ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO

Natto và Nattokinase Natto còn được gọi là pho mai thực vật là những hạt đậu nành đã luộc chín được ủ với men ở một môi trường 40oC trong vòng 1418 giờ để lên men thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao, có mùi nồng nặc rất khó chịu với người không quen. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ nhớt càng cao thì chất lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt. Là một món ăn dân dã rất phổ biến ở nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương với rong biển phơi khô (Nori) và trứng gà sống. Natto có chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạchmột phát hiện vô cùng lý thú bởi nhà nghiên cứu sinh lý học Nhật bản nổi tiếng, giáo sư Sumi Hiroyuki vào năm 1980. Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP. Nattokinase là một enzym có hoạt động fibrinolytic rất mạnh mẽ, được chiết xuất và tinh chế từ natto.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO GVHD: SVTH: TP.HCM, THÁNG NĂM 2017 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO GVHD: SVTH: TP.HCM, THÁNG NĂM 2017 MỤC LỤC ĐẶT VẮN ĐỀ Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu tim hay nhồi máu não) tăng cao số nước châu Á Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Philippin xu hướng “âu hóa” chế độ ăn uống Nếu huyết tụ não làm cản trở việc cung cấp oxy cho mô não gây bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ Nếu huyết khối tim gây bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu tim… Theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch dự báo bệnh nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào năm tới Huyết khối xơ vữa thật trở thành mối đe dọa sức khỏe người Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto phổ biến thu hút nhiều ý Nó xem loại thức ăn giúp giảm thiểu nghẽn mạch máu Natto chứa enzyme phân hủy huyết khối “Nattokinase”, nhân tố mang đến trường thọ cho người Nhật Nattokinase serine protease gồm 275 axit amin, hoạt động pH tối ưu o từ 8-10, nhiệt độ tối ưu từ 30 - 70 C, có trọng lượng phân tử từ 27,7 - 44kDa, điểm đẳng điện (pI) = cấu trúc tương đồng với subtilisin Cơ chế hoạt động nattokianse trực tiếp phân cắt fibrin huyết khối gián tiếp cách hoạt hóa sản xuất urokinase plasmin mô Sự tuần hoàn máu người bị tác động số enzyme đặc biệt Nattokinase hỗ trợ cho máu lưu thông tốt giúp cho huyết áp mức bình thường.4 Nattokinase tổng hợp từ vi sinh vật (nhân sơ nhân thật) Bacillus subtilis, Fusarium Rhizomucor sp enzyme tương tự tổng hợp từ tuyến tụy người (Trypsin chymotrypsin) Vi sinh vật dùng để sản xuất Nattokinase Bacillus subtilis (Vi khuẩn) Rhizomucor sp (Nấm mốc) Các đề tài nghiên cứu phân lập, tối ưu hóa áp dụng dòng vi khuẩn có khả sinh nattokinase thực nhiều giới Ở Việt Nam nghiên cứu vấn đề Với lý trên, đề tài “ Phân lập khảo sát vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ thực phẩm natto” thực để bước đầu giải vấn đề PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1.Enzyme Nattokinase 1.1.1.Đậu tương Đậu nành có tên đậu tương Nguồn gốc từ Trung Quốc, sau lan sang Việt Nam, Nhật Bản, Triều Tiên Châu Âu biết đến đậu nành từ kỷ 18 Từ cổ xưa, đậu nành dùng làm thực phẩm, gần y học giới phát nhiều tác dụng chữa bệnh Đây kết luận chuyên gia Mỹ đưa hội nghị khai thác giá trị dinh dưỡng từ đậu nành sức khỏe người Viện Dinh dưỡng thuộc Đại học Columbia (Mỹ) - Ngừa ung thư vú phụ nữ Một khảo sát nhà khoa học thuộc Đại học Georgetown (Mỹ) cho thấy bổ sung đậu nành mức độ vừa phải giúp giảm nguy bị ung thư vú Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ, dùng phần đậu nành ngày đem lại nhiều ích lợi cho phụ nữ có nguy có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư vú -Tác dụng tim mạch Theo khảo sát, bổ sung 20-133g protein từ đậu nành ngày giúp giảm 7-10% hàm lượng cholesterol xấu LDL thể “Dùng đậu nành phần chế độ dinh dưỡng giúp giảm nguy mắc bệnh tim”, Wahida Karmally – Giám đốc dinh dưỡng Viện Nghiên cứu Irving