Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR-RFLP

Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR-RFLP

luận văn thạc sĩ sinh học

Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR-RFLP

Chuyên ngành: di truyền học

Mã số: 62.42.70 Luận văn thạc sĩ khoa học Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa

Lớp: cao học k16 Trường: ĐHSP Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Cường Viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt

Nam.

Nội dung

Mở đầu

1.Tính cấp thiết của đề tài

2.Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài

* Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.1 Chỉ thị di truyền

1.2 Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lượng ở lợn1.3 Gen Heart-fatty acid binding protein (H-FABP)

1.4 Gen Lipin1 (Lpin1)

* Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

* Chương 3: Kết quả và thảo luận

3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn

3.2 Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP

3.3 Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR-RFLP

Kết luận và đề nghị

Mở đầu

1.Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong sản

xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt được tiêu thụ và chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp của Việt Nam [7] Sự phát triển của ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng cao chất

lượng cuộc sống cho người dân

Các giống lợn nội của Việt Nam rất đa dạng, chúng thích nghi với điều kiện khí hậu, nguồn thức ăn ở VN, lợn nội cho chất lượng thịt tốt, ngon khi chế biến…song nhược điểm: tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành

phần mỡ nhiều, trong thịt xẻ và tỉ lệ tiêu tốn thức ăn cao Do vậy đã có

nhiều hướng nghiên cứu cải tạo giống lợn nội cho năng suất cao mà vẫn giữ được những ưu điểm trên

Trong công tác lai tao và chọn giống truyền thống còn nhiều hạn chế, để khắc phục những hạn chế đó, nhờ vào thành tựu về giải mã gen người và động vật làm sáng tỏ nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế

Thành tựu này mở ra khả năng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống trong nghành nuôi lợn

Tại viện cnsh vn kết hợp với viện chăn nuôi Thụy Phương HN, trong

những năm vừa qua, để cải thiện năng suất các giống lợn nội đã tiến hành lai giữa lợn thuần ngoại với lợn nội Trong chương trình nghiên cứu này lợn ngoại là Y và lợn nội là MC Chúng tôi xác xác định tính đa hình của một số ứng cử gen liên quan đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống chúng tôi tiến

hành nghiên cứu

“ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn

bằng phương pháp PCR -RFLP’’.

Nhiệm vụ

Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP ở lợn Móng Cái và Yorshire bằng phương pháp PCR-RFLP.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.1 Chỉ thị di truyền (Genetic marker)

Chỉ thị di truyền phân tử (genetic marker) là một gen hay một trình

tự DNA đã được xác định vị trí trên nhiễm sắc thể, và có tương quan với một gen hoặc một tính trạng cụ thể Nó được biết như một biến dị được sinh ra do đột biến hoặc do sự biến đổi vị trí trong hệ gen Một chỉ thị di truyền có thể là một trình tự DNA ngắn như trình tự lặp lại xung quanh một base-pair hoặc một đoạn dài như minisatellites [28]

1.1.1 Chỉ thị loại 1 (known function)

Còn gọi là các ứng cử gen (candidate gene) - là những chỉ thị đối với những gen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện

1.1.2 Chỉ thị loại 2 (unknown function)

Là những chỉ thị nằm ngoài vùng mã hóa của gen, nó có thể nằm gần hoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện Chỉ thị loại này chưa được biết sản phẩm của nó

1.2 Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lượng ở lợn

Thời gian qua, số lượng gen và chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng

có ý nghĩa kinh tế đã đem lại hiệu quả to lớn trong điều khiển năng suất giống lợn

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.2.1 Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài

Nghiên cứu này được bắt đầu từ những năm 90 ở những nước trong khối EU, Mỹ, Úc, Trung Quốc…

Các vạch ghi trên bản đồ gen lợn đã nhanh chóng được tăng lên Đến tháng 1/2009 ngân hàng dữ liệu bản đồ gen lợn đã có

4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau, trong đó 3711 QTLs liên quan đến tính trạng chất lượng thịt [27]

1.2.2 Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam

Nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này đang được quan tâm Tại viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt Nam từ năm 2001 đã hợp tác với trường đại học Stuttgart, CHLB Đức nghiên cứu đa hình gen trong một số giống lợn thuần nội Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy các giống lợn nội Việt Nam có tính di truyền cao Tuy nhiên tần suất kiểu gen liên quan đến tốc

độ sinh trưởng cao, chất lượng thịt tốt ở lợn Việt Nam là thấp.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.3 Gen Heart- fatty acid binding

protein (H-FABP)

1.3.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng của

gen H-FABP

vị trí: Gen H-FABP là gen mã hóa cho

protein gắn axit béo ở cơ, nằm trên

nhiễm sắc thể số 6 ở lợn, tại vị trí 6q21

-> 6q26 [19], Ovilo đã xác định được gen

H-FABP nằm trong khoảng giữa marker

SW316 và SO228 (SW316- 3,4cM –

H-FABP – 12,5cM – SO228) [39, 40].

