Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio

Header Page of 126 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2012 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM TẠ Đầu tiên xin chân thành gởi lời tri ân đến quý Thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, truyền đạt kiến thức quý báo suốt trình học nghiên cứu trường Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn học tập Trần Thị Tuyết Hoa, với Thầy cô anh chị môn Thủy sinh học ứng dụng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Và xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình người thân tạo điều kiện, tình yêu thương, động viên vật chất tinh thần suốt thời gian học hoàn thành luận văn Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS – K35 hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ suốt thời gian qua Chân thành cảm ơn! i Footer Page of 126 Header Page of 126 TÓM TẮT Đề tài thực nhằm chọn lọc hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh Vi khuẩn khảo sát gồm dòng Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm canh tỉnh Sóc Trăng, có khả cải thiện chất lượng nước nâng cao tỉ lệ sống tôm Phương pháp đục lỗ thạch áp dụng để kiểm tra đặc tính tương thích dòng vi khuẩn Bacillus, dòng vi khuẩn không đối kháng lẫn kết hợp lại tạo hỗn hơp Tượng tự thí nghiệm kiểm tra khả đối kháng nhóm Vibrio dòng/hỗn hợp Bacilus tìm với tiêu đánh giá đường kính vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch Kết tìm hỗn hợp nhóm vi khuẩn sau thể tương thích lẫn nhau: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67) Kết khảo sát cho thấy có tổng số dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) có khả đối kháng vi khuẩn Vibrio Có hỗn hợp tuyển chọn H2 (B2, B8, B41), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) dựa hai tiêu chí đặc tính tương thích dòng vi khuẩn Bacillus khả đối kháng Vibrio Tất hỗn hợp chọn lọc thể đặc tính đối kháng Vibrio, nhiên mức độ khác Trong khả kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh hỗn hợp H7 (0,56 cm), H2 (0,70 cm); Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) H9 (0,60 cm) có khả đối kháng vượt trội hẳn hỗn hợp lại ii Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH iv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT iv Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài: 1.3 Nội dung đề tài: 1.4 Thời gian thực đề tài: Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm vai trò nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học 2.1.2 Vai trò 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Vibrio gây động vật thủy sản 2.3 Một giải pháp thay kháng sinh - Probiotic 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng thủy sản Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.1.1 Thiết bị dụng cụ 12 3.1.1 Nguồn vi khuẩn 12 3.1.3 Môi trường nuôi 12 3.1.1 Hóa chất 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích dòng Bacillus chọn lọc 13 3.3.2 Khảo sát khả đối kháng Vibrio gây bệnh dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc 16 3.3.3 Khảo sát khả đối kháng Vibrio gây bệnh hỗn hợp Bacillus 18 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 20 3.4 Phương pháp xử lí số liệu 20 4.1 Kết khảo sát đặc tính tương thích dòng Bacillus chọn lọc 22 4.2 Kết khảo sát khả đối kháng Vibrio dòng Bacillus 23 4.3 Kết khảo sát khả đối kháng Vibrio hỗn hợp Bacillus 24 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 35 iii Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Đặc tính tương thích dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) Vibrio đối kháng dòng vi khuẩn Bacillus 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) Vibrio đối kháng hỗn hợp vi khuẩn Bacillus 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi nuôi tăng sinh vi khuẩn môi trường TSB 14 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích phương pháp đục lỗ thạch 15 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn dòng vi khuẩn riêng lẻ phương pháp đục lỗ thạch 17 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn hỗn hợp vi khuẩn phương pháp đục lỗ thạch 19 Hình 3.5: Dụng cụ qui trình đục lỗ thạch 21 Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn 26 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn môi trường TCBS 28 Hình 4.3: Dịch khuẩn sau ly tâm 28 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn 29 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: CFU: OD: TSB: TSA: TCBS: NA V harveyi B subtillis B cereus Đồng sông Cửu Long Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Optical Density Tryptic Soya Broth Tryptic Soya Agar Thiosulphate citrate bile salt agar Nutrient Agar Vibrio harveyi Bacillus subtillis Bacillus cereus iv Footer Page of 126 Header Page of 126 Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm sú (Penaeus monodon) đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao Việt Nam, đặc biệt vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Tuy nhiên tỉ lệ sống đối tượng thường không ổn định, việc nhiễm bệnh vi khuẩn (chủ yếu nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến suất nuôi Hiện tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi phòng trị bệnh cho tôm nuôi gây tượng kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh Vì vậy, chế phẩm vi sinh (probiotic) trở thành cách tiếp cận thay cho việc sử dụng kháng sinh Tuy nhiên phần lớn chế phẩm vi sinh sử dụng nước có nguồn gốc ngoại nhập không rõ thành phần, chủng loại Các chế phẩm vi sinh phân lập sản xuất nước hạn chế Việc nghiên cứu chọn lựa hỗn hợp dòng vi khuẩn có khả kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc địa phương làm sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh vấn đề cần thiết giai đoạn Bacillus nhóm vi khuẩn nghiên cứu nhiều nhất, có vai trò quan trọng khả sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất enzyme Một số dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67, phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh tỉnh Sóc Trăng chọn lựa nghiên cứu tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” thực 1.2 Mục tiêu đề tài: Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh từ dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn Footer Page of 126 Header Page of 126 1.3 Nội dung đề tài: Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) dòng Bacillus chọn lọc Đánh giá khả đối kháng Vibrio dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Đánh giá khả đối kháng Vibrio hỗn hợp vi khuẩn tuyển chọn 1.4 Thời gian thực đề tài: Từ 09/2012 đến 12/2012 Tại phòng phân tích vi sinh - Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ Footer Page of 126 Header Page of 126 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm vai trò nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn thường tìm thấy môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng điều kiện hiếu khí kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trao đổi khí trình trao đổi chất Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ kết thành chuỗi hay thành sợi Chúng có khả tạo bào tử xảy điều kiện khắc nghiệt thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, phần lớn tế bào có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình đầu Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu Khi gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống que, phần lớn que có bào tử hình oval có khuynh hướng phình đầu Thường người ta quan sát thấy tập đoàn giống sinh vật rộng lớn, có hình dạng bất định phát triển lan rộng Một đặc điểm vi khuẩn Bacillus có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B Subtilis có khả chịu điều kiện khắc nghiệt bao nhầy có khả dự trữ thức ăn bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010) 2.1.2 Vai trò Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Từ lâu Bacillus sử dụng chế phẩm sinh học giúp cải tiến chất lượng nước có số đặc tính probiotic: + Enzym protease: Vi sinh vật tiết enzym ngoại bào phân giải protein chuyển hóa thành phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptid) Các chất tiếp tục phân hủy thành axit amin nhờ peptidaza ngoại bào xâm nhập vào tế bào chuyển hóa thành axit amin Một phần axit amin vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein chúng, phần khác tiếp tục phân giải tạo thành NH3 sản phẩm khác Quá trình gọi khoáng hóa hay amon hóa, trình chuyển hóa hợp chất hữu thành dạng vô (NH3) NH3 chuyển hóa thành NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa Các hợp chất nitrat lại chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ nhóm vi khuẩn khử nitrat Các vi khuẩn tham gia vào trình amon hóa Bacillus mycoides, B subtillis, B cereus, Pseudomonas Aerurinosa, P flourescens… Như vậy, vi khuẩn có khả tổng hợp protease mạnh vi khuẩn thuộc giống Bacillus Pseudomonas + Enzym amylase: Các amylase có nguồn gốc khác thường khác tính chất, chế tác dụng sản phẩm cuối Nhiều vi sinh vật có khả phân giải tinh bột vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn α-amylase chủ yếu tổng hợp từ Bacillus Bacillus subtillis, B licheniformis… Enzym amylase Bacillus subtillis có khối lượng phân tử 900Da Enzym amylase Bacillus subtillis không đòi hỏi phải có chất hoạt hóa, pH tối ưu cho enzym amylase Bacillus subtillis 5,0-6,0 Enzym amylase Bacillus subtillis đông khô bền với canxi axetat natri axetat Enzym α-amylase dùng cho giai đoạn thủy phân trao đổi chất tinh bột Các vi khuẩn Bacillus có khả sinh enzym α-amylase cao Ngày việc thu enzym α-amylase protease từ vi khuẩn chịu mặn chịu kiềm quan Footer Page 10 of 126 Header Page 28 of 126 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát đặc tính tương thích dòng Bacillus chọn lọc Kết khảo sát đặc tính tương thích dòng vi khuẩn Bacillus thể Bảng 4.1 Kết cho thấy đa số dòng đối kháng (không tương thích) lẫn Có nhóm vi khuẩn sau thể tương thích: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67) Từ nhóm vi khuẩn tìm đươc hỗn hợp: H1 (B2, B7, B41), H2 (B2, B8, B41), H3 (B2, B7), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H6 (B7, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) để tiến hành chọn lọc kiểm tra khả đối kháng Vibrio Bảng 4.1: Đặc tính tương thích dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc B2 B7 + B2 B7 + + B8 B9 B17 B37 B38 + + B41 B67 Chú thích: +: Tương thích; B8 + - B9 - + + + -: Đối kháng B17 - B37 - B38 - B41 + + + + - B67 + - - Tính đối kháng khả ức chế phát triển vi sinh vật Hiện người ta xác định nhiều chất có khả ức chế ức chế phát triển vi sinh vật bacteriocin, chất kháng sinh, vi rút xâm nhiễm vi khuẩn,…Ngoài số dòng vi khuẩn Bacillus B subtilis có khả sinh tổng hợp riboflavin, làm cho chủng vi khuẩn có khả cạnh tranh thức ăn với số loài khác Một số loại bacteriocin kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật Thêm vào số nghiên cứu xác định để giúp làm rõ mối quan hệ chất ức chế khác Vì đa số dòng vi khuẩn khảo sát thể đặc tính đối kháng lẫn chúng chung chi Bacillus Kết 22 Footer Page 28 of 126 Header Page 29 of 126 nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh ctv (2010) cho kết tương tự, đa số chủng vi khuẩn tác nhân gây bệnh Vibrio spp phân lập từ ấu trùng tôm sú cá chẽm đối kháng lẫn Nghiên cứu Trần Thị Thu Hiền (2010) tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus T3, T4, T9 khả ức chế kiềm hãm lẫn vào sản phẩm sinh học 4.2 Kết khảo sát khả đối kháng Vibrio dòng Bacillus Với mục tiêu lựa chọn dòng vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng vi khuẩn Vibrio, dòng thử hoạt tính kháng khuẩn chủng vi sinh vật kiểm định Vibrio gây bệnh Sau thời gian 24 kiểm tra vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch thu kết sau: Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) Vibrio đối kháng dòng vi khuẩn Bacillus Kí hiệu dòng B2 Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Vibrio harveyi Vibrio Vibrio harveyi 0986 30953 V (x) a a 0,05±0,05 0,07±0,03 0,12±0,08a B7 - - - B8 0,15±0,05ab 0,23±0,03b 0,20±0,00a B9 0,22±0,03 b 0,16±0,05 ab 0,18±0,03a B17 - - - B37 - - - B38 - c B41 0,47±0,06 B67 0,77±0,13 d c 0,43±0,06b 0,67±0,14d 0,67±0,21c 0,50±0,10 *Những giá trị cột có chữ khác khác biêt có ý nghĩa thống kê (P0,05) khác biệt thống kê với hỗn hợp lại (P0,05) lại khác biệt có ý nghĩa thống kê với hỗn hợp lại (P0,05) khác biệt thống kê với Đường kính vòng tròn vô khuẩn (cm) hỗn hợp lại (P