Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

MỞ ĐẦU Vi tảo là mắt xích đầu tiên và then chốt trong chuỗi thức ăn của thủy vực; chúng sử dụng nguồn CO cho quang hợp, góp phần giảm thiểu phát thải khí nhà kính nhằm duy trì hệ sinh thái trái đất. Ngoài lợi ích sinh thái, vi tảo là một nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng đồng thời chúng còn tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị sinh học cao. Với sự phát triển rất mạnh của ngành công nghệ sinh học vi tảo, nhiều hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đã được mở ra. Trong đó, việc sử dụng vi tảo nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (NTTS) và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao vẫn là lĩnh vực chiếm ưu 2 thế, mang lại lợi nhuận cao và có tiềm năng phát triển trong tương lai. NTTS xuất khẩu là một trong những thế mạnh của Việt Nam. Trong ngành NTTS Việt Nam, nuôi cá hồi đang là một hướng đi mới, với nhiều tiềm năng về giá trị kinh tế và dinh dưỡng. Tuy nhiên, ngành nuôi cá hồi ở Việt Nam hiện nay đang gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là do nguồn thức ăn kém chất lượng. Astaxanthin là thành phần carotenoid chính để tạo màu sắc cho cá hồi và một số cơ thể thủy hải sản khác. Cá hồi không tự tổng hợp được astaxanthin trong cơ thể mà phải được cung cấp từ thức ăn nhân tạo. Hiện nay, toàn bộ thức ăn cho cá hồi đều nhập ngoại vì trong nước chưa sản xuất được astaxanthin. Astaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo. Tuy nhiên, với astaxanthin nhân tạo, cá hồi khó hấp thu. Do vậy, việc tìm kiếm nguồn sinh vật có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin tự nhiên cao đang được tập trung nghiên cứu cả trong nước và quốc tế. Trong tự nhiên, mặc dù một số loại thực vật, vi khuẩn và nấm men có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm lượng astaxanthin nội bào của chúng rất thấp. Trong khi đó, vi tảo lục Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) có khả năng tích lũy astaxanthin từ 3-7% sinh khối khô (SKK). Đây là một ứng cử viên tiềm năng cao để khai thác nguồn astaxanthin tự nhiên. Trước đây, giá thành sản xuất vi tảo lục H. pluvialis rất cao (khoảng 200÷250 đô la/kg SKK) nên không thể sử dụng loài này như một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên cho mục đích thương mại. Hiện nay, do sự phát triển của công nghệ sinh học tảo nói chung và công nghệ nuôi trồng vi tảo nói riêng đã đem lại những kết quả quan trọng trong nuôi trồng một số loại tảo, trong đó có H. pluvialis. Trên thế giới, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học, công nghệ nuôi trồng và ứng dụng loài vi tảo lục này với mục đích tạo màu sắc cho các đối tượng NTTS đã được quan tâm và triển khai rộng rãi. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus giàu astaxanthin làm tăng màu sắc và chất lượng thịt của các đối tượng NTTS tiềm năng vẫn còn mới mẻ, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người. Hơn nữa, loài tảo này có tốc độ sinh trưởng chậm, có chu trình sống phức tạp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy nên cần có những nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học, thiết lập được qui trình công nghệ nuôi trồng phù hợp đối với tảo này ở các cấp độ nuôi khác nhau. Chính vì vậy, nhằm tháo gỡ những khó khăn hiện nay trong nuôi trồng loài vi tảo lục nêu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” với mục đích: Có được điều kiện nuôi cấy tối ưu một chủng/loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis tiềm năng cho sản xuất astaxanthin để làm thức ăn bổ sung cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản. Để thực hiện được mục tiêu nêu trên, một số nội dung nghiên cứu cần được thực hiện như sau:  Sàng lọc, định tên khoa học dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự gen 18S rRNA và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp. HB tiềm năng lựa chọn được;  Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Haematococcus pluvialis HB trong các hệ thống nuôi khác nhau (bình tam giác, bình nhựa 1,5 và 10 Lít (L); Hệ thống nuôi kín 20, 50 và 100 L) ở điều kiện phòng thí nghiệm;  Tối ưu điều kiện tích lũy astaxanthin của chủng Haematococcus pluvialis HB ở qui mô phòng thí nghiệm;