nói Còn theo Cơ quan Quản lý dược phẩm thực phẩm Mỹ (FDA), thêm 25g protein từ đậu nành ngày có tác dụng giảm lượng chất béo bão hòa, qua giảm nguy mắc bệnh tim mạch Các nhà khoa học thuộc Hội mãn kinh Bắc Mỹ kết luận: Đậu nành chất chiết từ đậu nành có tác dụng giảm huyết5 áp tâm trương, giảm cholesterol toàn phần, giảm cholesterol xấu (tức LDL-cholesterol), ngăn chặn tiến triển mảng xơ vữa, cải thiện tính đàn hồi động mạch Do đó, Mỹ, quan quản lý thực phẩm thuốc (FDA) từ năm 1999 cho phép dùng đậu nành để làm giảm nguy động mạch vành - Cung cấp đủ dưỡng chất Các chuyên gia dinh dưỡng Mỹ khẳng định chế phẩm từ đậu nành giàu dinh dưỡng ăn phần đậu nành ngày giúp bổ sung đầy đủ dưỡng chất “Đậu nành cung cấp nhiều chất quan trọng kali, ma-giê, chất xơ, chất chống ô-xy hóa”, hãng tin New Kerala dẫn lời chuyên gia Katherine Tucker cho biết - Điều trị chứng mãn kinh Gần đây, người ta phát thấy hạt đậu nành có isoflarm gọi estrogen thực vật (phytoestrogen); hoạt chất góp phần làm cân hormon phụ nữ mãn kinh, cải thiện rõ rệt triệu chứng khác tuổi mãn kinh như: Bốc hỏa, đổ mồ hôi đêm, trầm cảm, khô âm đạo… - Tác dụng chuyển hoá xương Thống kê dịch tễ học cho thấy: Tỷ lệ gãy xương phụ nữ châu Á thấp rõ rệt so với phụ nữ nước phương Tây Kết có liên quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành.(Isoflarm đậu nành) làm tăng mật độ khoáng đốt sống 1,2 đến 1,4 lần (so sánh với phụ nữ dùng thức ăn có đậu nành) Ở chuột thực nghiệm, làm giảm nguy loãng xương ức chế hoạt tính hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương - Tác dụng khối u phụ thuộc hormon Thống kê dịch tễ học cho thấy số loại khối u phụ thuộc vào hormon (ở màng tử cung, vú, buồng trứng…) có tỷ lệ thấp phụ nữ châu Á Nhận xét có liên quan tới chế độ ăn giàu đậu nành công dân châu Á Kết nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng cho thấy (isoflarm đậu nành) có tác dụng làm giảm nguy ung thư tử cung, vú buồng trứng - Ung thư Genistein đậu nành làm giảm nguy ung thư cách giảm tổn thương tế bào, chất ức chế Protease BowmanBirk có Protein đậu nành ức chế khởi phát ung thư Chất Daidzein Protein đậu nành, sử dụng với liều cao có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch, để phá hủy chất có hại cho thể, có tác động lên việc giảm nguy bị ung thư - Xương khớp Qua nghiên cứu, người ta thấy phụ nữ6 dùng nhiều đạm động vật gây Calcium qua nước tiểu, có nguy gãy xương nhiều phụ nữ dùng Protein thực vật Nghiên cứu cho thấy dùng Protein đậu nành, đặc biệt Isoflavones có tác động tốt lên đậm độ khoáng xương phụ nữ mãn kinh mà không dùng Ostrogen thay - Đậu nành dùng dinh dưỡng công nghiệp Trong dinh dưỡng bột đậu nành trộn với bột ngũ cốc, dùng làm thức ăn cho trẻ sơ sinh, người bị bệnh đái tháo đường, bệnh gút… Trong công nghiệp dược, bột đậu nành dùng môi trường nuôi cấy kháng sinh Những sản phẩm từ đậu nành Tàu hủ, tương, chao, sữa, natto… thực phẩm giàu protein (đạm) cung cấp nhiều loại acid amin cần thiết cho thể Những acid amin đậu nành kết hợp tốt với loại acid amin ngũ cốc khác Đậu nành nguồn Lecithin Vitamin E hoạt chất chống oxy- hóa thiên nhiên ngăn chận tác hại Cholesterol nồng độ thấp (LDL) mặt khác đậu nành lại giàu Magnesium giữ vai trò quan trọng cho xương, tim mạch chống xơ vữa động mạch Hơn đậu nành có tác dụng tốt cho Thận thực chức (phế thải chất bã chuyển hóa đạm, phế thải nước, khoáng chất dư thừa thể, độc tố thực phẩm…) Đạm thực vật có đậu nành thay đạm động vật (từ thịt) làm cho Thận làm việc hơn, lượng protein nước tiểu giảm, ngăn ngừa nguy sạn thận Tại hội nghị quốc tế dinh dưỡng tổ chức New Zealand, GS Masafumi Kitakaze khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt chứng Mỡ (Triglyceride Cholesterols) máu cao qua nghiên cứu chung quan y tế Nhật Bản, kêu gọi cộng đồng giới cải thiện nếp sinh hoạt (Lifestyle) tiêu thụ Natto thiên nhiên trước nguy béo phì “thừa” dinh dưỡng chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày tăng khắp nơi giới 1.1.2 Natto Nattokinase Natto gọi mai thực vật hạt đậu nành luộc chín o ủ với men môi trường 40 C vòng 14-18 để lên men thành hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao, có mùi nồng nặc khó chịu với người không quen Theo kinh nghiệm nhà sản xuất cho biết độ nhớt cao chất lượng Natto tốt vị Là ăn dân dã phổ biến nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương với rong biển phơi khô (Nori) trứng gà sống Natto có chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe enzym Nattokinase hoạt chất sản sinh trình lên men Natto xem hoạt chất có hiệu việc ngăn ngừa chứng bệnh tim mạch-một phát vô lý thú nhà nghiên cứu sinh lý học Nhật tiếng, giáo sư Sumi Hiroyuki vào năm 1980 Nattokinase gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP Nattokinase enzym có hoạt động fibrinolytic mạnh mẽ, chiết xuất tinh chế từ natto Hình 1: Natto enzyme Nattokinase 1.1.2.1 Nguồn gốc Natto Nattokinase Natto ăn truyền thống từ hàng ngàn năm Nhật Bản Nó biết đến bí giúp người Nhật sống lâu, khỏe mạnh, kéo dài tuổi thọ Người ta cho natto hữu hiệu việc phòng chống bệnh cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp…), làm xương, tiêu diệt vi trùng gây bệnh giúp cho phụ nữ mang thai sinh khỏe khoắn Trong suốt thời kì chiến tranh Nhật-Nga (1904-1905), quân đội Nhật Bản phải ăn ngày bữa natto với cơm nhờ binh lính gìn giữ sức khỏe không bị đau bụng, tiêu chảy hay táo bón đường hành quân Natto trở thành đề tài nóng hổi TS Sumi Hiroyuki đưa kết bất ngờ hiệu natto việc làm tan huyết khối động mạch, nguyên nhân suy tim tử vong bệnh nhân bị chứng xơ vữa động mạch vành hay đột quị nghẽn hay xuất huyết não vào năm 1980 Trong bữa cơm trưa nhà ăn đại học Y khoa Chicago, Sumi lấy mẫu natto đặt vào khay thủy tinh có cục máu đông 18 sau cục máu đông tan rã hoàn toàn, điều gợi ý natto có hay nhiều hoạt chất phân hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin có khả làm đông máu (tụ máu) để ngăn chứng xuất huyết nội Sumi bắt8 đầu lưu ý tới vai trò “Nattokinase” Vitamin K2 có natto để chứng minh hoạt chất giúp cho người Nhật Bản sống lâu, làm tăng khả tạo plasmin nội sinh giúp cho thể tránh tai biến hay đột quị huyết khối hay chứng xơ vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên Theo kết nghiên cứu quan y tế đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR Pharmaceuticals (N) Trường Y khoa Miyazaki phối hợp thử nghiệm thể người cách cho ăn natto 200 g/ngày kiểm chứng hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát lượng plasmin nội sinh giảm sụt người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối, vón cục động mạch hiệu rõ rệt Năm 1987, Sumi Hiroyuki công bố toàn kết nghiên cứu tác dụng Nattokinase sau thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác để so sánh, xác định Nattokinase loại enzyme mang khả phân hủy huyết khối cách hữu hiệu mạnh loại enzym, gấp lần plasmin,enzym nội sinh làm tan máu đông, đồng thời tuyệt đối an toàn cho thể hấp thụ qua đường ăn uống 1.1.2.2 Cơ chế tác động Nattokinase Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua đường khác : - Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu giải tỏa khu vực mà dòng máu lưu thông bị cản trở - Bằng cách kích thích thể tăng cường sản xuất plasmin từ Urokinase, Nattokinase giúp làm tan huyết khối hình thành mà hoạt động thành phần chống hình thành huyết khối - Nattokinase giúp tăng cường t-PA để sản sinh plasmin Đây enzyme nội sinh tiêu hủy fibrin tự nhiên thể Đặc biệt Nattokinase không ảnh hưởng đến trình hình thành fibrin từ fibrinogen, không làm suy giảm chế đông máu bình thường thể Vì vậy, Nattokinase không gây biến chứng chảy máu thuốc chống đông máu bình thường Nattokinase, hoạt chất chiết xuất từ Natto,là enzyme tìm thấy tự nhiên có trọng lượng phân tử 20,000 ± 5000 Nó bền với nhiệt đến 60ºC với pH 6–12 Mặc dù thể người có vài loại enzyme tạo cục máu đông có enzyme “plasmin” để phá hủy hòa tan Đặc tính Nattokinase gần giống với plasmin Nattokinase chiết xuất từ Natto, enzyme thủy phân hiệu mảng bám huyết9 khối sợi