Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR -RFLP

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    NGUYỄN THỊ HOA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM    NGUYỄN THỊ HOA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Cƣờng Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Cường, phòng Công nghệ gen động vật, viện Công nghệ sinh học, viện Khoa học Công nghệ Việt Nam; PGS nhiệt tình bảo, định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình công tác, học tập nghiên cứu để thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình nghiên cứu viên, cán phòng Công nghệ gen động vật bảo, hướng dẫn mặt kỹ thuật, chuyên môn, giúp đỡ học tập làm việc Để hoàn thành tốt luận văn, nhận ủng hộ, động viên khuyến khích gia đình, bạn bè suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn‼ Thái Nguyên, ngày 22 tháng năm 1010 Tác giả Nguyễn Thị Hoa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu chữ Tên Tiếng Anh Tên Tiếng Việt Amplifed Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn DNA Polymorphism khuyếch đại bp Base paire cặp bazơ BF Backfat Độ dày mỡ lưng dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleosit triphotphat DGAT Diacyl glycerol acyltransferase Enzyme Diacyl glycerol AFLP acyltransferase H-FABP Heart fatty acid binding protein Protein liên kết acid béo tim EDTA Ethylene diamine tetracetic acid Axit ethylen diamin tetracetic EtBt Ethidium bromid Ethiđium bromit IMF Intramuscular fat content Hàm lượng mỡ giắt Lpin1 Lipin1 gene Gen Lpin1 LB Loading buffer DNA vi vệ tinh OD Optical density Mật độ quang học PAP Phosphatidate phosphatase Enzyme Phosphatidate phosphatase PPARα Peroxisome proliferator Thụ thể Peroxisome PGC-1α Coactivator-1α Coactivator-1α QTL Quantitative trait loci Vị trí tính trạng số lượng RAPD Random Amplified Polymorphic Đa hình DNA khuyếch đại DNA ngẫu nhiên Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt giới Polymorphism hạn RNase Ribonucleasa Ribonucleaza SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodexyl sunfat TAG Triacylglycerol Triacylglycerol TE Tris- EDTA Đệm TE TBE Tris boric acid- EDTA Đệm TBE RFLP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nhiệm vụ đề tài CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chỉ thị di truyền (Genetic marker) 1.1.1 Chỉ thị loại (known function) 1.1.2 Chỉ thị loại (unknown function) 1.2 Ứng dụng thị di truyền đến tính trạng số lượng lợn 1.2.1 Nghiên cứu gen lợn nước 1.2.2 Nghiên cứu gen lợn Việt Nam 1.3 Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP) 11 1.3.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen H-FABP 11 1.3.2 Đa hình di truyền gen H-FABP 15 1.4 Gen Lipin (Lpin1) 18 1.4.1 Vị trí, cấu trúc, chức gen Lpin1 18 1.4.2 Đa hình di truyền gen Lpin1 25 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguyên liệu, hoá chất trang thiết bị 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Hoá chất 28 2.1.3 Máy móc, trang thiết bị 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợn 32 2.2.2 Phương pháp kiểm tra DNA điện di gel agarose 33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.3 Định lượng DNA quang phổ kế 35 2.2.4 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 36 2.2.5 Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) 38 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai lợn 40 3.2 Phân tích đoạn gen H-FABP phương pháp PCR-RFLP 41 3.2.1 Phân tích đoạn gen H-FABP phương pháp PCR 41 3.2.2 Phân tích đoạn gen H-FABP enzyme cắt giới hạn HaeIII 42 3.3 Phân tích gen Lpin1 phương pháp PCR- RFLP 47 3.3.1 Phương pháp phân tích gen Lpin1 phương pháp PCR 47 3.3.2 Phân tích gen Lpin1 enzyme cắt giới hạn MspI 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 KẾT LUẬN 51 ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 TIẾNG VIỆT 53 TIẾNG ANH 55 PHỤ LỤC 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các loại thị di truyền phân tử động vật Bảng 1.2 Một số gen thị di truyền phân tử có tương quan với tính trạng quan trọng lợn Bảng 1.3 Vị trí yếu tố phiên mã bám vùng phía 12 trước đầu 5’ gen mã hóa H-FABP Bảng 2.1 Danh mục hoá chất sử dụng luận văn 28 Bảng 2.2 Trình tự mồi điều kiện phản ứng 29 Bảng 2.3 Đệm dung dịch pha chế 29 Bảng 2.4 Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm 30 Bảng 2.5 Tương quan nồng độ gel agarose kích thước 34 đoạn DNA cần phân tích theo Sambrook CS Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR gen H-FABP 37 Lpin1 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR gen H-FABP 38 Lpin1 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR 39 Bảng 3.1 Tần số alen vị trí RFLP gen H-FABP 43 số giống lợn Bảng 3.2 Các điểm cắt enzyme HaeIII đoạn gen H- 44 FABP Bảng 3.3 Kết phân tích