sơn, mực hệ thống sản xuất từ sợi tổng hợp, amide, polyurea Linoleic acid không ñộc Còn axit Tetradecanoic acid ñược sử dụng cho tổng hợp hữu cơ, sắc ký khí nghiên cứu sinh hóa 3.3 Định tính flavonoid dịch chiết vỏ hoa sữa Trong dịch chiết với nước có ñổi màu với thuốc thử, chứng tỏ hoa sữa có cấu tử flavonoid chưa xác ñịnh ñược cấu trúc Vì hàm lượng flavonoid hoa sữa thấp nên việc chiết tách ñể phân lập flavonoid gặp nhiều khó khăn Mặc khác flavonoid vỏ hoa sữa ý nghĩa quan trọng vấn ñề chữa bệnh nên chưa ñược nghiên cứu kĩ 3.4 Kết khảo sát ñiều kiện chiết alkaloid từ vỏ hoa sữa 3.4.1 Kết lựa chọn thuốc thử Hiện tượng thu ñược thử sản phẩm chiết với thuốc thử alkaloid ñược trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Hiện tượng quan sát ñược với thuốc thử alkaloid Thuốc thử Hiện tượng Thuốc thử Mayer Kết tủa trắng Thuốc thử Wagner Kết tủa nâu rõ Dung dịch HNO3 ñậm ñặc Tạo chất lỏng màu vàng (D= 1,4 g/ml) Dung dịch H2SO4 98% Footer Page 14 of 126 Tạo chất lỏng màu ñỏ Header Page 15 of 126 15 3.4.2 Kết lựa chọn dung môi chiết Từ bảng 3.6 cho thấy - Dung môi khác cho kết mật ñộ quang khác Trong dịch chiết vỏ hoa sữa, dung môi phân cực mật ñộ quang tăng - Mật ñộ quang ñạt giá trị cực ñại dung môi etanol 960 + HCl 5% Hình 3.7 Phổ hấp thụ phân tử dịch chiết với dung môi khác Bảng 3.6 Mật ñộ quang dung môi chiết khác Mẫu Thể tích dung môi (ml) 300 300 300 300 Footer Page 15 of 126 Khối lượng vỏ (g) 20,011 20,013 20,010 20,002 Dung môi Hexan Clorofom H2O Etanol 960HCl Mật ñộ quang 0,33 1,32 2,01 2,59 16 Header Page 16 of 126 Từ kết phân tích trên, sử dụng dung môi chiết lấy alkaloid vỏ hoa sữa CHCl3 dung dịch hỗn hợp C2H5OH 960 + HCl 5% (4:1) 3.4.3 Khảo sát thời gian chiết Bảng 3.7 Mật ñộ quang dịch chiết thời gian chiết khác Mẫu Thể tích dung môi (ml) 300 300 300 300 Khối lượng vỏ (g) 20,011 20,013 20,010 20,002 Thời gian (h) Mật ñộ quang 10 1,61 2,00 3,27 2,59 Từ bảng 3.7 cho thấy: - Khi thời gian chiết tăng mật ñộ quang tăng (mẫu 1, 2, 3, 4) - Mật ñộ quang ñạt giá trị cực ñại mẫu (chiết 8h) - Tăng thời gian chiết ta thấy mật ñộ quang giảm xuống thời gian gia nhiệt lâu hợp chất màu bị biến ñổi cấu trúc làm ảnh hưởng ñến trình chiết 3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng pH chiết ñến hiệu suất tạo alkaloid Bảng 3.8 Khối lượng sản phẩm tối ưu pH chiết pH 7÷8 m1 (g) 30,352 m2 (g) 30,364 ∆m (g) 0,013 8÷9 32,801 32,828 0,017 ÷ 10 33,143 33,177 0,024 10 ÷ 11 28,758 28,807 0,029 11 ÷ 12 28,796 28,843 0,021 Footer Page 16 of 126 17 Header Page 17 of 126 Qua kết khảo sát bảng 3.8 cho thấy alkaloid vỏ hoa sữa có tính bazơ yếu, pH thích hợp ñể chiết ñược lượng alkaloid lớn khoảng 10 ÷ 11 3.5 Định danh thành phần hóa học dịch chiết alkaloid vỏ hoa sữa GC – MS Bảng 3.9 Thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa Đà Nẵng AREA % 3,6-Dimethyldecane 20837572 0.46 15427042 0.34 542 4-Methylundecane Dodecane,2,7,10trimethyl- 51562280 1.13 555 Farnesan 11845631 0.26 586 Pentadecane 58100704 1.28 744 Hexadecane 78559160 1.73 753 4-Ethyltetradecane 27367734 0.60 789 Heptadecane 177274032 3.90 800 Octyl ether 72622136 1.60 10 821 Xem phổ 70793136 1.56 11 899 Xem phổ 51209756 1.13 12 904 54622712 1.20 13 930 Xem phổ 1R,3-Cis-Diethoxy-5cis-methylcyclohexane 137910672 3.03 14 951 15 992 16 17 NO SCAN 339 382 NAME 390164160 8.59 105288904 2.32 1002 3-Octadecanone Heptadecane,2,6,10,15tetramethylHeptadecane,2,6,10,14tetramethyl- 35991652 0.79 1012 Heneicosane 55416928 1.22 Footer Page 17 of 126 18 Header Page 18 of 126 18 1055 Docosane 39750592 0.87 19 1143 Tricosane 97915000 2.15 20 1148 Hexanethioic decyl ester 264547856 5.82 21 1183 Docosane,2,21dimethyl- 76367888 1.68 22 1199 Xem phổ 52347756 1.15 23 1238 Palmitic ester 388144512 8.54 24 1241 Hexadecanoic acid 236881072 5.21 25 1323 Heptadecane,9-octyl- 57055616 1.26 26 1359 Pentacosane 61165552 1.35 27 1383 Ethyl linoleate 363426752 8.00 28 1386 Ethyl oleate 645090816 14.20 29 1410 Stearic acid 575381952 12.66 30 1559 Adipic ester 159762736 3.52 31 1672 Phthalic acid,diisooctyl ester 55610884 1.22 32 1702 Cetylpyridinium chloride 55735396 1.23 4544178591 100.00 acid,s- acid,ethyl acid,dioctyl 3.6 So sánh phương pháp chiết xuất alkaloid dạng bazơ dạng muối 3.6.1 Chiết alkaloid dạng bazơ Footer Page 18 of 126 19 Header Page 19 of 126 Bảng 3.10 Thành phần hoá học dịch chiết L1 T Thời gian Công T lưu (phút) 3,21 thức phân tử Tên gọi M=384 Ditaine C22H28N2O4 (Echitamine) Tỉ lệ % 10,87 16demethoxyvindo 3,66 M=426 line C24H30N2O5 (Vindorosine) 27,12 Hoặc Elipatamine 5,04 M= 310 chưa ñịnh danh 26,78 4,27 M=356 chưa ñịnh danh 19,05 6,59 M=258 chưa ñịnh danh 8,06 9,27 M=518 Chưa ñịnh danh 6,78 12,07 M= 366 Chưa ñịnh danh 1,34 3.6.2 Chiết alkaloid dạng muối Bảng 3.11 Thành phần hoá học dịch chiết L2 Thời TT gian lưu Công thức phân tử (phút) 2,93 3,76 Tên gọi M=384 C22H28N2O4 M= 426 C24H30N2O5 Footer Page 19 of 126 Ditaine (Echitamine) Tỉ lệ % 21,52 16demethoxyvindoline (Vindorosine) 36,36 Header Page 20 of 126 20 Hoặc Elipatamine 5,06 M=310 chưa ñịnh danh 33,77 6,54 M = 486 chưa ñịnh danh 3,59 10.69 M=350 Chưa ñịnh danh 4,76 So sánh kết bảng 3.10 3.11, hình 3.14 3.15 cho thấy - Lượng chất rắn thu ñược L2 (0,089g) nhiều L1 (0,057g) - Thành phần dịch chiết mẫu L1 so với mẫu L2 có khác nhau, hầu hết hợp chất L1 chưa ñược ñịnh danh, nhiên hợp chất ñều có mặt dịch chiết khác hàm lượng Hàm lượng chất Echitamine mẫu L2 (21,52%) cao mẫu L1 (10,87%), chất 16-demethoxyvindoline (Vindorosine) Hoặc Elipatamine L2 (36,36%) có