Nghiên cứu xác định thành phần hóa học thân rễ cây gừng dại ở tỉnh Bình Định
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 117 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN RỄ CÂY GỪNG DẠI Ở TỈNH BÌNH ĐỊNH A STUDY ON THE DETERMINATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS OF WILD GINGER PLANTS RHIZOME FROM BINHDINH PROVINCE Phạm Văn Hai Đại học Đà Nẵng Đinh Thị Diệu Trang Trường THPT chuyên Lê Quý Đôn, Tp. Đà Nẵng TÓM TẮT Bài báo này trình bày về nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của thân rễ cây gừng dại ở Huyện Tây Sơn, Tỉnh Bình Định. Qua thực nghiệm cho thấy kết quả định danh thành phần hóa học của thân rễ bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết soxhlet với ethanol gần như khác nhau cả về số lượng lẫn hàm lượng các cấu tử có trong thân rễ. Với phươ ng pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được các cấu tử chính là: p-Menth- 1-en-4-ol (chiếm 34,61%), β -pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%) và một số cấu tử đã được định danh hoặc chưa định danh khác. Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ đã xác định được thành phần hóa học trong dịch chiết với ethanol gồm 34 cấu tử, trong đó các cấu tử chính là: 2H-Furo 2,3-B Indole, 3,3A,8,8A-Tetrahydro-2,3-dimethyl (29,74%), Dimethyl 4-methyl-1,3-benzendicarboxylate (23,85%); Benzene, 1,3-diisopropyl-5- ethyl (6,77%). Đồng thời bằng các phương pháp phổ hiện đại MS, 13 C-NMR, 1 H-NMR đã phân lập và xác định được cấu trúc chất PD2-C3 với tên khoa học là (8E)-7-(3,4-dimethoxyphenyl) but-7-en-10-ol, có hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá trị MIC = 64 mlg / µ và giá trị IC 50 = 2,21 mlg / µ . ABSTRACT This paper presents a study on the extraction and determination of chemical composition of wild ginger plants rhizome from Tayson District, Binhdinh Province. Our experimental determination results show that, through a distillation with steam and soxhlet extraction with an ethanol method, there are almost differences in the essential oil composition and its content in the wild ginger plants rhizome. The oil extracted from rhizomes with the steam distillation method contains the main components such as p-Menth-1-en-4-ol (accounting for 34.61%), β -pinene (30.35%), Cyclohexene-1.5-trimethyl-1-methylene (2.06%) and other components that have been identified or not. The constituents of methanol extracted from wild ginger plants rhizome, which have been investigated by GC/MS, contain 34 compounds in which the main components and their contents in percentage comprise 2H-Furo 2.3-B Indole, 3.3A,8,8A-Tetrahydro-2.3-dimethyl (29.74%), Dimethyl 4-methyl-1.3-benzendicarboxylate (23.85%), Benzene, 1.3-diisopropyl-5-ethyl (6.77%). Also, by modern spectroscopic methods, MS, 13 C-NMR, 1 H-NMR have been isolated and PD2-C3 compound structure has been determined with its science name of (8E)-7-(3.4- dimethoxyphenyl) but-7-en-10-ol. It has an activity resistant to Staphylococcus aureus strains with the MIC and IC 50 values = 64 mlg / µ and 2.21 mlg / µ respectively. 1. Đặt vấn đề Cây gừng dại (Zingiber Montanum J.Konig) thuộc họ gừng (Zingiberaceae). TP CH KHOA HC V CễNG NGH, I HC NNG - S 1(42).2011 118 Loi cõy ny mc hoang di mt s tnh Min Bc nc ta nh Ba Vỡ (H Tõy) v cỏc tnh phớa Nam nh Tõy Sn (Bỡnh nh) [1]. Ti thnh ph Qui Nhn v huyn Tõy Sn tnh Bỡnh nh, cõy gng di c trng i tr bng thõn r. Thõn r ca cõy l ngun dc liu quớ trong y hc nh: cha l món tớnh, tr giun, dựng cho ph n sau khi sinh, thp khp, viờm gõn, cha bnh x gan c trng . v ó cú nhiu trng hp khi bnh [5], [6], [7], [8]. Theo chỳng tụi cha cú cụng trỡnh no nghiờn cu v loi cõy ny. Vỡ vy, chỳng tụi tin hnh nghiờn cu v chit tỏch v xỏc nh thnh phn húa hc ca dch chit gng di tnh Bỡnh nh nhm úng gúp vo vic khai thỏc v s dng cú hiu qu khoa hc loi cõy ny. 2. Thc nghim 2.1. Nguyờn liu Thõn r gng di c thu hỏi t thỏng 09/2009 Qui Nhn, Bỡnh nh. Mu cõy ó c Th.S Nguyn Quc Bỡnh Vin bo tng thiờn nhiờn Vit Nam giỏm nh v xỏc nh tờn khoa hc ca loi gng ny l Zingiber montanum (J.Koening). Gng ti thu mua v c ct thnh tng lỏt mng, sy khụ nhit t 55-60 0 C. Nghin mu khụ thnh bt, bt ny em chit vi cỏc dung mụi cú phõn cc khỏc nhau. 2.2. Thit b v húa cht Thit b v húa cht gm b chit soxhlet, bn mng nhụm trỏng sn silicagel Merck 60F254 dy 0,2mm dựng cho sc ký bn mng, silicagel Merck 60, c ht 0,040-0,063 mm dựng cho sc ký ct. Ph khi kt hp sc ký khớ (GC-MS): h GC cú model 8000 series (ct tỏch mao qun BP-5 cú kớch thc: 30m x 0,25mm x 0,25àm, khớ mang heli, dung mụi n-hexan) ghộp mỏy MS-MD 800. Ph cng hng t ht nhõn (NMR) ghi trờn mỏy Bruker Avance 500MHz, dung mụi CHCl 3 ti Vin Húa hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam. 2.3. Phõn tớch thnh phn húa hc thõn r gng di Bỡnh nh [2] Thnh phn húa hc thõn r gng di trong tinh du thu c bng phng phỏp chng ct lụi cun hi nc v ngõm chit soxhlet trong dung mụi ethanol u c phõn tớch bng cỏc thit b ph khi kt hp sc ký khớ (GC-MS). 2.4. Phõn lp cu t chớnh [3] Dch chit thõn r gng di trong ethanol, em cụ ui dung mụi thu c cao ethanol, cú mu nõu en c em phõn lp bng sc kớ ct silicagel vi h dung mụi ra gii l hexan: etyl axetat = 5:5 thu c phõn on 2. T phõn on 2, em cụ ui dung mụi v phõn lp bng sc kớ ct silicagen vi h dung mụi ra gii l hexan: etyl axetat = 4:6 thu c cht PD2-C3 cú mu vng nht. 3. Kt qu v tho lun 3.1. Thnh phn hoỏ hc ca tinh du thõn r gng di Ph GC-MS ca tinh du thõn r gng di c trỡnh by hỡnh 1 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 119 Hình 1. Phổ GC-MS của tinh dầu thân rễ gừng dại Kết quả định danh bằng phương pháp tra cứu thư viện phổ với các tín hiệu pic cộng hưởng trên phổ đồ hình 1 cho thấy tinh dầu thân rễ gừng dại có 26 cấu tử, trong đó có các cấu tử chính là: p-Menth-1-en-4-ol (chiếm 34,61%), β -pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%) và một số cấu tử với hàm lượng rất bé đã được định danh hoặc chưa xác định. 3.2. Thành phần hóa học của dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol Phổ GC-MS của dịch chiết thân rễ gừng dại trong etanol được trình bày ở hình 2 Hình 2: Phổ GC-MS của dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol. Kết quả định danh bằng phương pháp tra cứu thư viện phổ với các tín hiệu pic cộng hưởng trên phổ đồ hình 2 cho thấy dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol có 34 chất, trong đó cấu tử chính là 2H-Furo 2,3-B Indole, 3, 3A,8, 8A- Tetrahydro-2,3- dimethyl (29,74%) và Dimethyl 4-methyl-1,3-benzenedicarboxylate (23,85%). 