fibrin kết hợp lại với Nattokinase có cấu trúc protein, tạo chuỗi đơn polypeptide có 275 phân tử, có Ala N-cuối Nó thủy phân sợi huyết mạnh mẽ Nattokinase enzyme thủy phân fibrin mạnh gần 200 loại thực phẩm bổ xung qua đường ăn uống nghiên cứu Nattokinase hoạt động mạnh gấp lần plasmin nội sinh, loại enzyme làm tan fibrin thể Do sức khỏe tuổi tác, thể giảm sản sinh plasmin làm tăng nguy hình thành cục máu đông Nattokinase giúp tăng cường plasmin thể thành phần chống đông máu khác urokinase tăng cường lưu thông máu, ngăn chặn xơ vữa mạch Không giống aspirin hầu hết thuốc chống đông máu khác ức chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu giải tỏa nơi máu bị cản trở lưu thông Bằng cách kích thích thể tăng cường sản xuất plasmin, Nattokinase giúp làm tan cục máu đông hình thành mà hoạt động thành phần chống hình thành cục máu đông Các tác dụng Nattokinase: - Làm tan cục máu đông: Nattokinase làm tan cục máu đông cách làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc tiểu cầu vón kết lại với hình thành cục máu đông) Nattokinase hoạt động mạnh gấp lần plasmin nội sinh (loại enzyme thể làm nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với chế tương tự plasmin Do sức khỏe tuổi tác, thể giảm sản sinh plasmin làm tăng nguy hình thành cục máu đông Nattokinase giúp tăng cường plasmin thể thành phần chống đông máu khác urokinase - Huyết áp: Nattokinase làm giảm huyết áp Người Nhật ăn loại đậu lên men 1000 năm mục đích Các nghiên cứu làm giảm huyết áp cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE) ACE khiến mạch máu bị hẹp lại huyết áp tăng cao Nattokinase có khả ức chế ACE, ngăn cản dầy nội mạc mạch - Tăng cường lưu thông máu: Nattokinase trợ giúp máu lưu thông cách hỗ trợ bù trừ tuần hoàn Nó chứng minh có tác dụng ngăn chặn xơ vữa mạch - Các lợi ích khác: làm xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn, bệnh lị Cục máu đông làm tắc mạch máu nguyên nhân dẫn đến sa sút trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu tim, đau thắt ngực trĩ Lợi ích tuyệt vời từ Nattokinase hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho người bệnh * Các nghiên cứu: - Hoạt động tiêu huyết khối Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá Nattokinase vào năm 1980 tiến hành nghiên cứu Đại học Chicago Tiến sĩ thử nghiệm với gần 200 loại thực phẩm phát tiềm đậu natto cho vào cục máu nhân tạo giữ nhiệt độ thể Ông nhận thấy huyết khối bị tan dần hoàn toàn biến sau 18 tiếng TS Sumi thử nghiệm lâm sàng với người động vật Trong nghiên cứu đầu tiên, 12 tình nguyện viên cho sử dụng 200g Natto hàng ngày Các hoạt động Fibrinolytic máu họ đo theo cách Lấy mẫu máu kích thích tạo cục máu đông mẫu sau đo thời gian cục máu đông tan hoàn toàn Nhóm sử dụng Nattokinase nửa thời gian so với nhóm đối chứng Bài kiểm tra thứ hai dùng máu cho vào đĩa với loại polyme fibrinogen đặc biệt Mức độ tan đo tiếng lần Nhóm đối chứng cho thấy không tan nhóm Nattokinase có tốc độ tan 14mm/h Một thử nghiệm thứ ba sau thực để đo mô hoạt hóa plasminogen (t-PA) máu Nhóm dùng Nattokinase cho thấy có tăng tPA tPA làm tăng plasmin, nghiện khả trực tiếp tiêu sợi Fibrin, tăng cường hoạt động chống hình thành cục máu đông thể TS Sumi tiến hành thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chó Một cục máu đông tạo tĩnh mạch chân chó gây tắc nghẽn hoàn toàn Sau 5h nhóm cho ăn đậu Natto tĩnh mạch hoàn toàn lưu thông Trong nhóm dùng giả dược cục máu đông gây tắc nghẽn 18 sau Năm 1995, nhà nghiên cứu phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh học JCR Pharmaceuticalscủa Kobe, Nhật Bản thử nghiệm hiệu Nattokinase việc giảm huyết khối động mạch cảnh chuột Một số chuột tiêm huyết khối động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho não Ba enzym Nattokinase, plasmin elastase dùng để thử nghiệm chuột Elastase cho thấy không mở lại động mạch bị chặn Nhóm ăn Plasmin cho thấy lưu thông phục hồi 16% sau Còn nhóm ăn Nattokinase cho thấy phục hồi 62% lưu thông khoảng thời gian Kết giúp nhà