LƯU THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TẠO SINH KHỐI GIÀU ASTAXANTHIN CỦA LOÀI

VI TẢO LỤC Haematococcus pluvialis FLOTOW

NHẰM ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY

SẢN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 Giới thiệu chung về astaxanthin……… 5

1.1.1 Đặc điểm chung……… 5

1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin……… 6

1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin……… 6

1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin……… 7

1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin……… 12

1.1.6 Đặc tính chống ôxy hóa của astaxanthin……… 12

1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin……… 13

1.2 Giới thiệu chung về chi vi tảo lục Haematococcus……… 16

1.2.1 Vị trí phân loại và phân bố……… 16

1.2.2 Các loài Haematococcus……… 16

1.2.3 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái……… 17

1.2.4 Thành phần sinh hóa học của tảo H pluvialis……… 19

1.2.5 Quy trình sản xuất astaxanthin ở H pluvialis……… 21

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất astaxanthin từ H pluvialis 21 1.3 Tình hình nghiên cứu và công nghệ nuôi trồng tảo H pluvialis cho sản xuất astaxanthin……… 22

1.3.1 Nuôi cấy quang tự dưỡng……… 23

1.3.2 Nuôi cấy dị dưỡng và tạp dưỡng……… 28

1.3.3 Nâng cao hiệu quả sản xuất astaxanthin từ H pluvialis……… 30

1.4 Thách thức sản xuất astaxanthin thương mại từ tảo H pluvialis 35 1.5 Ứng dụng sinh khối tảo H pluvialis trong nuôi trồng thủy sản… 36 1.6 Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo H pluvialis ở Việt Nam 38 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật liệu……… 40

2.1.1 Vật liệu……… 40

2.1.2 Các bộ kít sinh phẩm……… 40

iv

2.1.3 Động vật thí nghiệm……… 40

2.1.4 Hóa chất……… 40

2.1.5 Máy móc và thiết bị……… 41

2.1.6 Môi trường nuôi cấy……… 42

2.1.7 Địa điểm nghiên cứu……… 42

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 42

2.2.1 Các phương pháp liên quan đến sàng lọc, định tên khoa học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp HB.……… 42

2.2.2 Các phương pháp liên quan đến sinh trưởng, đặc điểm sinh học của chủng vi tảo lục Haematococcus sp HB……… 45

2.2.3 Các phương pháp liên quan đến sử dụng sinh khối chủng HB giàu astaxanthin cho cá hồi Vân và cá Koi Nhật……… 48

2.3 Bố trí thí nghiệm……… 49

2.3.1 Nghiên cứu sự thay đổi hình thái, kích thước của tế bào trong vòng đời của chủng Haematococcus pluvialis HB ở cấp độ bình tam giác 250 – 1000 mL và bình nhựa 1,5 và 10 L……….…… 49

2.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng của chủng Haematococcus pluvialis HB trong điều kiện phòng thí nghiệm……… 50

2.3.3 Nghiên cứu điều kiện nuôi thích hợp cho sinh trưởng của tảo Haematococcus pluvialis HB đạt MĐTB cao 51

2.3.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho tích lũy astaxanthin ở tảo Haematococcus pluvialis HB trong pha 2 53

2.3.5 Thu hoạch sinh khối tảo……… 55

2.3.6 Sử dụng sinh khối chủng vi tảo lục Haematococcus pluvialis HB làm thức ăn cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……… 56

2.4 Xử lý số liệu……… 57

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 58

3.1 Sàng lọc và đặc điểm sinh học của chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất astaxanthin……… 58

v

3.1.1 Sàng lọc chủng vi tảo tiềm năng cho sản xuất astaxanthin……… 58 3.1.2 Định tên khoa học ở mức độ phân tử dựa vào đọc và so sánh

carotenoid hydroxylase (CHY)……… 64 3.1.4 Sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào trong vòng đời của H

3.2 Nuôi trồng vi tảo lục H pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ

3.2.1 Nuôi cấy vi tảo lục H pluvialis HB trong pha 1 75

3.3 Thử nghiệm bổ sung sinh khối tảo H pluvialis HB giàu

astaxanthin cho cá Koi Nhật và cá hồi Vân……… 107

3.3.2 Thử nghiệm thức ăn có phối trộn astaxanthin từ sinh khối tảo H

pluvialis HB lên màu sắc của cá Koi Nhật và cá hồi Vân………… 108

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 117 4.1 Đặc điểm sinh học của chủng Haematococcus sp HB lựa chọn