đa hình RFLP kiểu gen H-FABP 45 enzyme HaeIII Bảng 3.4 Điểm cắt MspI đoạn gen Lpin1 48 Bảng 3.5 Tần số alen tần số kiểu gen Lpin1 49 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn Tên hình vẽ, Bảng biểu Hình Trang Hình 1.1 Vị trí gen mã hóa H-FABP nhiễm sắc thể số 11 lợn Hình 1.2 Trình tự aminoacid loại F-ABP 14 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động H-FABP tế bào 15 Hình 1.4 Vị trí gen Lpin1 lợn nhiễm sắc thể số 19 Hình 1.5 Chức phân tử gen Lipin 1, 2, 20 Hình 1.6 Các loại Lpins: Lpin-1A, Lpin-1B, Lpin-2, Lpin-3 25 Hình 1.7 Gen Lpin1 loại tế bào 26 Sơ đồ 31 Quy trình thí nghiệm Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai 40 lợn Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại DNA lợn Móng 41 Yorshire Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H- 42 FABP Sơ đồ Vị trí cắt enzyme HaeIII đoạn gen H- 44 FABP Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP 44 enzyme HaeIII Đồ thị Tần số kiểu gen H-FABP 46 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1 47 Sơ đồ 48 Vị trí cắt MspI đoạn gen Lpin1 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 49 enzyme MspI Đồ thị Tần số kiểu gen Lpin1 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngành chăn nuôi lợn Việt Nam đóng vai trò quan trọng sản xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt tiêu thụ chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp Việt Nam [7] Từ nhiều năm qua phát triển nghành chăn nuôi lợn góp phần đáng kể việc nâng cao chất lượng sống cho người dân Theo thông báo FAO, 55% số lượng lợn giới thuộc vùng Châu Á – Thái Bình Dương Trong đó, Việt Nam có số lượng lợn lớn với khoảng 12 triệu Các giống lợn nội Việt Nam đa dạng, chiếm 60 – 90% mặt số lượng chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới điều kiện chăn nuôi vùng nông thôn nghèo [26] Các giống lợn thường cho chất lượng thịt tốt, ngon chế biến Song nhược điểm giống lợn tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành phần mỡ nhiều, thịt xẻ tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm cải thiện giống vật nuôi cho suất cao mà giữ chất lượng thịt ngon, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam có ý nghĩa quan trọng sản xuất Trong công tác lai tạo chọn giống truyền thống lợn, tiêu chọn lọc thuộc kiểu hình mà chủ yếu tiêu hình thái số tiêu hóa sinh như: tốc độ sinh trưởng xác định cân, đo; chất lượng thịt xác định màu sắc thịt, số lượng cơ, độ pH [17] Phương pháp góp phần vào việc cải tạo giống lợn nuôi Việt Nam Tuy nhiên việc lựa chọn ngoại hình có trở ngại đòi hỏi nhiều thời gian, thường không ổn định nhiều không xác thực Những thành tựu giải mã gen người động vật làm sáng tỏ nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế Thành tựu mở khả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn ứng dụng thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống ngành công nghiệp chăn nuôi lợn Phương pháp cho phép khắc phục hạn chế phương pháp chọn lọc truyền thống như: rút ngắn thời gian chọn lọc, chọn lọc xác hơn, thực chọn lọc tính trạng khó xác định dựa vào ngoại hình Do tính ưu việt nên thời gian qua hướng nghiên cứu phát triển mạnh mẽ Đến có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác xác định chủ yếu tập chung vào tính trạng có ý nghĩa kinh tế như: chất lượng thịt, tốc độ tăng trọng, số sinh lứa, gen kháng bệnh [27] Để nâng cao xuất, năm vừa qua tiến hành lai lợn ngoại với lợn nội Trong chương trình nghiên cứu này, lợn ngoại sử dụng Yorshire cho lai với lợn nội Móng Cái Với mục đích xác định tính đa hình số ứng cử gen liên quan đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống tiến hành nghiên cứu “ Phân tích đa hình số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn phương pháp PCR -RFLP’’ Mục tiêu nhiệm vụ đề tài Mục tiêu Xác định biến thể DNA gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất lượng thịt lợn, nhằm hỗ trợ công tác chọn giống Nhiệm vụ Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP lợn Móng Cái Yorshire phương pháp PCR-RFLP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... “ Phân tích đa hình số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn phương pháp PCR -RFLP ’ Mục tiêu nhiệm vụ đề tài Mục tiêu Xác định biến thể DNA gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất lượng thịt lợn, ... 3.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tai lợn 40 3.2 Phân tích đoạn gen H-FABP phương pháp PCR- RFLP 41 3.2.1 Phân tích đoạn gen H-FABP phương pháp PCR 41 3.2.2 Phân tích đoạn gen H-FABP enzyme cắt... SƢ PHẠM    NGUYỄN THỊ HOA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG THỊT LỢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR- RFLP Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC