Đang tải... (xem toàn văn)
Sử dụng công nghệ sinh học hiện đại là Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống cây Nưa trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng, tạo ra số lượng lớn cây nưa giống trong thời gian ngắn,. cCây nưa được tạo ra trong quy trình này có chất lượng cao, sạch bệnh, đồng đều và khỏe mạnh., Đđáp ứng được nhu cầu sản xuất và phục vụ bảo tồn.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT SẢN PHẨM NHIỆM VỤ Nhiệm vụ: KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN CÁC LOÀI NƯA (Amorphophallus spp.) GIÀU GLUCOMANNAN SẢN PHẨM SỐ 6: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN NHANH GIỐNG CÂY NƯA (Amorphophallus spp.) BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Tác giả: TS Lê Xuân Đắc Hà Nội - 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT SẢN PHẨM NHIỆM VỤ Nhiệm vụ: KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN CÁC LOÀI NƯA (Amorphophallus spp.) GIÀU GLUCOMANNAN SẢN PHẨM SỐ 6: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN NHANH GIỐNG CÂY NƯA (Amorphophallus spp.) BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Người thực hiện TS Lê Xuân Đắc Chủ nhiệm đề tài PGS TS Trần Huy Thái Cơ quan chủ trì MỤC LỤC MỤC LỤC THÔNG TIN CHUNG Nguồn gốc xuất xứ: Điều kiện áp dụng: QUY TRÌNH KỸ THUẬT Tên quy trình Mục đích quy trình 3 Các thuật ngữ chữ viết tắt Cơ sở khoa học .3 Vật liệu phương pháp .5 Các bước tiến hành Sản phẩm quy trình Mức độ lặp lại .7 Sơ đồ tổng quát Quy trình nhân nhanh giống Nưa (Amorphophallus spp.) công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật TÀI LIỆU THAM KHẢO THÔNG TIN CHUNG Nguồn gốc xuất xứ: Quy trình sản phẩm nghiên cứu khoa học đề tài “Khai thác phát triển nguồn gen loài Nưa (Amorphophallus spp.) giàu glucomannan” Mã số: Điều kiện áp dụng: quan, tổ chức, cá nhân… nghiên cứu nhân giống Nưa công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đối tượng củ Nưa Củ loài Nưa có chất lượng cao, có nhu cầu nhân giống nhanh với số lượng lớn thời gian ngắn phục vụ sản xuất áp dụng quy trình QUY TRÌNH KỸ THUẬT Tên quy trình Quy trình nhân nhanh giống Nưa (Amorphophallus spp.) công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Mục đích quy trình Sử dụng công nghệ sinh học hiện đại Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống Nưa ống nghiệm điều kiện vô trùng, tạo số lượng lớn nưa giống thời gian ngắn, cCây nưa tạo quy trình có chất lượng cao, bệnh, đồng khỏe mạnh., Đđáp ứng nhu cầu sản xuất phục vụ bảo tồn Các thuật ngữ chữ viết tắt AMNA2: Môi trường nhân nhanh Nưa; ARNA3: Môi trường tạo Nưa hoàn chỉnh; BAP: 6-Benzyl Amino Purin; MS: Môi trường dinh dưỡng Murashige Skoog (1962); NAA: α-Naphthalen Acetic Acid; Nuôi cấy mô tế bào: Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ống nghiệm điều kiện vô trùng Cơ sở khoa học Chi Nưa (hay Khoai Nưa) - Amorphophallus thuộc họ Ráy (Araceae), Ráy (Arales), lớp Một mầm (Monocotyledone) Trên giới chi Nưa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới thuộc châu Phi Đông Nam Á Ở Việt Nam chi bao gồm khoảng 25 loài Hiện nay, nhiều loài Nưa nghiên