4.2 Nuôi trồng vi tảo lục H pluvialis HB giàu astaxanthin trong các hệ

thống khác nhau 120 4.3 Sử dụng sinh khối tảo H pluvialis HB giàu astaxanthin trong

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết

tắt

dihydrochloride

2,2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride

1-aminocyclopropane-1-cacboxylic

vii

chống ôxy hóa của một chất

viii

Trang

trên) và khoảng cách di truyền (ma trận tam giác dưới) của đoạn

gen 18S rRNA giữa các loài thuộc chi Haematococcus………… 63

loài H pluvialis HB và các loài Haematococus trên ngân hàng

gen Quốc tế……… 66

giai đoạn sinh trưởng khác nhau……… 70

các môi trường nuôi và các cấp độ nuôi khác nhau…… 77

Bảng 3.8 Thành phần dinh dưỡng, kim loại nặng, vi sinh vật tổng số và

hàm lượng astaxanthin của sinh khối tảo H pluvialis HB nuôi

sắc của cá ở các giai thí nghiệm và giai đối chứng……… 109 Bảng 3.10 Sinh trưởng của cá hồi Vân ở các lô đối chứng và thí nghiệm khác nhau 111 Bảng 3.11 Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng kim loại nặng của thịt cá

Bảng 3.12 Hàm lượng lipít và thành phần axít béo của thịt cá hồi Vân ở các

lô thí nghiệm và đối chứng……… 115

ix

Trang

Hình 1.10 Mô hình nuôi cấy tảo H pluvialis theo phương pháp nuôi

HB chụp dưới kính hiển vi quang học (hàng trên) và điện tử

x

gen 18S rRNA (B) và tinh sạch DNA plasmid chứa vector

tái tổ hợp (C) của mẫu vi tảo Haematococcus sp HB………

HB với một số gen CHY của các loài thuộc chi

Haematococcus đã được công bố trên ngân hàng GenBank 66

Hình 3.10 Thay đổi MĐTB trong vòng đời của chủng HB nuôi ở các

Hình 3.11 Sự thay đổi của hàm lượng chlorophyll a, astaxanthin và

protein nội bào của chủng HB nuôi ở các cấp độ khác nhau

Hình 3.12 Ảnh chạy TLC dạng sắc tố của tế bào H pluvialis HB ở các

Hình 3.13 Sự thay đổi hình thái và kích thước tế bào trong vòng đời

Hình 3.14 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở nhiệt độ (A) và

Hình 3.15 Sự thay đổi của MĐTB của chủng HB ở pH (A) và nguồn

Hình 3.17 Thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng astaxanthin (B) của

chủng HB khi được nuôi cấy ở các chế độ chiếu sáng khác

Hình 3.18 Ảnh minh họa hình thái tế bào chủng HB ở chế độ chiếu

Hình 3.19 Thay đổi MĐTB của chủng HB khi nuôi cấy trong môi

xi

nuôi………

Hình 3.21 Hình thái tế bào của chủng HB trong HTNK 26 L chụp dưới

kính hiển vi quang học (A, x 400 lần) và huỳnh quang sau

Hình 3.22 Hình thái tế bào chủng HB dưới kính hiển vi quang học (A)

Hình 3.23 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của

chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt

Hình 3.24 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của

chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - thiếu hụt

Hình 3.25 Ảnh bình thí nghiệm ở pha thiếu hụt nitơ (đối chứng và thí

Hình 3.26 Một số ảnh hình thái tế bào của chủng HB ở thí nghiệm nuôi

Hình 3.27 Sự thay đổi MĐTB (A) và hàm lượng chlorophyll a (B) của

H pluvialis HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2 - chiếu

Hình 3.28 Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin (A) và protein (B) của

chủng HB ở thí nghiệm nuôi cấy 2 pha (pha 2- chiếu ánh

Hình 3.29 Một số ảnh hình thái tế bào chủng HB ở các giai đoạn trong

Hình 3.30 Sự thay đổi MĐTB (A) và tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a

Hình 3.31 Ảnh minh họa hình thái tế bào của chủng HB ở nồng độ

NaCl khác nhau sau 35 ngày nuôi ở cấp độ bình tam giác 97

xii

đại ảnh 2000 X)………

Hình 3.32 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B)

của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2 sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5% 98 Hình 3.33 Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll (A) và astaxanthin (B)

của chủng HB trong thí nghiệm nuôi cấy 2 pha với pha 2 sốc muối NaCl 0,8, 1,5 và 2,5% 98 Hình 3.34 Sự thay đổi hàm lượng lipit tổng số của chủng HB ở nồng

Hình 3.35 Hình thái tế bào chủng HB chụp dưới kính hiển vi quang học

(A) và huỳnh quang sau khi nhuộm Nile Red (B) (x 1000 lần)

ở công thức đối chứng, công thức 1,5 và 2,5% NaCl trong

bình tam giác 250 mL Thanh thước kích thước 10 µm………

Hình 3.39 Hình thái tế bào của chủng HB ở pha 2 được cảm ứng tích lũy

astaxanthin ở các nồng độ bicarbonate khác nhau Thanh

Hình 3.40 Bình nuôi và tế bào chủng HB chuyển màu đỏ ở pha 2 - cảm

Hình 3.41 Ảnh minh họa bình nuôi tảo H pluvialis HB ở pha 2 - cảm

ứng tích lũy astaxanthin bằng nồng độ bicarbonate khác

xiii

Hình 3.44 Sắc ký đồ astaxanthin chuẩn 50 ppm (A) và astaxanthin

Hình 3.45 Cá Koi thí nghiệm (trên) và cá ĐC (dưới) có màu sắc khác

Hình 3.46 So sánh màu sắc của cá Koi ở các giai thí nghiệm khác nhau

(Đối chứng (A); Thí nghiệm bổ sung astaxanthin: (B) 100 mg/kg thức ăn, (C) 150 mg/kg thức ăn và (D) 200 mg/kg

Hình 3.47 Tăng trưởng khối lượng và chiều dài cá Koi của các giai thí

Hình 3.48 Ảnh chụp minh họa kích thước của cá hồi Vân ở các lô đối

chứng (ăn cám Pháp), lô thí nghiệm ăn cám Việt Nam và ăn cám Việt Nam có bổ sung thêm 61 mg astaxanthin từ sinh

Hình 3.49 Ảnh minh họa về màu sắc thịt cá hồi ở 3 công thức được

MỞ ĐẦU

Vi tảo là mắt xích đầu tiên và then chốt trong chuỗi thức ăn của thủy vực;

kính nhằm duy trì hệ sinh thái trái đất Ngoài lợi ích sinh thái, vi tảo là một nguồn thức ăn có giá trị dinh dưỡng đồng thời chúng còn tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị sinh học cao Với sự phát triển rất mạnh của ngành công nghệ sinh học vi tảo, nhiều hướng nghiên cứu và ứng dụng mới đã được mở ra Trong đó, việc sử dụng vi tảo nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (NTTS) và khai thác các chất có hoạt tính sinh học cao vẫn là lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có tiềm năng phát triển trong tương lai

NTTS xuất khẩu là một trong những thế mạnh của Việt Nam Trong ngành NTTS Việt Nam, nuôi cá hồi đang là một hướng đi mới, với nhiều tiềm năng về giá trị kinh tế và dinh dưỡng Tuy nhiên, ngành nuôi cá hồi ở Việt Nam hiện nay đang gặp nhiều khó khăn, chủ yếu là do nguồn thức ăn kém chất lượng Astaxanthin là thành phần carotenoid chính để tạo màu sắc cho cá hồi và một số cơ thể thủy hải sản khác Cá hồi không tự tổng hợp được astaxanthin trong cơ thể mà phải được cung cấp từ thức ăn nhân tạo Hiện nay, toàn bộ thức ăn cho cá hồi đều nhập ngoại vì trong nước chưa sản xuất được astaxanthin Astaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên, với astaxanthin nhân tạo, cá hồi khó hấp thu Do vậy, việc tìm kiếm nguồn sinh vật có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin tự nhiên cao đang được tập trung nghiên cứu cả trong nước và quốc tế