nghiên cứu kết luận "các kết cho thấy khả tiêu fibrin Nattokinase mạnh so với plasmin elastase thể” Các nhà nghiên cứu từ JCR Pharmaceuticals, Oklahoma State University Miyazaki Medical College tiến hành nghiên cứu sâu có 10 12 tình nguyện viên cho uống 200 mg Nattokinase sau theo dõi khả tiêu Fibrin họ thông qua loạt xét nghiệm huyết tương Các đối tượng tham gia thí nghiệm cho thấy khả phân hủy cục1 máu đông cao 28 Năm 2003, Cesarin cộng làm thí nghiệm với Nattokinase giả dược trao cho 184 tình nguyện viên trước lên chuyến bay 7-8 số 92 người nhóm dùng giả dược cho thấy cục máu đông hình thành Không số 92 người nhóm Nattokinase hình thành cục máu đông - Hoạt động huyết áp Năm 1995, nhà nghiên cứu từ Trường y khoa Miyazaki Kurashiki Đại học Khoa học Nghệ thuật Nhật Bản nghiên cứu tác dụng Nattokinase với huyết áp động vật người Trong thử nghiệm chuột cho uống liều 400-450 gam Nattokinase Tính trung bình huyết áp tâm thu (SBP) chuột giảm 12,7% hai Nhóm người tình nguyện tham gia có huyết áp cao uống 30 gam lyophilized trích xuất (tương đương 100 g natto) Trung bình huyết áp tâm thu SBP giảm 10,9% huyết áp tâm trương (DBP) giảm 9,7% 1.1.2.3 Cấu trúc Nattokinase Kí hiệu: EC = 3.4.21.62 Trong đó: + (loại): Hydroxylase + (nhóm): Protease + 21(dưới nhóm): protease serin + 62(enzyme): subtilisin Nattokinase có cấu trúc protein tạo thành từ chuỗi polypeptid bao gồm 275 gốc acid amin, có trọng lượng phân tử MW= 27728 Da, pI= 8,6+0,3, có tính chất tương đồng cao với chất cầu disulfide Nattokinase thuộc họ subtilisin protease serin, có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl Ser-221, imidazol His-64 nhóm carboxyl Asp-32 1.1.2.4 Tính an toàn Nattokinase Những thành TS Sumi Hiroyuki hai vị chuyên gia hai khu vực khác phối hợp nghiên cứu, bác sĩ Martin Milner Trung tâm Y khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa Kỳ) TS Kouhei Makise thuộc bệnh viện Makise Kyoto, công bố kết qua viết tạp chí chuyên môn kết luận “là chuyên gia lâu năm tim mạch hô hấp trí khẳng định Nattokinase phát đầy phấn chấn việc 11 ngăn ngừa điều trị chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, “chúng xác định Nattokinase hoạt chất thiên nhiên làm tan huyết khối hữu hiệu, không gây dị ứng có độ an toàn cao” hơn1 tỏi , nhân sâm Triều Tiên hay bromelain (từ Dứa) thiên nhiên thúc đẩy sản sinh plasmin trình thủy phân sợi fibrin 1.1.2.5 Các nguồn vi sinh vật tổng hợp Nattokinase Vi sinh vật nguồn sản xuất quan trọng để tạo hợp chất có khả phân hủy máu đông Streptokinase từ Streptococus hemolyticus Satphylokinase từ Streptococus aureus sớm chứng minh có hiệu liệu pháp tan huyết khối Nhiều năm qua, có thêm nhiều enzyme từ loài vi sinh vật khác khám phá nattokinase từ Bacillus natto, Subtilisin DFE Subtilisin DJ-4 từ Bacillus myloliquefaciens.Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc tảo Streptomycesmegaspores SD5 phân lập từ suối nước nóng có khả tạo enzyme phân hủy fibrin chịu nhiệt Một số loại nấm tạo protease có hoạt tính thủy phân fibrin cao Aspergillus ochraceus 513, Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum H9,… Trong chủng thuộc chi Bacillus nguồn vi sinh vật quan trọng để sản xuất enzyme thủy phân fibrin 1.2 Giới thiệu bệnh huyết khối 1.2.1 Khái niệm huyết khối Bình thường, thể, máu lưu thông lòng mạch trạng thái thể dịch nhờ cân hệ thống hoạt hoá ức chế đông máu Khi xảy tổn thương mạch máu, yếu tố đông máu với nội mạc mạch máu tiểu cầu phối hợp xảy loạt phản ứng để tạo nút cầm máu vị trí tổn thương Tình trạng tăng đông máu xảy cân hệ thống hoạt hoá ức chế đông máu tăng hoạt hoá đông máu giảm ức chế đông máu, tiêu sợi huyết dẫn đến huyết khối lan rộng giới hạn cần thiết, gây tắc nghẽn Huyết khối định nghĩa trình bệnh lý phát động lan rộng bất hợp lý phản ứng cầm máu thể dẫn đến hình thành huyết khối lòng mạch máu Tuỳ theo kích thước huyết khối, đường kính mạch máu mà huyết khối gây tắc mạch hoàn toàn hay bán tắc, nghẽn mạch… 1.2.2 Nguyên nhân hình thành huyết khối Huyết khối tạo thành nguyên nhân: - Tổn thương mạch máu: Khi mạch máu bị tổn thương áp lực máu cao, 12 thứ có mạch máu cholesterol, tiểu cầu đến tích tụ nơi bị tổn thương khiến mạch máu trở nên cứng dày lên, lòng mạch máu hẹp lại - Xơ vữa động mạch (XVĐM): Chất béo tích tụ thành động mạch tạo thành mảng XVĐM Mảng XVĐM ngày to dần gây hẹp lòng động mạch Đôi mảng XVĐM bị vỡ làm cho máu tiếp xúc với lõi chất béo bên mảng Khi tế bào tiểu cầu hệ thống đông máu bị hoạt hóa dẫn đến hình thành huyết khối gây tắc động mạch - Giảm sản sinh, giảm hoạt tính Plasmin: Plasmin enzym thể có khả làm tan huyết khối Khi giảm sản sinh giảm hoạt tính plasmin, huyết khối dễ dàng hình thành không bị loại bỏ 1.2.3 Biến chứng bệnh huyết khối Huyết khối xuất dải protein có tên fibrin tích lũy lòng mạch Ở tim, huyết khối nguyên nhân gây tắc dòng mạch máu tới nuôi mô tim Nếu dòng máu bị chặn, oxy cung cấp cho bị giảm không Điều dẫn đến chứng đau thắt ngực đau tim Huyết khối tâm thất tim di chuyển lên não Trong não, huyết khối gây tắc nghẽn mạch máu lên não gây biến chứng: Tai biến mạch máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ Một số biến chứng thường gặp ảnh hưởng huyết khối: Bệnh động mạch vành: Bệnh ảnh hưởng đến mạch máu cung cấp máu cho tim Nếu động mạch bị nghẽn dòng máu đưa vào tim bị hạn chế, gây đau tim đột qụy, bệnh động mạch vành gây đau ngực Đột quỵ: Đột quỵ động mạch mang máu oxy đến tim bị chặn lại, oxy, phần tim không hoạt động có cảm giác đau ngực Trong giai đoạn cấp, bệnh nhân yếu đột ngột liệt hẳn nửa bên người kèm với yếu liệt nửa mặt bên Người bệnh có triệu chứng khác như: Nói khó, nuốt khó, rối loạn thị giác, thăng Nặng rối loạn tri giác, lơ mơ hôn mê, chí ngưng thở tử vong nhanh Suy tim: Tim khoẻ mạnh bơm máu đến khắp thể Một tim yếu không đủ khả làm việc bơm máu cách hiệu Khi tim không bơm đủ máu, bị suy tim Xơ vữa động mạch: Khi mạch máu bị tắc tích tụ cholesterol, 13 chất béo canxi (còn biết đến mảng bám), điều kiện dẫn đến bệnh XVĐM Những mảng bám tạo thành thành mạch máu, mạch máu trở nên mềm dẻo lưu thông mạch máu hơn, làm dòng máu khó chảy qua Đột quỵ hay đau tim xuất tích tụ mảng bám trở nên dày mạch máu bị tắc nghẽn nên dòng máu chảy qua Huyết áp cao: Huyết áp cao xuất máu đẩy mạch máu với áp suất cao Khi huyết áp lên cao, thành mạch trở nên yếu gây biến chứng đột quỵ hay đau tim Những enzyme làm tan huyết khối sinh thành tế bào lòng mạch máu có khắp thể như: Trong động mạch, hệ thống mao mạch mạch bạch huyết Ở người già việc sản sinh enzym bị suy giảm dẫn đến tình trạng hình thành huyết khối vị trí thể Những nghiên cứu gần cho thấy tắc nghẽn dòng máu lên não gây suy giảm trí nhớ người cao tuổi 1.2.4 Tình hình bệnh huyết khối giới Việt Nam Hàng năm giới có khoảng 17 triệu người tử vong nhồi máu tim triệu người tử vong đột quỵ Đây hai bệnh gây tử vong hàng đầu xuất phát từ nguyên nhân, hậu chứng huyết khối XVĐM Theo dự báo WHO huyết khối nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào năm 2020 Nhồi máu tim thường xảy đột ngột, nhanh nguy hiểm Khoảng 30% bệnh nhân chết trước kịp đến bệnh viện Trong số người nhập viện, có đến 10% chết biến chứng suy tim, choáng tim, rối loạn nhịp tim Theo thống kê người bị nhồi máu tim có người bị tái phát nhồi máu tim, đột quỵ, tử vong tim mạch sau năm Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người chẩn đoán đột quỵ Trong năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối ngày tăng cao ngày có nhiều người trẻ tuổi bị huyết khối 14 PHẦN 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm – thời gian Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Tân kỳ Tân Quý Thời gian thực hiện: Vật liệu thí nghiệm: Thực phẩm natto Nhật Bản 2.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị Bảng 2.2 Dụng cụ,thiết bị hóa chất DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ Đĩa petri Ống nghiệm Ø18 Cốc 100 ml Cốc 250 ml Cốc 1000ml Que cấy Que trang Bình tam giác 250ml Đèn cồn 10 Pipet 1ml 11 Pipet 5ml 12 Pipet 10ml 13 Micropipet 14 Quả bóp cao su 15 Bình tia 16 Ống nhỏ giọt 17 Lam kính 18 Giấy quỳ 19 Giấy lọc QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ 15 HÓA CHẤT STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH Peptone Cao thịt Cao nấm men Glucose Agar KH PO CH COONa MgSO 7H O Tryptone 10 Ethanol 96% 11 Xanh metylen 12 Lugol 13 Safranin K HPO 14 15 HCl 16 Dầu soi 17 NaCl 18 NaOH CaCO 19 20 Sucrose CaCl 21 SL/ĐVT GHI CHÚ 16 THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH Kính hiển vi Máy li tâm Bể ổn nhiệt Máy lắc Tủ cấy Nồi hấp khử trùng Cân số Micropipet Máy khuấy từ 10 Máy phá mẫu 11 Tủ sấy 12 Tủ ấm 13 Máy đo pH SL GHI CHÚ 1 1 1 1 1 1 1 2.3 Môi trường - Môi trường (CM) dùng để khảo sát ảnh hưởng yếu tố tới tổng hợp Nattokinase vi khuẩn: KH PO 0,5%; K HPO 0,1%; MgSO 4 0,01%; Casein 0,2%; Sucrose 0,1%; Cao nấm men 0,1%; CaCl 0,03%; pH 6,8-7,0 - Môi trường máu thỏ (BAM) dùng để phân lập vi khuẩn tổng hợp Nattokinase: KH PO 0,5%; K HPO 0,1%; MgSO 0,01%; Sucrose 0,1%; 4 Cao nấm men 0,1%; Máu thỏ 5%; CaCl 0,03%; Agar 2%; pH 6,8-7,0 - Môi trường LBA dùng để phân lập giữ giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 - 7,4 - Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4 2.4 Phương pháp nghiên cứu Quá trình nghiên cứu làm theo sau: • • • • Thu mẫu thực phẩm natto Nhật Bản Phân lập vi khuẩn có hoạt tính nattokinase Mô tả đặc điểm khuẩn lạc phân lập Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính sinh Nattokinase vi khuẩn 17 2.4.1 Thu mẫu - Mua thực phẩm natto Nhật Bản 2.4.2 Phương pháp phân lập VK Natto: * Nguyên tắc - Tách rời tế bào vi khuẩn - Nuôi cấy tế bào MT dinh dưỡng đặc trưng KL riêng rẽ, tách biệt * Cách tiến hành - Lấy 10g natto Nhật Bản giã nhỏ cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác có 90 ml nước muối sinh lý, lắc tạo huyền phù, dung dịch pha loãng 10-1 - Lắc đều, hút ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý, ta dịch pha loãng 10-2 Cứ tiếp tục pha loãng dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 - Từ dịch pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ 0,1 ml (ở nồng độ) vào đĩa petri có sẵn MT LBA Dùng que trang trải dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que trang trải tiếp đĩa (mỗi nồng độ đĩa) o - Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ nhiệt độ 37 C 24h – 48h Chọn KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng Các chủng khiết cấy lên môi trường LBA, nuôi 24h nhiệt o độ 37 C Sau dùng que đục lỗ thạch để lấy vùng vi khuẩn phát triển tốt o (0,5cm), đặt lên bề mặt môi trường BAM ủ 37 C Đo đường kính vòng phân giải sau 18 ủ 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn 2.4.3.1 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc * Nguyên tắc Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước màu sắc KL chủng phân lập để xác định hình dạng tế bào, khả di động khả bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram * Tiến Hành - Lấy vòng que cấy KL ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần mặt thạch (MT LBA) góc Quay đĩa thạch sang hướng khác ria cấy từ vạch thành 3-4 đường khác cho không trùng với đường trước Lặp lại theo hướng thứ 18 ba để pha loãng phần VK dính que cấy Chú ý không nhấc tay lên không thay đổi hướng vòng que cấy o - Đặt mẫu nhiệt độ 37 C 1-2 ngày để chọn KL mọc riêng rẽ - Tiến hành quan sát KL từ phía (từ xuống, từ bên cạnh), ý hình dạng KL, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc ( trên, dưới, có khuếch tán MT không) 2.4.3.2 Phương pháp nhuộm Gram * Nguyên tắc - Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác - Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm không bị rửa trôi xử lí cồn VSV có phức chất thuộc Gram dương - Loại phức chất thứ hai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lí cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung VSV thuộc Gram âm * Cách tiến hành - Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24h ống thạch nghiêng màu - Để khô vết bôi không khí cố định nhẹ đèn cồn - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi - Nhuộm tiêu tím gentian qua giấy lọc phút - Nhuộm lugol phút - Rửa nước cất - Tẩy cồn 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến tan hết - Rửa nước cất - Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây - Rửa nước, làm khô quan sát KHV với vật kính x100 * Đọc kết quả: VK Gram âm bắt màu hồng, VK Gram dương bắt màu tím 2.4.