3.2. Phân lập và xác định cấu trúc chất PD2-C3 Dịch chiết thân rễ gừng dại trong etanol, đem cô đuổi dung môi thu được cao ethanol có màu nâu đen được đem phân lập bằng sắc kí cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là hexan: etyl axetat = 5:5, tốc độ rửa giải là 25 giọt/phút. Kết quả chúng tôi thu được 90 eclen, mỗi eclen là 5ml. Kiểm tra 90 eclen này bằng sắc kí bản mỏng chúng tôi chia 90 eclen này thành 4 phân đoạn. Trong 4 phân đoạn này thì sắc kí bản mỏng của phân đoạn hai là có một vệt tròn rõ nhưng vẫn còn “đuôi” ở phía sau nên phân đoạn 2 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 120 vẫn chưa phải là chất tinh khiết. Kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn 2 bằng sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Kết quả cho thấy phân đoạn 2 có 11 chất và chất chiếm hàm lượng cao nhất là 84,1%. Từ phân đoạn 2 của cột thứ nhất, đem cô đuổi dung môi và chạy sắc kí cột lần 2 với hệ dung môi rửa giải là hexan: etyl axetat = 4:6, cột sắc kí dài 40cm, đường kính 1cm, tỉ lệ chất rắn và silicagel là 1/40. Kết quả thu được 40 eclen, mỗi eclen là 3ml. Sau khi tiến hành sắc kí bản mỏng chúng tôi chia 40 eclen này thành 3 phân đoạn. Trong đó phân đoạn 2 cho một vệt tròn rõ. Kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn 2, cột 2 bằng sắc kí HPLC. Kết quả hợp chất chiếm hàm lượng cao nhất trong phân đoạn 2, cột 2 là 95,5%. Với phần trăm cấu tử chính là 95,5% thì có thể coi phân đoạn 2 cột 2 thu được chất tinh khiết (chất PD2-C3) * Cấu trúc c ủa chất PD2-C3 được xác định thông qua các phổ 1 H-NMR, 13 C- NMR, HMBC, HSQC. Từ thông tin của phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR chúng tôi dự kiến chất PD2-C3 có chứa vòng benzen vì độ dịch chuyển δ của vòng benzen của phổ 13 C-NMR là 100- 140ppm, của phổ 1 H-NMR là 7-8ppm. Trên phổ 13 C-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 12 cacbon. Đồng thời cùng với phổ DEPT 90, DEPT 135 cho phép ta khẳng định trong 12 C này có 5 nhóm CH, 2 nhóm CH 2 , 2 nhóm CH 3 và 3C bậc 4. Trong đó 2 tín hiệu của nhóm CH 3 có δ = 56,91ppm và δ = 56,80ppm, chứng tỏ nhóm CH 3 này liên kết với oxi vì δ của nhóm - OCH 3 nằm trong khoảng từ 35-55ppm, còn nhóm C-CH 3 có δ = 20-40ppm. Các giá trị độ dịch chuyển ứng với vòng benzen bao gồm: 2 C bậc 4 (δ = 149,03ppm, δ = 148,59ppm), chứng tỏ 2 cacbon này liên kết với nhóm có hiệu ứng hút e (2 nhóm -OCH 3 ), 1 C bậc 4 có δ = 130,43ppm tương ứng với C liên kết với C khác ở ngoài vòng benzen, 3 nhóm CH còn lại của vòng benzen có độ dịch chuyển lần lượt là 119,12ppm, 111,19ppm và 108,64ppm. Tín hiệu của 2 nhóm CH của cặp C mang nối đôi ở ngoài vòng benzen tại δ = 132,42 và 124,35 ppm. Tín hiệu của 2 nhóm oximetoxi (OCH 3 ) tại δ = 56,91ppm và 56,80ppm. Tín hiệu của nhóm CH 2 tại δ = 36,63 và CH 2 OH tại δ = 62,08ppm. Hình 3. phổ 13 C-NMR của chất PD2-C3 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 121 Hình 4. Phổ DEPT