Báo cáo Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA T.P HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Thầy cô hướng dẫn : Cô Phan Nguyễn Quỳnh Anh Nhóm , chiều thứ 3 Thái Duy Linh Nguyễn Vũ Phương Liên Đặng Quang Trung Kiên Lê Hải Hà Linh Nguyễn Công Khoa Trần Thị Kim Huyền T.P Hồ Chí Minh , Tháng 9/2016 MỤC LỤC MSSV:6130 MSSV:6130 MSSV:6130 MSSV:6130 MSSV:61301853 MSSV:6130 Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ 1.PHƯƠNG THỨC VẬN HÀNH HPLC 1.1.Cách thức chuẩn bị mẫu 1.1.1.Mẫu thử: + Xử lý mẫu thử theo chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc: + Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan pha động, nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu + Phải loại bỏ các chất không tan pha động hoặc không rửa giải cách lọc hay chiết + Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0.2-0.45µm + Nồng độ mẫu mức vừa phải, không vượt quá khả tách cột, có thể gây nghẽn cột 1.1.2.Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống mẫu thử dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống mẫu thử là tốt nhất, ngoài có thể dùng nồng độ khác phải nằm khoảng tuyến tính khảo sát thành phần 1.2.Loại cột sử dụng Dựa vào các tài liệu, Dược điển, thành phần và tính chất các chất có mẫu phân tích, ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hoặc các loại cột khác Thường dùng loại cột pha thuận (NP) và pha đảo (RP) Ngoài số loại cột khác cột CN, cột NH2… 1.2.1.Cột pha thuận (NP) : Silicagel trung tính + Pha tĩnh: Loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực Trên bề mặt có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước + Pha động: Dung môi không phân cực hoặc ít phân cực 1.2.2.Cột pha đảo (RP): Silicagel alkyl hóa + Pha tĩnh: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH bị Alkyl hóa tức là thay nguyên tử H các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP hay RP 18) 2|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ hay các mạch carbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) nó ít phân cực hay phân cực ít Ví dụ cột Lichrosor -Lichrospher RP (ODS), cột Nucleosil C18 Cấu trúc cột ODS + Pha động: Pha động dùng loại này là các dung môi phân cựcPha động dùng loại này là các dung môi phân cực như: methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) Nước là dung môi cho vào các dung môi hữu để giảm khả rửa giải 1.3.Thành phần pha động: Dựa vào các tài liệu, Dược điển, thành phần và tính chất các chất có mẫu phân tích… ta lựa chọn pha động phù hợp để quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn peak trình bày, đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu hoạt động thiết bị Pha động có thể làm thay đổi : + Độ chọn lọc α + Thời gian lưu + Hiệu tách cột + Độ phân giải + Tính đối xứng peak 3|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Do đó, pha tĩnh chọn ta chọn pha động có thành phần phù hợp ta có hiệu suất tách sắc ký tốt hỗn hợp các chất cần phân tích Chính pha động cần có cầu yêu cầu sau: + Pha động phải trơ với pha tĩnh có + Pha động phải hòa tan các chất phân tích rửa giải chúng (đặc biệt phải ý thay đổi pha động phải rửa cột dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có cột, hay pha động có sẵn cột) Ví dụ: đệm phosphat rửa ACN hay MeOH bị kết tủa cột + Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt ít pha động không bị phân hủy suốt thời gian phân tích mẫu + Phải có độ tinh khiết cao + Phải nhanh đạt cân quá trình sắc ký + Phải phù hợp với loại Detector: Ví dụ UV - VIS dung môi không hấp thụ quang (ví dụ acid acetic bước sáng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang dung môi không phát quang + Phải kinh tế, không quá và đắt 1.4.Các chế độ vận hành phân tích mẫu 1.4.1.Chế độ rửa giải Gradient: Pha động với thành phần thay đổi quá trình chạy 4|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Ưu điểm: + Khả tách tốt + Thành phần pha động khá chính xác, đặc biệt với hệ gradient áp suất cao + Có thể thay đổi nhiều thành phần pha động Độ chính xác thành phần theo thời gian gần không đổi + Thời gian phân tích khá ngắn Nhược điểm + Thiết bị đắt tiền hơn, đặc biệt là hệ gradient áp suất cao + Độ chính xác thành phần pha động hệ isocratic + Khi thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động chính xác và không ổn định 1.4.2.Chế độ Isocratic: Thành phần pha động không thay đổi suốt quá trình Ưu điểm: + Thành phần pha động chính xác + Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền 5|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ + Đường nền ổn định thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu dò thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu độ dẫn (CDD), đo số khúc xạ (RI)… + Thành phần pha động có thể trộn trước tay hoặc trộn liên tục Nhược điểm: + Khả tách kém, đặc biệt các mẫu phức tạp + Việc khảo sát thay đổi thành phần pha động cho phù hợp thành phần mẫu thực hiện nhanh + Thời gian phân tích dài muốn tách tốt + Nếu trộn trước (khi không có gradient áp suất thấp) thành phần pha động có thể thay đổi theo thời gian để lâu 2.NHẬN XÉT VÀ TÍNH TOÁN VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH 2.1.Đề Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC có thông số sau : - Chiều dài cột : 150 mm Tốc độ dòng :0.8 ml/phút Thể tích pha động (Vm): 1.6 ml Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,752 ml Sau cho qua cột, hỗn hợp curcuminoid, thu sắc ký đồ (như file đính kèm) với liệu sau : - Thời gian lưu cấu tử không bị lưu giữ cột (tM) : 1.5 phút Hỗn hợp curcuminoid thu gồm thành phần chính: BDMC (BisDemethoxycurcumin), DMC (demethoxy curcumin) và curcumin I Curcumin I 6|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Demethoxy curcumin (DMC) Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) 2.2 Phương pháp sắc ký sử dụng phương pháp pha thuận hay pha đảo ? Vì ? + Phương pháp sắc ký sử dụng là phương pháp pha đảo + Hỗn hợp curcuminoid gồm ba thành phần chính: BDMC (Bis-Demethoxycurcumin), DMC (Demethoxy curcumin), Curcumin I Cả ba thành phần hỗn hợp đều là chất phân cực, dung môi muốn hòa tan mẫu phải phân cực Về nguyên tắc dung môi không tương tác với pha tĩnh sắc ký lỏng, chính chúng phải khác bản chất Dung môi là chất phân cực pha tĩnh phải là không phân cực Suy phương pháp sắc ký sử dụng bài là phương pháp pha đảo với pha tĩnh không phân cực (thường dùng cột C18) 2.3 Thứ tự các chất (3 thành phần chính curcuminoid) lần lượt xuất kết phân tích ? Thứ tự các chất (3 thành phần chính curcuminoid) lần lượt xuất hiện kết quả phân tích: (1) 7|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) (2) Demethoxy curcumin (DMC) (3) Curcumin I Giải thích : Vì phương pháp sắc kí sử dụng là sắc kí pha đảo, pha tĩnh không phân cực nên tương tác với các cấu tử ít phân cực Trong đó BDMC là cấu tử phân cực nhất, ít tương tác với pha tĩnh nên trước, là DMC và cuối là Curcumin I ít phân cực (vì phân tử có nhóm –OCH tạo hiệu ứng +C vào vòng làm cho nhóm –OH ít phân cực) 2.4 Cách thức pha mẫu chuẩn bị mẫu ? Chuẩn bị mẫu thực nghiệm : Cân m(g) mẫu thử Chuyển phần mẫu thử vào bình định mức 10ml.Định mức acetonitrile, lắc đều Đánh siêu âm khoảng phút Pha lơngx mẫu 20 lần Lọc qua giấy lọc 0.45 m Dung dịch sau lọc tiêm vào máy 2.5 Số đĩa lý thuyết đối với peak, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn N chiều cao đĩa lý thuyết cột Theo tài liệu tham khảo [1] có phổ UV-VIS 8|Page Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại 9|Page Nhóm , Chiều thứ Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Ta thấy cả ba chất cần phân tích đều có bước sóng hấp thu cực đại từ 420-430nm Vậy nên cài đặt bước sóng cho đầu dọc UV-VIS máy HPLC là từ 420-430nm Chọn phổ để tính toán cho các câu sau 10 | P a g e Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại - Nhóm , Chiều thứ Các giá trị thời gian lưu và chiều rộng chân peak xem sắc ký đồ tại bước sóng hấp thu cực đại nên chọn bước sóng 422,4: N = 16 × ( BDMC DMC Curcumin I - tR1= tR2= tR3= W= W= W= 0,1842 0,1285 0,1368 Trung bình N1= N2= N3= N= Số đĩa lý thuyết trung bình : N tb = - 4,305 4,769 5,307 tR ) W 8739.5 + 22037.807 + 24079.417 = 18285.578 (đĩa) Độ lệch chuẩn: (8739 − 18285) + (22037 − 18285) + (24079 − 18285) σ= = 6801 - Chiều cao đĩa lý thuyết cột: 11 | P a g e 8739,5092 22037,807 24079,417 18285,578 Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại L 150 H= = = 0,008203186 N tb 18285 Nhóm , Chiều thứ (mm) 2.6.Hệ số chứa hệ số phân bố cấu tử Hệ số chứa k'X k'X = t R − tM tM Hệ số phân bố KX KX = k ' X VM VS BDMC DMC Curcumin I k'1= k'2= k'3= 1,87 2,18 2,54 K1= K2= K3= 3,98 4,64 5,4 2.7.Độ phân giải Rs độ chọn lọc α đối với hai cấu tử DMC (demethoxy curcumin) curcumin I Giữa hai cấu tử DMC và curcumin I Độ phân giải RS Rs = tR3 − tR = 4.06 W3 / − W2 / Độ chọn lọc α α= K3 = 1.16 K2 2.8.Dựa phương trình đường chuẩn, tính toán giá trị nồng độ curcumin I phương trình đường chuẩn curcumin I, thay y=8534,22363 mAU.x Nồng độ curcumin I x (mg/ml) x=0.1806 mg/ml 2.9.Nhận xét + Đánh giá kết quả tính toán - Kết quả tính toán cho thấy phương pháp sử dụng: • Tốc độ nhanh: thời gian lưu ngắn 12 | P a g e Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại Nhóm , Chiều thứ Độ tách tốt: các peak đẹp, không bị chồng lên Độ nhạy cao Kết quả tính toán đáng tin cậy: nồng độ Curcumin và diện tích peak gần là • • - đường thẳng + Cơ sở việc lựa chọn phương pháp Hỗn hợp cần phân tích là hỗn hợp lỏng Các cấu tử là hợp chất hữu và đều phân cực (có nhóm –OH) KẾT LUẬN Thí nghiệm với mục tiêu phân tách mẫu có chứa chất Curcumin I, Demethoxy curcumin (DMC) và Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) thu các kết quả sau: + Nồng độ Curcumin I là 0,186mg/ml + Độ phân giải và độ chọn lọc cấu tử DMC và Curcumin I: Rs = 4.06; α=1,16 Thí nghiệm thực hiện phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao cho hiệu quả cao nhờ sử dụng chất nhồi có kích thước nhỏ, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao Thí nghiệm này giúp hiểu rõ nguyên lí hoạt động máy HPLC cũng phương pháp sắc kí nói chung, phương pháp sắc kí lỏng nói riêng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng – Sinh viên Nguyễn Thị Mạc Hương , năm 2008 [2] Phân tích định lượng – Nguyễn Thị Thu Vân – năm 2012 13 | P a g e ... curcumin (DMC) Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) 2.2 Phương pháp sắc ký sử dụng phương pháp pha thuận hay pha đảo ? Vì ? + Phương pháp sắc ký sử dụng là phương pháp pha đảo + Hỗn hợp curcuminoid... tương tác với pha tĩnh sắc ký lỏng, chính chúng phải khác bản chất Dung môi là chất phân cực pha tĩnh phải là không phân cực Suy phương pháp sắc ký sử dụng bài là phương pháp pha đảo... α=1,16 Thí nghiệm thực hiện phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao cho hiệu quả cao nhờ sử dụng chất nhồi có kích thước nhỏ, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao Thí nghiệm này giúp hiểu