cứu triển khai trồng với diện tích lớn nhiều nước Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand (Nguyễn Văn Dư, 2005; An et al., 2010; Chen et al., 2006, Douglas et al., 2005) Trong chi Nưa, số loài củ có chứa nhiều bột glucomannan, loại bột dùng nhiều thực phẩm thực phẩm chức điều chỉnh nồng độ đường, làm giảm tỷ lệ mỡ máu, làm giảm thèm ăn người béo phì Ở Việt Nam có phân bố số loài Nưa có hàm lượng glucomannan tương đối cao, có triển vọng phát triển thành nguồn nguyên liệu sản xuất bột glucomannan, số có loài Nưa krausei (Amorphophallus krausei) Cây Nưa giá trị mặt thực phẩm mà có ý nghĩa việc chống xói mòn đất, trì ổn định thảm thực vật giúp cân hệ sinh thái (Nguyễn Văn Dư, 2005; Đỗ Tất Lợi, 2005; An et al.; 2010, Joyce and Barbara, 2005) Trong tự nhiên, Nưa nhân giống từ hạt sinh sản sinh dưỡng cách củ mẹ sinh củ Tuy nhiên, Việt Nam số lượng loài Nưa tự nhiên không lớn, nên lượng củ giống phục vụ cho sản xuất hạn chế Bên cạnh đó, việc sử dụng giống hạt khó khăn loài Nưa thường vài năm hoa lần, việc tìm thu lượm hạt để phục vụ sản xuất khả thi Vì vậy, muốn phát triển nguồn nguyên liệu củ Nưa để sản xuất bột glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm thực phẩm chức vấn đề nghiên cứu biện pháp để nhân giống Nưa quan trọngcần thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt chứng tỏ khả ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực, đặc biệt nhân nhanh bảo tồn loài thực vật quý hiếm, giống trồng có giá trị kinh tế cao (Nguyễn Thanh Danh CS, 2005; Nguyễn Văn Dư, 2012; Nguyễn Văn Vịnh, 2005; Hu et al., 2008) Từ sở lý luận thực tiễn cho thấy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống Nưa (Amorphophallus spp.) công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để phục vụ sản xuất bảo tồn giống cần thiết Quy trình nhằm nhân nhanh Nưa ống nghiệm để tạo số lượng lớn đồng cá thể Nưa thời gian ngắn đảm bảo Nưa bệnh có chất lượng cao Vật liệu phương pháp 5.1 Vật liệu Củ loài Nưa bệnh, có chất lượng cao, tuyển chọn Các thiết bị, hóa chất thuộc Hhệ thống phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhà lưới, vườn ươm… Trong quy trình áp dụng cho loài Nưa, gồm: Nưa vân nam, Nưa krausei, Nưa đầu nhăn 5.2 Phương pháp sử dụng Quy trình sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống Nưa ống nghiệm - Phương pháp tạo nguyên liệu vô trùng ống nghiệm; - Phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh ống nghiệm; - Phương pháp tạo hoàn chỉnh; - Phương pháp trồng bầu đất Các bước tiến hành Bước 1: Tạo nguyên liệu vô trùng ống nghiệm - Thời gian: - tuần - Chọn mẫu củ Nưa bệnh, có chất lượng cao, tuyển chọn Giâm củ cát ẩm để kích thích nảy chồi, sau khoảng - tuần củ xuất hiện chồi mầm dài - 2cm - Dùng nước xà phòng loãng rửa mẫu chồi - lần; Dùng dao chuyên dụng cắt bỏ phần đỉnh sinh trưởng, cắt lấy đỉnh sinh trưởng có kích thước khoảng - cm để khử trùng - Dùng nước xà phòng loãng rửa mẫu chồi - lần; Dùng dao chuyên dụng cắt bỏ phần đỉnh sinh trưởng, tách lấy đỉnh sinh trưởng chồi có kích thước khoảng - cm để khử trùng - Chồi sau tách khỏi củ mẹ cho vào bình chuyên dụng để khử trùng, sử dụng bình pirex 250 ml Các thao tác thực hiện điều kiện vô trùng box cấy vô trùng - Khử cồn 70% 30 giây, khử trùng dung dịch javel (NaClO 1%) 10 phút, lắc nhẹ liên tục Rửa nước cất vô trùng lần Cấy đỉnh sinh trưởng vào bình nuôi có chứa môi trường dinh dưỡng: MS + 20g/l đường + 8g/l agar Mật độ cấy - mẫu/ bình tam giác 250 ml Bước 2: Tạo đa chồi để nhân nhanh ống nghiệm - Thời gian: - tuần - Sau nuôi cấy đỉnh sinh trưởng khoảng - tuần, đỉnh sinh trưởng phát triển thành chồi non dài khoảng - 3cm Dùng dao cắt bỏ phần cuống lá, cắt chồi theo chiều dọc thành - mẫu; - Cấy mẫu vào bình nuôi có chứa môi trường nhân AMNA2: MS + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA - Sau tuần từ mẫu nuôi cấy tạo - chồi con, tách chồi lớn cụm chồi nhỏ để cấy tiếp môi trường nhân tạo hoàn chỉnh Mật độ cấy -7 chồi/ bình tam giác 250 ml Bước 3: Tạo hoàn chỉnh - Thời gian: - tuần - Chọn chồi to khỏe cụm chồi nuôi môi trường nhân chồi, có chiều cao 1,5 - 2,0 cm Dùng mũi dao tách riêng rẽ chồi, nguyên phần gốc - Cấy chồi đơn lẻ môi trường tạo hoàn chỉnh ARNA3: MS + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 0,3 mg/l NAA Mật độ cấy -10 chồi/ bình tam giác 250 ml Bước 4: Trồng bầu đất - Thời gian: - tuần - Cây môi trường tạo hoàn chỉnh ARNA3 sau 3- tuần có đầy đủ rễ, chiều cao - cm, có từ - rễ dài từ - cm Dùng panh gắp nhẹ để lấy từ bình nuôi Rửa agar bám quanh rễ, xử lí dung dịch chống nấm mốc phút trước trồng bầu - Bầu túi cốc nilon màu đen có đục lỗ thoát nước có kích thước x 10 cm Giá thể để trồng bầu trấu hun : đất (tỷ lệ 1:4) - Cây trồng vào bầu, phần gốc sâu cách bề mặt 1cm, dùng tay ấn nhẹ vừa phải Đặt bầu vào khay, dùng bình phun sương tưới nhẹ đủ ẩm, dùng nilon màu trắng có đục lỗ để che kín toàn khay Đặt khay nhà lưới có mái che Hàng ngày tưới phun sương - lần Sau ngày bắt đầu rễ mới, bỏ che nilon, tưới bình thường Sau 30 ngày, chuyển trồng vườn ươm đồng ruộng Sản phẩm quy trình Sản phẩm Quy trình nhân nhanh giống Nưa công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Nưa giống trồng bầu đất trấu hun, có chất lượng cao, bệnh, đồng khỏe mạnh Cây cao 10 - 13 cm, cứng cáp, màu xanh đậm Đạt tiêu chuẩn để trồng vườn ươm cấp đồng ruộng để thu củ giống nguyên chủng Mức độ lặp lại Quy trình dễ dàng thực hiện phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật sở có đủ điều kiện nhân giống loại trồng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Sơ đồ tổng quát Quy trình nhân nhanh giống Nưa (Amorphophallus spp.) công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Chọn lọc củ Nưa bệnh, có chất lượng cao Giâm cát ẩm - tuần Bước 1: Tạo nguyên liệu vô trùng ống nghiệm Rửa mẫu, cắt tách đỉnh sinh trưởng kích thước - cm Khử trùng cồn 70% 30 giây, dung dịch javel (NaClO 1%) 10 phút Cấy đỉnh sinh trưởng môi trường: MS + 20g/l đường + 8g/l agar Mật độ - mẫu/ bình - tuần Bước 2: Tạo đa chồi để nhân nhanh ống nghiệm Cắt chồi thành - mẫu; Cấy mẫu môi trường nhân AMNA2: MS + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA Mật độ -7 chồi/ bình - tuần - tuần Tiếp tục cấy môi trường AMNA2 để nhân nhanh - tuần Bước 