Cấu trúc:

Cấu trúc: Gồm 4 exon mã hóa lần lượt

cho các đoạn polypeptit gồm 24, 58, 34,

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chức năng của gen H-FABP

Gen H-FABP là gen mã hóa cho một

protein H-FABP liên kết axit béo ở cơ, có

kích thước là 15kDa

+ H-FABP có mặt ở các mô có nhu cầu cao

về các axit béo: mô cơ, mô tim, mô cơ

xương, tuyến sữa

+ H-FABP là các protein nhỏ nội bào liên

kết với các axit béo để vận chuyển các axit

béo này qua màng tế bào chất, để cung cấp

năng lượng hoặc tổng hợptriacylglycerol

(TAG) hay phospholipid [62]

+ Hơn thế nữa, H-FABP có thể điều chỉnh

hàm lượng axit béo trong cơ và thông qua

con đường này chúng điều khiển quá trình

tổng hợp lipid H-FABP và A-FABP được coi

là hai ứng cử gen cho tính trạng hàm lượng

mỡ ở lợn.

Gen H-FABP nằm trên nhiễm sắc thể

số 6, chúng được giải trình tự và có 3 vị trí

cắt của enzym giới hạn Ba vị trí đa hình độ

dài đoạn giới hạn đã được xác định trên

trình tự gen H-FABP: điểm cắt của enzyme

HaeIII tại nucleotit 1811 (G bị thay thế

bằng C), điểm cắt của enzyme HaeIII nằm

trên intron của gen H-FABP [19].

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của H-FABP

trong tế bào

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.4 Gen Lipin1 (Lpin1)

1.4.1 Vị trí, cấu trúc, chức năng của

gen Lpin1

Vị trí: Gen Lpin1 nằm trên nst số 3,

Trên nhiễm sắc thể gen Lpin1 nằm ở

RACE (genbank mã số 164.847 E.U)

chuỗi này bao gồm:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chức năng phân tử của gen

Lpin1 là coactivator phiên mã

Lpin1 trực tiếp tương tác với

của gen Lipin 1,

2, 3

Chương 1: Tổng quan tài liệu

 Lpin1 là cần thiết cho sự phát

triển của adipocytes trưởng

thành

 Tăng cường biểu hiện Lpin1 ở

chuột biến đổi gen gây béo

phì

 Lpin1 trong mô mỡ ảnh

hưởng tới độ nhạy cảm

insulin và biểu hiện cytokine

giảm viêm ở người.

 Lpin1 là cần thiết cho trao

đổi chất bình thường giữa các

Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.4.2 Đa hình di truyền gen Lpin1

Kết quả nghiên cứu của Zhao và cs (3/2008) nghiên cứu trên

162 con lợn: Tong Cheng (42), Large White (25) và con lai Large White * (Landrace * Tong Cheng) (47), Landrace* (Large White * Tong Cheng) (48) Kết quả phân tích về sự lắng đọng chất béo được phân tích trong thịt Lipid tập trung ở thịt vai, thăn, mông,

mỡ lưng, xương xườn, mỡ lá Phân tích đa hình C93T trong

exon 2 ở vị trí 93 của chuỗi mã hóa không gây ra sự thay đổi aa

Sử dụng enzyme Msp1 trên đoạn DNA được nhân lên 316 bp, độ dài đoạn cắt tương ứng là: 316 bp cho alen T, 256 bp và 60 bp cho alen C [56]

Kết quả phân tích cho thấy là kiểu gen: CC có hàm lượng mỡ

lá và mỡ giắt thấp hơn so với hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt của lợn

có kiểu gen TT, TC Trên đối tượng là con người, đa hình gen

Lpin1 liên quan với nhiều đặc điểm trao đổi chất, hàm lượng

insulin, mức độ glucose [52], quá trình trao đổi chất và ảnh

hưởng đến huyết áp tâm thu Đa hình gen Lpin1 có liên quan đến bệnh nhân tiểu đường loại 2 Một đa hình đặc biệt đáng chú ý

Lpin1 gây ra một sự thay thế acid amin trong miền C-Lip và được kết hợp với statin gây ra bệnh cơ [58].

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu mô tai của giống lợn Móng cái (MC, n=97) và Yorshire (Y, n=53) Được lấy từ viện chăn nuôi Thụy Phương, Hà Nội

Mẫu mô tai được bảo quản trong cồn 750, ở -200C, được sử dụng

phân tích các gen trong nghiên cứu

2.1.2 Hoá chất

Các hoá chất sử dụng được mua từ các hãng nổi tiếng trên thế giới Danh mục các hoá chất đã sử dụng trong luận văn được trình bày trong bảng 2.1

Các cặp mồi trong nghiên cứu được tổng hợp bởi hãng Fermantas có trình tự như bảng 2.2

Các dung dịch và đệm đã pha chế sử dụng trong luận văn được trình bày trong bảng 2.3

2.1.3 Máy móc, trang thiết bị

Các máy móc, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.4

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen

từ mẫu mô tai lợn

Khuyếch đại đoạn gen H-FABP và Lpin1

bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 2%

Xác định kiểu gen của H-FABP và Lpin1

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợ

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không có bản chất DNA

Bước 3: Tủa DNA

2.2.2 Phương pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose

2.2.3 Định lượng DNA bằng quang phổ kế

2.2.4 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 ở bảng 2.6.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thể hiện ở bảng 2.7

2.2.5 Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP)

Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR thể hiện ở bảng 2.8

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn

DNA đã được tách từ 150 mẫu mô tai lợn được kiểm tra bằng 2 phương pháp là điện di và đo quang phổ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm DNA

tách chiết từ mô tai lợn

Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái và Yorshire

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Phân tích đoạn gen

Dựa trên trình tự gen

H-FABP được công bố trên

ngân hàng gen GenBank-

Y15180 để thiết kế cặp

mồi dùng cho phản ứng

PCR Đoạn gen H-FABP

được nhân lên có kích

đoạn gen H-FABP.

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2.2 Phân tích đoạn genH-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII

Bảng 3.2 Các điểm cắt của enzyme HaeIII

trên đoạn gen H-FABP

Sơ đồ vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP

117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 683

bp Alen D GG CC GG CC

117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 287 bp HaeIII 405 bp

Alen d GG CC GG CC GGCC

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII Kết quả phân tích

đa hình RFLP gen H-FABP với enzyme HaeIII thể hiện ở hình 3.4.

(M: chỉ thị DNA 100 bp, 1- sản phẩm PCR; 2-5 sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP Trong

đó giếng 2- kiểu gen dd; giếng 3, 4- kiểu gen Dd; giếng 5- kiểu gen DD).

500bp

683bp

405bp 287bp 117bp 60bp

816bp

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen

H-FABP bằng enzyme HaeIII

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả phân tích cho

thấy lợn Móng Cái chỉ có kiểu

gen DD và Dd, trong đó DD

(99%) cao hơn nhiều kiểu gen

Dd (1%) Đa hình RFLP ở gen

H-FABP ở lợn Yorshire cao hơn

giống lợn nội với 3 kiểu gen:

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.3 Phân tích gen Lpin1

phương pháp, chúng tôi tiến

hành nhân đoạn gen Lpin1

Theo trình tự Genbank EU

164847, đoạn gen được nhân

lên có kích thước 316 bp được

thể hiện ở hình 3.5

8 7 6 5 4 3 2 1 M

500bp 316bp

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân

đoạn gen Lpin1

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Bảng 3.4 Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

M 1 2 3 4 5 6 7 8

500bp

316bp 256bp

60bp

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm cắt

đoạn gen Lpin1 bằng enzyme MspI

Kiểu gen TT, TC, CC đều

xuất hiện ở Yorshire với

tần số tương ứng là:

5,7%; 45,3%; 49% và ở

lợn Móng Cái chỉ xuất hiện

kiểu gen TC và CC với tần

số tương ứng là: 15,5% và

17,5% Như vậy kiểu gen

Lpin1 ở lợn Yorshire là đa

hình hơn lợn Móng Cái.

(M: Chỉ thị DNA 100 bp, 1-8 sẳn phẩm cắt đoạn gen Lpin1 Trong

đó: giếng 1, 2 kiểu gen TT; giếng 3, 5, 7, 8 kiểu gen TC; 4, 6 kiểu

gen CC).

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả này cũng tương

tự như kết quả nghiên cứu

của Zhao và cs (3/2008) [56],

nghiên cứu trên 162 con lợn:

Tong Cheng (42), Large White

(25) và con lai Large White *

(Landrace * Tong Cheng)

(47), Landrace* (Large White

* Tong Cheng) (48) Theo kết

quả nghiên cứu thì kiểu gen

CC có hàm lượng mỡ lá và mỡ

giắt thấp hơn so với hàm

lượng mỡ lá và mỡ giắt của

lợn có kiểu gen TT, TC

Đồ thị tần số kiểu gen Lpin1 của lợn Móng Cái (MC)

và Yorshire (Y)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

2 Đã nhân đặc hiệu đoạn gen Lpin1 có kích thước 316 bp, và đoạn gen H-FABP có

độ dài 816 bp.

3 Phân tích đa hình gen H-FABP bằng enzyme HaeIII RFLP cho kết quả:

* Ở lợn Yorshire: + 37,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=20)

+54,7% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=29)

+ 7,6% cá thể mang kiểu gen đồng hợp dd (n=4)

* Ở lợn Móng Cái:

+ 99% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=96)

+ 1% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=1)

+ 0% cá thể mang kiểu gen đông hợp dd (n=0)

4 Phân tích đa hình gen Lpin1 bằng MspI RFLP cho kết quả:

* Ở lợn Yorshire: + 5,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=3)

+ 45,3% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=24)

+ 49% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=26)

* Ở lợn Móng Cái: + 0% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=0)

+ 15,5% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=15)

+74,5% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=72)

Đây là kết quả bước đầu làm cơ sở nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình