Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơn trên cây lúa (Oryza sative L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - CHÂU TẤN PHÁT ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Cần Thơ - 2012 ii Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng thị phân tử PCR dòng BAC để xác định gen mùi thơm lúa (Oryza sativa L.)” riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Châu Tấn Phát iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành biết ơn Thầy, Cô hướng dẫn khoa học: - GS.TS Nguyễn Thị Lang, hết lòng dẫn nội dung cần thiết thực môn học, thí nghiệm nội dung nghiên cứu để hoàn thành luận án - GS.TS Bùi Chí Bửu, tận tình bảo hướng dẫn nội dung, phương pháp kế hoạch triển khai thành công môn học, thực thí nghiệm - Các thầy cô tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa sở đào tạo Viện Lúa đồng sông Cửu Long Không thể hoàn thành luận án giúp đở hướng dẫn khoa học động viên Cô Thầy Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: dành nhiều thời gian để đọc đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn: - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam - Ban giám đốc Viện Lúa đồng sông Cửu Long, giúp đỡ tạo điều kiện cho học tập thực đề tài - Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ - Ban giám hiệu tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ nhiều suốt thời gian theo học chương trình cao học - Phòng Khoa học Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng sông Cửu Long, theo dõi, động viên suốt trình học tập thực đề tài tốt nghiệp - Bộ môn Di Truyền Chọn Giống – Viện Lúa đồng sông Cửu Long, giúp đỡ trang thiết bị hướng dẫn chuyên môn suốt trình thực đề tài tốt nghiệp iv - Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng sông Cửu Long, động viên tạo điều kiện thời gian giúp hoàn thành luận án thời gian qui định - TS Bùi Thị Thanh Tâm, TS Phạm Trung Nghĩa đóng góp nhiều ý kiến quí báu để hoàn thiện cho môn học chuyên đề luận án - Sau cùng, xin cảm thông hy sinh, chia động viên cha mẹ, em gái, vợ người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần không nhỏ vào thành công luận án Tác giả luận án Châu Tấn Phát MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Cây lúa (Oryza sativa L.) loại lương thực nuôi sống 50 % dân số giới [62] Trước đây, với điều kiện vật chất thiếu thốn, lương thực không đủ ăn người ta có nhu cầu ăn no Nhưng ngày mức sống người dân ngày nâng cao nhu cầu ăn no thay đổi, việc ăn ngon, có dinh dưỡng cao trở thành nhu cầu quan trọng thiếu người Mặt khác, ngày nước ta qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển sang thời kỳ sản xuất phải có lời xuất mô hình sản xuất vừa có lời, vừa bền vững môi trường sinh thái lành Một mô hình làm lúa thơm đặc sản, chất lượng gạo xem mục tiêu hàng đầu, mùi thơm đánh giá cao thị trường xuất gạo giới Sản lượng gạo thơm từ giống lúa thơm cổ truyền như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk Mali, Basmati, có không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường khó mở rộng diện tích Do nhà chọn giống liên tục nghiên cứu lai tạo giống lúa có chất lượng cao giữ mùi thơm đặc trưng giống Trong năm gần đây, với tiến ngành công nghệ sinh học ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử tái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi trình tự gen Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC Bacterial Artificial Chromosome) công cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ để xây dựng thư viện gen cho lúa, thành lập đồ vật lý có chất lượng cao dùng để hợp đồ vật lý với đồ di truyền Bên cạnh đó, việc sử dụng thị phân tử PCR dòng BAC để xác định gen mùi thơm lúa ứng dụng từ thư viện BAC Xuất phát từ cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng thị phân tử PCR dòng BAC để xác định gen mùi thơm lúa (Oryza sativa L.)” thực 2.Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr” dòng giống làm bố mẹ quần thể lai nhằm xác định dòng lai có chứa gen mùi thơm - Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm thị liên kết với tính trạng mùi thơm lúa Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” lúa giúp cho việc chọn dòng lai hiệu - Xác định dòng BAC DNA để tạo thị liên kết với gen qui định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu rõ kỹ thuật dòng hóa gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu chức gen 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài góp phần bổ sung dòng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm thông qua ứng dụng dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr” phục vụ cho việc phát triển giống lúa thơm cao sản ĐBSCL - Với kết đạt từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài tìm phân tích thị từ chuyển sang thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ cho chọn giống lúa Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đối tượng giống lúa mùa giống lúa cao sản trì nhân giống - Khai thác thư viện BAC DNA để xác định dòng BAC chứa gen mùi thơm - Phạm vi nghiên cứu: + Chỉ xác định nội dung có liên quan đến thị phân tử liên kết với gen “fgr” nhiễm sắc thể số ứng dụng kết để chọn giống lúa cao sản có gen mục tiêu + Phân lập đoạn phân tử mang gen mục tiêu + Chưa phân tích phổ chức (gene profile) + Chưa nghiên cứu điều kiện để gen thể (gene expression) qui mô khác CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Cơ sở khoa học đề tài 1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm lúa 1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm thể chúng phận lúa Mùi thơm hạt gạo xác định nhóm formaldehyde, ammonia hydrogen sulfide tạo nên Một vài nghiên cứu ghi nhận mùi thơm tăng propanol, pentanol hexanol trình tồn trữ Ngày phương pháp đại xác định mùi thơm tạo thành hàng trăm lọai hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine hợp chất khác ghi nhận cơm [3], [70] Tác giả Kim [64] báo cáo hợp phần hydrocacbon không khác có ý nghĩa lúa thơm không thơm, nhiên lúa thơm có mức độ cao alcohol, aldehyde, keton, acid; lúa thơm có nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline cao gấp 15 lần so với lúa không thơm Lorieux ctv [76] phân tích mẫu gạo giống lúa Azucena (thơm) IR64 (không thơm), kết không tìm thấy chất 2-acetyl-1-pyrroline IR64 (không thơm), giống lúa thơm Azucena có hàm lượng cao chất Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy chất sau có khác biệt giống lúa thơm không thơm là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline, benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 hexanol Tác giả Buttery ctv [39] đề nghị khác lúa thơm không thơm không diện hay vắng mặt chất 2-acetyl-1-pyrroline mà khác số lượng hoạt chất có lúa gạo Nhiều alen gen thơm tạo biến đổi nhỏ enzyme kết dẫn đến tính thơm khác Tác giả Buttery ctv [40] phân tích xác định 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) thành phần quan trọng đóng góp vào mùi thơm giống lúa thơm Theo đánh giá chất lượng mùi thơm 2-acetyl-1-pyrroline mô tả giống mùi ngô nổ Xác định nồng độ mùi thơm 10 giống lúa, khoảng nồng độ từ ppb đến 90ppb với lúa chà trắng Lúa chưa chà trắng nồng độ 2-acetyl1-pyrroline 100-200ppb Vì nghĩ bề mặt lớp aloron hạt gạo giữ vai trò quan trọng việc hình thành mùi thơm cơm nấu Mũi người phát hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline nồng độ 0,007ppm Do đó, đánh giá cảm quan điều kiện định với người có khứu giác bình thường kết tin tưởng được.[47] Các tác giả Ahmed ctv [31], Lin ctv [74] khẳng định lại báo cáo Buttery ctv [40], Paule ctv [84] 2-acetyl-1-pyrroline hợp chất tạo nên mùi đặc trưng cho giống lúa thơm Bên cạnh đó, Buttery ctv [38] phân tích lá dứa (Pandabases amaryllifolius) nhận thấy thành phần bay 2-acetyl-1pyrroline (2AP) có liên hệ mật thiết chất 2-acetyl-1-pyrroline lá dứa lúa thơm Nồng độ chất 2-acetyl-1-pyrroline lá dứa cao gấp 10 lần lúa thơm cao gấp 100 lần lúa không thơm Tóm lại, có hai quan điểm thành phần chất thơm lúa gạo Quan điểm thứ cho chất thơm tạo từ hợp chất aldehyde (CHO) keton (C=O) hợp chất với lưu hùynh Quan điểm thứ hai cho chất thơm lúa gạo, vòng ryrrol kiểm sóat tính thơm chất 2-acetyl-1-pyrroline [34] Tác giả Kader Delseny [59] cho có khác việc thể mùi thơm phận lúa, hợp chất 2AP thể cách tự nhiên từ giai đoạn mạ chín đặc biệt giai đoạn hạt trưởng thành phận lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm tích lũy nhiều phận hạt lúa Bên cạnh đó, tác giả Chen ctv [42], Vanavichit ctv [102] khẳng định mùi thơm thể thấp không đáng kể phận rễ lúa 1.1.1.2 Gen thơm Li Gu [71] nghiên cứu di truyền vị trí gen thơm lúa Sự lai thuận nghịch giống lúa thơm cho thấy gen chúng có alen với Tác giả Bradbury ctv [78] phân tích mùi thơm lúa Basmati Jasmine với thể 2-acetyl-1-pyrroline Một gen lặn fgr NST số lúa qui định thể tính trạng quan trọng có gen tương ứng mã hóa protein có tên gọi Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) thể đa hình có ý nghĩa vùng chứa gen thơm Gen fgr có tương đồng với gen mã hóa BAD2 lúa xem gen fgr dạng đột biến gen mã hóa BAD2 Ngược lại, gen mã hóa BAD1 định vị nhiễm sắc thể số Gen mã hóa BAD liên kết với gen kháng stress trồng Tác giả Shi ctv [107] kết luận gen fgr gen lặn nằm NST số liên quan đến mùi thơm lúa Gen có alen lặn chức bad2 alen trội BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không thơm Tổng số 34 giống lúa thơm không thơm nghiên cứu giải trình tự đoạn phân tử BAD2/bad2 Trong số 24 giống lúa thơm có 12 giống chứa alen bad2 (bad2-E7), với kiện cặp bazơ SNPs exon số 7, số lại có alen bad2 (bad2-E2) - chuỗi trình tự tương đồng với bad2-E7 cặp bazơ exon số Cả hai alen qui định mùi thơm lúa Dựa chuỗi trình tự khác BAD2 alen lặn bad2 phát triển thị phân tử giúp cho việc xác định dòng lúa thơm, phân biệt rõ dòng không thơm thơm xét kiểu gen Tuy nhiên, kiểu hình biểu thị bên vô phức tạp điều điều kiện môi trường qui định ức chế kích hoạt promoter để gen thể mùi thơm data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... ứng dụng từ thư viện BAC Xuất phát từ cấp thiết trên, đề tài: Ứng dụng thị phân tử PCR dòng BAC để xác định gen mùi thơm lúa (Oryza sativa L.) thực 2 2.Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng thị phân. .. viện BAC DNA để xác định dòng BAC chứa gen mùi thơm - Phạm vi nghiên cứu: + Chỉ xác định nội dung có liên quan đến thị phân tử liên kết với gen “fgr” nhiễm sắc thể số ứng dụng kết để chọn giống lúa. .. mẽ để xây dựng thư viện gen cho lúa, thành lập đồ vật lý có chất lượng cao dùng để hợp đồ vật lý với đồ di truyền Bên cạnh đó, việc sử dụng thị phân tử PCR dòng BAC để xác định gen mùi thơm lúa