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh tổng hợp Nattokinase vi khuẩn: 2.4.4.1 Phương pháp khuếch tán thạch để xác định hoạt tính Nattokinase (R.Dubey, 2011) Hoạt tính nattokinase xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứa fibrin, 5ml dung dịch fibrin thỏ nồng độ 2% (w/v) đệm phosphate (pH=7,4) trộn với 35ml dung dịch agar 2% tiệt trùng đĩa petri (đường kính 100mm- Độ dày thạch 5mm) Để cố định 30 phút để thạch đông cứng, sau sử dụng que đục lỗ thạch tạo giếng thạch có đường kính 19 5mm Dịch ly tâm dịch lên men vi khuẩn đưa vào giếng thạch ủ o 37 C 18h Sau đo đường kính vòng phân giải để xác định hoạt tính enzyme Một đơn vị (U) định nghĩa lượng enzyme có 25µl dung o dịch enzyme có khả tạo vòng phân giải 1mm pH 7,4 nhiệt độ 37 C 18h 2 Hoạt tính enzyme = (D – ) * 3,14/16 (U) 2.4.4.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả tổng hợp Nattokinsae vi khuẩn Để xác định ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới trình tổng hợp Nattokinase, chủng vi khuẩn nuôi lắc (150 vòng/phút) 50ml môi trường CM o bình tam giác 250ml 37 C Sau khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 72 tiến hành hút 5ml dịch nuôi cấy, cho vào ống Falcon 15ml ly tâm chế độ 6000 o vòng/phút, C 20 phút Sau dịch sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 2.4.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH môi trường tới khả tổng hợp Nattokinase vi khuẩn Chủng vi khuẩn nuôi lắc (150 vòng/phút) 20ml môi trường CM o bình tam giác 50ml 37 C pH ban đầu môi trường điều chỉnh với giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dung dịch NaOH 1N HCL 1N Sau 36h o nuôi cấy tiến hành ly tâm chế độ 6000 vòng/phút, C 20 phút Sau dịch sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch 2.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Giống vi sinh vật bảo quản môi trường thạch nghiêng LBA nhiệt độ o C Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật cấy chuyển lần để đảm bảo sức sống ổn định giống vi sinh vật trình nghiên cứu 2.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn Dùng que cấy lấy sinh khối từ ống giống cấy vào môi trường LB, sau nuôi 20 o lắc (150 vòng/phút) nhiệt độ 37 C 24h Sau kết thúc thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào tăng lên khoảng 108 tế bào/ml được2 cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 10% TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012) Phân lập tuyển chọn số chủng bacillus sinh tổng hợp nattokinase Tạp chí Sinh học 2.Lê Hồng Thọ (2011) Natto gì? Vietsciences 3.Ralph E., Holsworth Jr.(2002).Nattokinase and Cardiovascular Health.Special Report 4.Sumi H., Hamada H., Tsushima H et al (1987) A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto Fibrinolysis 2: 67 5.Meruvu H., Vangalapati M., 2011 Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme, International Journal of Chemical 6.SumiH (1994) Structure and Fibrinolytic Propertiesof Nattokinase.Okayama, Japan: Departmentof Nutrition, Faculty of Health and Welfare Science, Okayama Prefectural University 7.Maruyama M & Sumi H (2008) Effect on Natto diet on blood pressure, JTTAS 8.Sumi H., 1995, Healthy Mirobe “Bacillius Natto” , Japan Bio Science Laboratory 9.Kim S., Choi N (2000) Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang Biotechnol Biochem, 64: 1722-1725 10.Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S (1996) Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Appl Environ Microbiolo., 62 (7): 1488-2482 11.http://giaoduc.net.vn/Suc-khoe/Chuyen-gia-Dinh-duong/9-cong-dung- chuabenh-it-biet-cua-dau-nanh-post119335.gd 21 22