Trong tự nhiên, mặc dù một số loại thực vật, vi khuẩn và nấm men có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm lượng astaxanthin nội bào của chúng rất

thấp Trong khi đó, vi tảo lục Haematococcus pluvialis (H pluvialis) có khả năng

tích lũy astaxanthin từ 3-7% sinh khối khô (SKK) Đây là một ứng cử viên tiềm năng cao để khai thác nguồn astaxanthin tự nhiên Trước đây, giá thành sản xuất vi

tảo lục H pluvialis rất cao (khoảng 200÷250 đô la/kg SKK) nên không thể sử dụng

loài này như một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên cho mục đích thương mại Hiện nay, do sự phát triển của công nghệ sinh học tảo nói chung và công nghệ nuôi trồng vi tảo nói riêng đã đem lại những kết quả quan trọng trong nuôi trồng một số

loại tảo, trong đó có H pluvialis Trên thế giới, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học,

công nghệ nuôi trồng và ứng dụng loài vi tảo lục này với mục đích tạo màu sắc cho các đối tượng NTTS đã được quan tâm và triển khai rộng rãi Tuy nhiên, ở Việt

Nam, những nghiên cứu nhằm khai thác và ứng dụng sinh khối tảo Haematococcus

giàu astaxanthin làm tăng màu sắc và chất lượng thịt của các đối tượng NTTS tiềm năng vẫn còn mới mẻ, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người Hơn nữa, loài tảo này có tốc độ sinh trưởng chậm, có chu trình sống phức tạp và nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy nên cần có những nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học, thiết lập được qui trình công nghệ nuôi trồng phù hợp đối với tảo này ở các cấp độ nuôi khác nhau Chính vì vậy, nhằm tháo gỡ những khó khăn hiện nay trong nuôi trồng loài vi tảo lục nêu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài

nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tạo sinh khối giàu astaxanthin của loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản” với mục đích: Có được điều kiện nuôi cấy tối ưu một chủng/loài vi tảo

lục Haematococcus pluvialis tiềm năng cho sản xuất astaxanthin để làm thức ăn bổ

sung cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản

Để thực hiện được mục tiêu nêu trên, một số nội dung nghiên cứu cần được thực hiện như sau:

ü Sàng lọc, định tên khoa học dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự gen 18S rRNA và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi tảo lục

Haematococcus sp HB tiềm năng lựa chọn được;

ü Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Haematococcus pluvialis HB trong các hệ thống nuôi khác nhau (bình tam giác, bình nhựa 1,5 và 10 Lít (L); Hệ thống nuôi kín 20, 50 và 100 L) ở điều kiện phòng thí nghiệm;

ü Tối ưu điều kiện tích lũy astaxanthin của chủng Haematococcus pluvialis HB

ở qui mô phòng thí nghiệm;

ü Sử dụng sinh khối chủng tảo Haematococcus pluvialis HB giàu astaxanthin

làm thức ăn bổ sung cho cá Koi Nhật (Cyprinus carpio) và cá hồi Vân (Oncorhynchus mykiss) nhằm tăng màu sắc và chất lượng thịt của cá

Những đóng góp mới của luận án

1 Lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống về đặc điểm sinh học và tạo sinh khối

giàu astaxanthin của vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow HB nguồn

khối khô

2 Bước đầu thử nghiệm hiệu quả việc sử dụng sinh khối của chủng H pluvialis

HB giàu astaxanthin bổ sung vào thức ăn cho cá hồi Vân và cá Koi Nhật ở Việt Nam

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1 Có được những dẫn liệu khoa học về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

của chủng Haematococcus pluvialis HB sàng lọc được có tiềm năng sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Vi tảo là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước Hàng năm, trong số 200 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên trái đất, có 170 - 180 tỉ tấn do tảo tạo ra, còn lại 20 - 30 tỉ tấn là do các loài thực vật khác Ý nghĩa lớn lao của các loài tảo là giải phóng ôxy thông qua hoạt động quang hợp cung cấp cho các sinh vật sống dưới nước, khép kín chu trình vật chất trong các thuỷ vực và tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó (Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền (1994))

Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thuỷ vực Với kích thước cơ thể phù hợp, giàu dinh dưỡng, dễ tiêu hoá ít gây ô nhiễm môi trường, nhiều loại không có độc tố và có khả năng nuôi sinh khối lớn nên vi tảo đã trở thành nguồn thức ăn không thể thiếu trong các giai đoạn sinh trưởng của nhuyễn thể hai mảnh vỏ, giai đoạn ấu trùng của một số loài giáp xác, các giai đoạn sinh trưởng sớm của một số loài cá hoặc để sản xuất khối lượng lớn các động vật phù du

như Artemia, Luân trùng (Rotifer)….Ngoài nguồn thức ăn truyền thống như thịt, cá,

trứng, sữa, rau, quả, củ có nguồn gốc từ động vật và thực vật, tảo là một nguồn thức