hàm lượng cao L1 (27,12%) Hàm lượng chất có thời gian lưu khoảng 2,38 (M= 310) chưa ñịnh danh ñược mẫu L2 (33,37%) cao hẵn mẫu L1 (26,78%) Sở dĩ có khác biệt phương pháp chiết khác nhau, mẫu L1 ñược chiết phương pháp bazơ, mẫu L2 ñược chiết phương pháp muối Đồng thời nhìn vào hình 3.13 so với hình 3.14 ta thấy hình 3.13 số lượng pic nhiều, pic không cân ñối, chân pic không rõ pic chồng lên nhau, cho thấy dịch chiết L1 có nhiều cấu tử Chính mà mẫu L1 thành phần có nhiều cấu tử chưa ñược ñịnh danh hàm lượng chất giảm xuống so với mẫu L2 Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 21 Như ñối với alkaloid vỏ hoa sữa ta không nên dùng phương pháp chiết dạng bazơ, khó tách trình phân lập thu ñược hàm lượng Như nhận xét: ñiều kiện thực nghiệm phòng thí nghiệm với phương pháp chiết khác nhau, hợp chất có mặt dịch chiết Khả tách riêng cấu tử dịch chiết L2 cao so với L1, nên ñiều kiện ta sử dụng dịch chiết L2 ñể tiến hành xác ñịnh công thức cấu tạo số cấu tử Các sắc ký ñồ khối phổ hợp chất ñược trình bày phụ lục 3.7 Xác ñịnh công thức cấu tạo số cấu tử dịch chiết L2 3.7.1 Kết phân tích thời gian lưu 2,97 Phân tích phổ sắc kí ñồ hình 3.16 sau qua hệ thống LCMS khoảng khối lượng từ 100 – 500, với thời gian lưu (RT) từ 2,12 – 3,56 tương ứng với pic có m/z = 385,2 Cho kết xuất pic tương ñối lớn có khối lượng 385,2; 367,1; 310,2; 280; 220,1, 110 Trong ñó pic 385,2 ion phân tử hay pic gốc [M+H]+ ñược nhận diện là: Ditaine (Echitamine), C22H28N2O4 Ditaine có cấu trúc phân tử sau Đây loại ankaloid có khung Indol Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 22 Các pic lại ñáng lưu ý 367,1 310,1 ñó ion mảnh chủ yếu bắn phá ion phân tử ñược máy ghi lại Với phổ khối hình 3.16 sơ ñồ phân mảnh hình 3.17 cho thấy phân mảnh [M+H]+ m/z = 385,2 theo hướng: - Hướng 1: [M+H]+ ( 385,2) → [B]+ - Hướng 2: [M+H]+ ( 385,2) → [D]+ Cơ chế cắt mảnh ñã nghiên cứu dựa vào tài liệu tham khảo từ nguồn sách khác Chúng ñã ñưa sơ ñồ phân mảnh sau: + Hướng 1: Cấu tử M nhận H+ thành [M+H]+ = 385, H+ công vào OH M thành [OH2]+ không bền bị cắt thành mảnh [A]+, ñây khung indol hay có chuyển vị H+, CH2+ bị H chuyển vị vào vòng bị cắt ñi C thành mảnh [B]+ có khối lượng phân tử phổ khối hình 3.17 + Hướng 2: : Cấu tử M nhận H+ thành [M+H]+ = 385, H+ công vào OH M thành [OH2]+ không bền phần COOCH3 liên kết gần [OH2]+ bị cắt thành mảnh [C]+, tiếp tục vòng benzen bên cạnh nguyên tử N+ phần ion dương mảnh [C]+ bị cắt thành [D]+ - Từ lập luận kết nhận ñược phổ ñồ ñã bước ñầu xác ñịnh ñược hợp chất có thời gian lưu 2,97 có [M+H]+ = 385 Echitamine có công thức phân tử C22H28N2O4, có cấu trúc khung indol, loại indol alkaloid phổ biến hoa sữa - Theo tài liệu tham khảo alkaloid ñã ñược sử dụng thay cho quinine, chất có tác dụng hạ sốt Footer Page 22 of 126 23 Header Page 23 of 126 Formula Weight[M] = 384.4761114 Molecular Formula[M] = C22H28 N2 O4 H O N C H + m/z[M+]= 385.4755628 D a + O COOCH N C H + + COOCH C 22H 27N 2O 3 2 D a C H C -H H D a C C H + + C H H C D a + COOCH N N Molecular Formula[A] H C H O N H C H C 6H 7 D a C H Formula Weight COOCH = 310.4321428 Molecular Formula[C] C H = C20H26 N2 O H O + N + 3 C H N H C H C + N + C H = C22H27 N2 O3 = 367.4682228 C H + N H H O Formula Weight + C H 3 C H 3C + 3 N H H O C H C H COOCH N C 2H 4O 0 3 D a N H H O + C H + N 3 H H C H + N H D a O + +H H O +H H N H H O H 2O H 2O COOCH Formula Weight = 355.4501314 Molecular Formula[B] = C21 H27N2O3 H O H N Formula Weight C H = 220.3096028 Molecular Formula[D] = C13 H20N2O Hình 3.17 Sơ ñồ phân mảnh ion phân tử [M+H]+ có m/z = 385 3.7.2 Kết phân tích thời gian lưu 3,79 Phân tích phổ sắc kí ñồ hình 3.18 sau qua hệ thống LCMS khoảng khối lượng từ 100 – 500, với thời gian lưu (RT) từ 2,88-4,99 tương ứng với pic có m/z = 427,1 Cho kết xuất pic tương ñối lớn có khối lượng 427,1; 409,1; 384,1; 352,0; 292,1 Dựa vào pic lớn với chế phân cắt mảnh, bước ñầu ñưa sơ ñồ phân cắt mảnh hợp chất alkaloid có thời gian lưu 3,79 có M=426 (hình 3.18) Trong ñó pic 427 ion phân tử hay pic gốc [M+H]+ ñược nhận diện là: • 16-demethoxyvindoline(Vindorosine), C24H30N2O5, CH3 N O H O OH N H O CH3 OCH CH3 • Ellipatamine có công thức phân tử C24H30N2O5 Footer Page 23 of 126 24 Header Page 24 of 126 CH3COOH2C COOCH3 HO N N H3C H3C Các pic lại ñáng lưu ý 427 ñồng vị [M+H]+ ; 409,1; 384,1; 352,0 292,1 ñó ion mảnh chủ yếu bắn phá ion phân tử ñược máy ghi lại Với phổ khối hình 3.18 sơ ñồ phân mảnh hình 3.19 cho phép nhận ñịnh: ñầu tiên phân cắt [M+H]+ có m/z = 427 xảy liên kết OH vòng cạnh, mảnh OH2+ bi phân cắt thành ion phân tử [A]+, có chuyển vị H+ làm xuất nối ñôi vòng cạnh, sau ñó ion phân tử tiếp tục bị bắn phá tạo [B]+, lại tiếp tục có chuyển vị H+ vòng sau ñó ion phân tử lại bị bắn phá tiếp chỗ liên kết N vòng tạo ion[C]+ Cuối ion phân tử [C]+ bị phân cắt nhóm H3CCOO ñể tạo thành [D]+ Như với chế phân mảnh hình 3.19 dựa vào tài liệu tham khảo với công thức cấu tạo ñược dự ñoán trên, bước ñầu khẳng ñịnh hợp chất có thời gian lưu 3,79 có [M+H]+ = 427 là: ellipatamine có công thức phân tử C24H30N2O5 với M = 426 Footer Page 24 of 126 25 Header Page 25 of 126 CH COOH C COOCH CH COOH CH C COOCH H O H O D a N H N C H H H O N C H Formula Weight = 426.5054 H C 4H 29 N 2O 2 D a COOH CH COOCH C COOH 3 COOH H C -H N C H H N C H C C H N C C C Formula Weight 3 + + = 384.46872 Molecular Formula[B] H C N C + H H N + C Formula Weight = 409.4975114 + Molecular Formula[A]= C24H29N2O4 COOCH COOCH N C -H C C 2H 1 3 N m/z [M+]= 427.5127914 C C H 5N 3 D a H C + CH COOCH N C H N C Molecular Formula[M] = C24H30N2O5 CH COOH 3 + = C22 H28N2O4 C 2H 4O 0 3 D a CCOO C H COOCH N H C Molecular Formula[C] + Formula W eight C H = C21H22NO4 = 352.4020342 + COOCH N H C Formula Weight = 292.3585628 Molecular Formula[D] = C19 H20NO2 C 19 H 21 N O 2 5 D a Hình 3.19 Sơ ñồ phân mảnh ion phân tử [M+H]+ có m/z = 426 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số kết luận sau: Hàm lượng kim loại nặng (Zn2+: 0,3721mg/kg; Cu2+: 0,1052mg/kg; Pb2+: 0,1900mg/kg; As2+: 0,1364 ), không vượt tiêu chuẩn Việt Nam cho vệ sinh thực phẩm (theo ñịnh y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng năm 1992) Xác ñịnh ñược thành phần với hàm lượng số axit béo có vỏ hoa sữa Đà Nẵng gồm Octannoic acid (0,12%); Decanoic acid (0,13%); Đoecanoic acid (11,53%); Tetradecanoic acid (30,92%); Hexadecanoic acid (12,44%); Hexadecenoic acid (0,39%); Octadecanoic acid (1,89%); Octadecenoic acid (18,03%); Octadecadienoic acid (23,51%); Octadecatrienoic acid (1,07%) Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 26 Đã khảo sát tìm ñược ñiều kiện thích hợp ñể chiết hợp chất alkaloid phương pháp soxhlet với dung môi C2H5OH 960 + HCl 5% (4:1), nhiệt ñộ 760C với thời gian chiết giờ, khoảng pH chiết alkaloid 10 ÷ 11 Bằng phương pháp LC-MS ñã xác ñịnh ñược thành phần hàm lượng chất alkaloid dịch chiết vỏ hoa sữa phương pháp chiết soxhlet dạng muối bazơ Kết cho thấy dịch chiết vỏ hoa sữa phương pháp chiết soxhlet dạng muối thu ñược hàm lượng hợp chất alkaloid nhiều Bước ñầu dự ñoán ñược công thức cấu tạo hợp chất: Ditaine(Echitamine) Ellipatamine xác ñịnh ñược cấu trúc alkaloid Cetylpyridinium chloride phương pháp GC-MS KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột ñể tách ñược cấu tử tinh khiết từ vỏ hoa sữa, ño cộng hưởng từ ñể xác ñịnh cấu trúc hợp chất Làm giàu cấu tử thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng Có thể nghiên cứu mở rộng xác ñịnh thành phần chất có lá, rễ hoa hoa sữa so sánh với thành phần chất có vỏ hoa sữa Từ ñó, lựa chọn ñược nguồn nguyên liệu tối ưu ñể tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học Footer Page 26 of 126 ... vỏ hoa sữa Mục ñích nghiên cứu - Xác ñịnh thành phần hoá học hợp chất vỏ hoa sữa - Xây dựng qui trình chiết tách indol ankaloit vỏ hoa sữa - Xác ñịnh cấu trúc hợp chất alkaloid có vỏ hoa sữa Đối... isoboonein (5), alyxialactone (6), and loganin 1.2.2 Thành phần hóa học vỏ hoa sữa Thành phần hóa học vỏ hoa sữa gồm: chất alkaloid, alkaloid toàn phần vỏ 0,16-0,27% Các chất alkaloid echitenine, ditamine,... biết thành phần hoá học nguồn thực vật làm thuốc phong phú quý giá Việt Nam Chúng chọn hoa sữa làm ñối tượng nghiên cứu cho công trình Tên ñề tài là: Nghiên cứu, xác ñịnh thành phần hóa học vỏ hoa