3: Tạo nguyên liệu vô trùng ống nghiệm Chọn chồi to khỏe, chiều cao 1,5 - 2,0 cm Cấy chồi môi trường tạo hoàn chỉnh ARNA3: MS + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 0,3 mg/l NAA Mật độ - 10 chồi/ bình - tuần Cây có đủ rễ, cao - cm, trồng vào bầu nilon (7 x 10 cm) Giá thể trấu hun : đất (1:4) Bước 4: Tạo nguyên liệu vô trùng ống nghiệm - tuần Trồng ườn ươm đồng ruộng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Hà Hồng Hải, Kết bước đầu nhân giống in vitro Vù hương (Cinamomum balansae Licomte) kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học, Hội nghị toàn quốc: Nghiên cứu Khoa học sống, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2005, 450-453 Nguyễn Văn Dư, Araceae Juss - họ Ráy, Danh lục loài thực vật Việt Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 2005, 3: 871-897 Nguyễn Văn Dư, Nghiên cứu trồng phát triển Nưa konjac (Amorphophallus konjac K Koch) số loài khác chi Nưa (họ Ráy – Araceae) Việt Nam hướng tới việc lấy củ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm thuốc điều trị bệnh tiểu đường, mỡ máu béo phì, Báo cáo tổng kết đề tài Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội, 2012 Lê Xuân Đắc, Nguyễn Văn Dư, Nhân nhanh Nưa (Amorphophallus krausei) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nhiệt đới, 2014, 6(3): 37-55 Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 2005 Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 526527 An NT, Thien DT, Dong NT, Dung PL, Du NV, Characterization of glucomannan from some Amorphophallus species in Vietnam, Carbohydrate Polymers, 2010, 80(1): 308-311 Anil SR, Siril E A., Beevy SS (2012), In vitro propagation strategies for Elephant Foot Yam (Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson, Journal of Root Crops, 38(2): 97-108 Chen HL, Cheng HC, Liu YJ, Liu SY, Wu WT, Konjac acts as a natural laxative by increasing stool bulk and improving colonic ecology in healthy adults, Nutrition, 2006, 22: 1112-1119 10.Douglas, JA, Follett JM, Waller JE, Reseach on Konjac (Amorphophallus konjac) production in New Zealand Acta Hort, 2005, (ISHS) 670:173-180 11 Hu JB, Gao XX, Liu J, Xie CH, Li JW, Plant regeneration from petiole callus of Amorphophallus albus and analysis of somaclonal variation of regenerated plants by RAPD and ISSR markers, Botanical Studies, 2008, 49: 189-197 12 Joyce K, Barbara S, Glucomannan and obesity: A critcal review, Alternative therapies, 2005, 11(6): 30-34 13 Murashige T, Skoog F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 1962, 15: 475 - 497 10 ... xuất áp dụng quy trình QUY TRÌNH KỸ THUẬT Tên quy trình Quy trình nhân nhanh giống Nưa (Amorphophallus spp.) công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Mục đích quy trình Sử dụng công nghệ sinh... nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhà lưới, vườn ươm… Trong quy trình áp dụng cho loài Nưa, gồm: Nưa vân nam, Nưa krausei, Nưa đầu nhăn 5.2 Phương pháp sử dụng Quy trình sử dụng phương pháp nuôi. .. Điều kiện áp dụng: QUY TRÌNH KỸ THUẬT Tên quy trình Mục đích quy trình 3 Các thuật ngữ chữ viết tắt Cơ sở khoa