ăn dinh dưỡng cho người và vật nuôi Nhiều loài vi tảo không chỉ có hàm lượng protein cao mà còn giàu gluxit, lipít, vitamin và các axít béo mạch dài không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) có mạch carbon trên 20 như axít arachidonic (ARA; C20:4n-6), axít eicosapentaenoic (EPA; C20:5n-3), axít docohexanenoic (DHA; C22:6n-3) và axít docosanpentaenoic (DPA; C22:5n-6) - các chất có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của người và đặc biệt trong hoạt động của não và mắt

làm giảm thiểu phát thải khí nhà kính gây ra hiện tượng ấm lên của trái đất và dẫn đến biến đối khí hậu toàn cầu

Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất hiện này của vi tảo vẫn là làm thức ăn trong NTTS và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng thương mại lớn (Spolaore và cs, 2006) Trong các sản phẩm từ tảo thì astaxanthin có giá trị thương mại lớn do các ứng dụng đa dạng với giá thành cao (khoảng 2.500 – 3000

$/kg) (Lorenz & Cysewski, 2000) Astaxanthin có nhiều chức năng sinh học như có

hoạt tính chống ôxy hoá, là tiền chất của một số hormone nhất định, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể Chúng có tác dụng cải thiện khả năng sinh sản, thúc đẩy

sự phát triển và chức năng bảo vệ cơ thể khỏi tác dụng của ánh sáng cao Chính những đặc điểm trên mà astaxanthin ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống con người như trong y học, dược phẩm, mỹ phẩm và trong ngành NTTS Sau đây, chúng tôi xin trình bày khái quát những đặc điểm chính về

Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4, điểm nóng chảy xấp xỉ

cơ, tuy nhiên, chúng có thể hoà tan trong các dung môi không phân cực như acetone, dimethyl-sulfoxide ngay ở nhiệt độ phòng So với các loại carotenoid khác, astaxanthin dễ dàng được hấp thụ và tích luỹ

1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin

β-ionone Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, monoester và diester

tùy thuộc vào sự kết hợp của 1 hoặc 2 gốc hydroxyl với các axít béo Nhóm ester tạo ra mối liên kết giữa astaxanthin và protein Vì vậy, astaxanthin không thể gắn kết với protein nếu liên kết ester không tồn tại Do cấu trúc của astaxanthin có 2 vị trí 3 và 3’ở dạng chiral, cho nên chúng có 3 dạng đồng phân hình học: 3R-3’R; 3R-3’S và 3S-3’S (Hình 1.1) Trong đó, 3S-3’S là dạng astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh nhất, dạng 3R-3’S không có hoạt tính sinh học, dạng 3R-3’R có hoạt tính yếu (Ambati và cs, 2014)

1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin

Có hai con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H pluvialis: con đường

thứ nhất bắt đầu với quá trình ôxy hoá β- carotene tạo thành các chất trung gian là echinenone, canthaxanthin và adonirubin; con đường thứ hai bắt đầu bằng quá trình hydroxyl hoá β-carotene tạo thành các chất trung gian là β-cryptoxanthin, zeaxanthin và adonixanthin (Hình 1.2)

Mặc dù các bước đặc thù của quá trình sinh tổng hợp astaxanthin diễn ra ở tế bào chất nhưng các enzyme chính của con đường tổng hợp carotenoid chung lại

được phân bố ở lục lạp (Jin và cs, 2006) Sinh tổng hợp astaxanthin của H pluvialis

cũng theo con đường tổng hợp carotenoid chung đến β - carotene Từ β - carotene, astaxanthin được hình thành bởi hoạt động của 2 enzyme β - carotene oxygenase

Hình 1.1 Cấu trúc của astaxanthin

(Dạng tự do (A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học

(D) R là các chuỗi axít béo bão hòa hoặc không bão hòa)

(Nguồn: Miao và cs, 2006)