của chất PD2-C3. Như đã phân tích ở phổ 13 C-NMR, vòng benzen này có 3 nhóm thế. Điều này lại tiếp tục được khẳng định thêm lần nữa vì phổ 1 H-NMR chỉ xuất hiện 3 tín hiệu của 3H còn lại trên vòng benzen tại δ 6.92 (1H, d, J= 2.0 Hz), 6.89 (1H, dd, J= 2.0, 8.0 Hz), và 6.80 (1H, d, J= 8.0 Hz). Tín hiệu của cặp proton nối đôi tại δ 6.42 (1H, d, J= 16.0 Hz)/6.07 (1H, m) có hằng số tương tác J lớn chứng tỏ hợp chất có cấu hình dạng trans. Ngoài ra, tín hiệu của 2 nhóm oximetyl tại δ 3.88 (3H, br s) và 3.86 (3H, br s), tín hiệu của nhóm metylen tại δ 2.47 (2H, m) và tín hiệu của nhóm oximetilen cộng hưởng tại δ 3.75 (2H, t, J= 6.5Hz). Hình 5. Phổ 1 H-NMR của chất PD2-C3 Từ những phân tích dựa vào phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR chúng tôi dự kiến chất PD2-C3 có thể có những công thức cấu tạo như sau: OH OCH 3 OCH 3 , OH OCH 3 H 3 CO , OH OCH 3 H 3 CO , (1) (2) (3) OH OCH 3 OCH 3 , OH OCH 3 H 3 CO , OH OCH 3 H 3 CO 9 1 3 5 (4) (5) (6) Dựa theo công trình khoa học đã công bố [4] cho thấy trong tinh dầu và dịch TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 122 chiết gừng dại có hợp chất với công thức cấu tạo như hợp chất số 6. Vì vậy chúng tôi tiến hành phân tích phổ HSQC, HMBC cho hợp chất số 6. Trên phổ hai chiều HSQC cho ta gán chính xác các tương tác gần của proton tương ứng liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng. Vị trí cacbon δ ppm 13 C-NMR chất PD2-C3 Vị trí H δ ppm 1 H-NMR chất PD2-C3 2 108,64 2 6,92 5 111,19 5 6,80 6 119,12 6 6,89 7 132,42 7 6,42 8 124,35 8 6,07 9 36,33 9 2,47 10 62,08 10 3,75 Hình 6. phổ HSQC của chất PD2-C3 Các tương tác xa HMBC cho ta ghép mảnh cấu trúc chính xác. Tương tác xa của proton trong vòng thơm ABX: tương tác của H-2 (6.92, d, J= 2.0 Hz) với δ 132.42 (C- 7), với 149.03 (C-3); tương tác của H-5 (6.80, d, J= 8.0 Hz) với δ 148.58 (C-4), với δ 119.12 (C-6); tương tác của H-6 (6.89, dd, 2.0, 8.0 Hz) với δ 130.43 (C-1), 108.64 (C- 2), 148.58 (C-4). Tương tác của cặp proton nối đôi, δ 6.41 (1H, d, J= 16.0 Hz, H-7) với δ 124.35 (C-8), 36.33 (C-9); tương tác của δ 6.07 (1H, m, H-8) với δ 132.42 (C-7), 36.33 (C-9), 62.08 (C-10); tương tác của 3.75 (2H, t, J= 6.5 Hz, H-10) với δ 124.35 (C- 8), 36.33 (C-9). Tín hiệu tương tác xa của 2 nhóm metoxi cũng được nhận biết rõ ràng trên phổ. Các tương tác được diễn tả dưới hình vẽ dưới đây. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 123 OH O O Một số tương tác chính trên phổ HMBC của PD2-C3 Hình 7. Phổ HMBC của chất PD2-C3 Các số liệu phổ gắn kết các mảnh của cấu trúc cho ta khẳng định công thức phân tử của hợp chất là C 12 H 16 O 3 , tương ứng với khối lượng phân tử là M= 208. Hợp chất có tên khoa học là (8E)-7-(3,4-dimethoxyphenyl)but-7-en-10-ol. 3.3. Thăm dò hoạt tính sinh học của chất PD2-C3 Chất PD2-C3 được chúng tôi đem thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Phòng thử hoạt tính sinh học phòng 602 nhà A 18 Viện Hóa học. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC, IC 50 , MBC. Đối tượng thử: các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh. Cách tiến hành: - Pha loãng mẫu thử: mẫu thử ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 mlg / µ và với chất sạch là 128 mlg / µ . - Thử hoạt tính: lấy 10 µ l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µ l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.10 5 CFU/ml, ủ ở 37 0 C/24h. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 124 - Xử lí kết quả: Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Gía trị IC 50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data. Gía trị MBC được xác định số khuẩn lạc trên đĩa thạch. Kết quả thăm dò hoạt tính kháng sinh được trình bày ở bảng 1: Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh chất PD2-C3 Tên chủng vi sinh vật và nấm kiểm định Gram + Gram - Nấm L. fermentum B. subtilis S. aureus S.enterica E. coli P.aeruginosa C.albican Tên mẫu MIC IC 50 MIC IC 50 MIC IC 50 MIC IC 50 MIC IC 50 MIC IC 50 MIC IC 50 PD2- C3 >256 >256 >256 >256 64 2.21 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 Như vậy: chất PD2-C3 thể hiện hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá trị MIC = 64 mlg / µ và giá trị IC 50 = 2,21 mlg / µ . Chất PD2-C3 thể hiện tính kháng khuẩn vì mạch cacbon có hệ liên hợp và chứa nhóm ancol (là một trong những nhóm thể hiện tính kháng khuẩn). 4. Kết luận Qua nghiên cứu chúng tôi thu được một số kết quả sau: 1. Thông qua phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã thu được các cấu tử chính trong thân rễ gừng dại Bình Định là: p-Menth-1-en-4-ol (chiếm 34,61%), β -pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%) và một số cấu tử khác với hàm lượng rất bé. Đồng thời xác định được thành phần hoá học của một số cấu tử chính của dịch chiết thân rễ gừng dại Bình Định trong ethanol: là 2H-Furo 2,3-B Indole, 3, 3A,8, 8A- Tetrahydro-2,3-dimethyl (29,74%) và Dimethyl 4-methyl-1,3- benzenedicarboxylate (23,85%). 2. Bằng các phương pháp sắc kí và các phương pháp phổ đã phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất PD2-C3, với tên khoa học là: (8E)-7-(3,4- dimethoxyphenyl)but-7-en-10-ol. 3. Hợp chất PD2-C3 thể hiện rõ hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá tr ị MIC = 64 mlg / µ và giá trị IC 50 = 2,21 mlg / µ . TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội [2] Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lí và hóa lí (tập 1), Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội. [3] Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [4] Sombat Wannauppthamkul (2003), Plaitanoids TM , The Innovation Development Fund & International Laboratories Corp., Ltd. Thailand. [5] http://chothuoc24h.com/caythuoc . [6] http://vietbao.vn/Suc-khoe/Cu-gung-gio-trong-dieu-tri-xo-gan . [7] http://www.ncbi.nml.nih.golentrez/query/fcgi?cmd=retieve&db=pumed&list- uids=1804588&dopt=abstract. [8] http://www.sc.chula.ac.th/department/chemistry/npru/6Senior/Abs-senior.html. . thành phần hóa học của thân rễ cây gừng dại ở Huyện Tây Sơn, Tỉnh Bình Định. Qua thực nghiệm cho thấy kết quả định danh thành phần hóa học của thân rễ. CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - SỐ 1(42).2011 117 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THÂN RỄ CÂY GỪNG DẠI Ở TỈNH BÌNH ĐỊNH A STUDY