(BKT) và β -carotene hydroxylase (CHY) Các nghiên cứu sử dụng chất ức chế quá trình carotenoid hóa đã chứng minh rằng astaxanthin được tạo ra từ tiền chất canthaxanthin BKT chuyển hóa β - carotene thành canthaxanthin thông qua dạng trung gian là echinenone, tiếp đó dưới tác dụng của enzyme CHY sẽ chuyển canthaxanthin thành astaxanthin (Schoefs và cs, 2001) Do đó, BKT và CHY là 2

emzyme chìa khóa quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp astaxanthin ở tảo H pluvialis

1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin

Có hai nguồn astaxanthin chính là nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học và tự nhiên

1.1.4.1 Nguồn tổng hợp hoá học

Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn

bổ sung nhằm tạo ra các mầu sắc của đối tượng nuôi khác nhau

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở H pluvialis

(Nguồn: Vidhyavathi, 2008)

Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng rãi nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối photphat ở vị trí C15 với dialdehyde ở

vị trí carbon C10 (Hình 1.3A) Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóa canthaxanthin (Hình 1.3B) (Berhard và cs, 1984), một quá trình trùng hợp 3 mạch carbon có chiều dài 10, 20 và 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether (Rüttimann, 1999) và các đồng phân của lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ

để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để hình thành astaxanthin (Hình 1.3C) (Schloemer và Davis, 2001)

1.1.4.2 Nguồn tự nhiên

a Từ các loại giáp xác

Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phần

vỏ ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số Hàm lượng astaxanthin có trong

vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140 mg/kg khối lượng tươi và tồn tại ở dạng 3S - 3’S Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồn astaxanthin đáng kể trong tự nhiên Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong các nguyên liệu này tương đối thấp Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chất dinh dưỡng khác trong vỏ tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn nhất định trong việc sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng thức ăn cho động vật nuôi trồng (Higuera-Ciapara và cs, 2006)

b Nấm men

Hình 1.3 Phản ứng tổng hợp astaxanthin

(Phản ứng Wittig (A); Hydroxyl hóa canthaxanthin (B); Ô xy hóa zeaxanthin (C)

(http://trace.tennessee.edu/utk_chembiopubs/94)

Phaffia rhodozyma là một loài nấm men duy nhất được biết đến hiện nay có

khả năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% SKK (nhưng 100% astaxanthin tích lũy

ở dạng đồng phân 3R - 3’R) Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt mật độ tế bào (MĐTB) cao trong quá trình lên men Tích lũy astaxanthin ở nấm men thông qua con đường mevalonate (Schmidt và cs, 2011) Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của chủng, phương pháp và điều kiện nuôi cấy (Johnson & An, 1991)

Ngoài ra, do Ph rhodozyma có cấu tạo vách tế bào cứng, khó tiêu hóa đối với các

động vật nên trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học chứa astaxanthin từ loài nấm men này cần phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hay

xử lý bằng enzyme khác nhau, nhằm tăng hiệu quả hấp thụ của chất này đối với động vật

c Tảo

Astaxanthin có thể được sản xuất từ các loại tảo khác nhau như

Ankistrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Euglena rubida, Chlorococcum Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ở các chủng tảo nêu trên tương đối thấp và không thích hợp để sản xuất ở quy mô lớn Trong khi đó, vi tảo lục H pluvialis đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học và sản xuất

ứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn astaxanthin (7000 - 55000

µg/g tế bào, tương ứng 0,7 - 5,5% SKK) Astaxanthin từ tảo Haematococcus chứa

5% dạng tự do và 95% dạng được ester hóa (75% monoester và 20% diester) 100%

astaxanthin được chiết xuất từ H pluvialis có dạng 3S-3’S - đây là dạng đồng phân

có hoạt tính chống ôxy hóa cao nhất (Olaizola 2000) Thực tế cho thấy astaxanthin

ở da, cơ và trứng của thủy sản chủ yếu ở dạng 3S-3’S

Cá hồi cũng là một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên Hàm lượng

astaxanthin trong cá hồi hoang dã Oncorhynchus dao động trong khoảng 26 - 38

mg/kg thịt cá Hàm lượng astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương nuôi là 6 - 8 mg/kg thịt cá Với 165 g thịt cá hồi có thể cung cấp đến 3,6 mg astaxanthin cho khẩu phần ăn hàng ngày (Ambati và cs, 2014)

Các nguồn cung cấp astaxanthin và hàm lượng astaxanthin ở các cơ thể khác nhau được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau

(% SKK) Chlorophyceae

Haematococcus pluvialis NIES – 144 7,7

Haematococcus pluvialis (K-0084) 3,8

Haematococcus pluvialis (Local isolation) 3,6

Haematococcus pluvialis (AQSE002) 3,4

Tiềm năng sản xuất astaxanthin từ các nguồn khác nhau dựa trên lợi ích về kinh tế, môi trường và tác động xã hội được chỉ ra trên Bảng 1.2

Kết quả trên Bảng 1.2 đã cho thấy astaxanthin có nguồn gốc tổng hợp hóa học tốt hơn sản xuất astaxanthin từ nấm men và tảo ở hầu hết các tiêu chí thử nghiệm (kinh tế, môi trường và xã hội) So với astaxanthin tự nhiên từ nấm men

hoặc vi tảo lục H pluvialis, astaxanthin tổng hợp hóa học có chi phí nguyên vật

liệu; năng lượng rẻ nhất (40 và 26 $/kg astaxanthin), không tốn diện tích đất sử dụng và không có nước thải Chính vì vậy, giá thành sản xuất astaxanthin là thấp nhất so với 2 nguồn còn lại Tuy nhiên, astaxanthin tổng hợp nhân tạo chứa hỗn hợp của 3 dạng đồng phân 3S-3’S; 3R- 3’S và 3R-3’R tương ứng với tỉ lệ là 1:2:1 Như vậy, chỉ có 25% astaxanthin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính và hữu dụng Với sự hiện diện của các dạng đồng phân hình học khác trong khẩu phần thức ăn sẽ dẫn đến sự cạnh tranh cơ chất trong quá trình chuyển hóa astaxanthin trong cơ thể động vật nuôi Như vậy, khả năng hấp thụ astaxanthin tổng hợp thấp hơn rất nhiều so với astaxanthin có nguồn gốc tự nhiên

Bảng 1.2 So sánh hiệu quả của các phương pháp sản xuất astaxanthin khác nhau

Sử dụng đất (km2)

Sử dụng năng lượng (kwh)

Chi phí năng lượng ($)

Nước thải

Sự thải

ra (không khí)

Giá thị trường ($)

Tiêu thụ cho con người

Giá trị ORAC

khác nhau Astaxanthin trong các sản phẩm tự nhiên ở dạng ester hóa nên nó ổn định hơn trong việc ngăn ngừa quá trình ôxy hóa (Schmidt và cs, 2011) Chỉ có astaxanthin được tổng hợp từ tảo và nấm men mới được sử dụng cho con người, trong khi đó dạng tổng hợp nhân tạo được sử dụng chủ yếu cho thức ăn gia súc (do quá trình tổng hợp astaxanthin có sử dụng hóa dầu gây ung thư đã được tác giả Newsome năm 1986 thông báo) Do vậy, khai thác astaxanthin từ nguồn tự nhiên,

đặc biệt là từ tảo H pluvialis vẫn đang được quan tâm và có nhiều cơ hội để phát

triển ngày càng mạnh

1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin

Astaxanthin có chứa liên kết đôi xen kẽ, nhóm hydroxyl và nhóm keto Nó

có hai tính chất ưa mỡ và ưa nước Màu đỏ được tạo ra do sự liên kết đôi liên tiếp tại trung tâm của hợp chất Hoạt động sinh học của astaxanthin tốt hơn so với các chất chống ôxy hóa khác (β - carotene, vitamin C) bởi vì nó có thể liên kết với màng lipít kép của tế bào từ bên trong đến bên ngoài (Hình 1.4) Vì vậy, tế bào được bảo vệ toàn diện hơn (Ambati và cs, 2014)

1.1.6 Đặc tính chống ôxy hóa của astaxanthin

Astaxanthin có vai trò là chất chống ôxy hoá mạnh Sự trao đổi chất bình thường ở sinh vật hiếu khí tạo ra các gốc tự do như hydroxyl, peroxide và phân tử

Hình 1.4 Vị trí hoạt động của astaxanthin trên màng tế bào

(Nguồn: Ambati và cs, 2014)

Mũi tên: Chỉ vị trí hoạt động của các chất trên màng tế bào

ôxy có hoạt tính (reactive oxygen species - ROS) cần thiết để duy trì sự sống Tuy nhiên, khi hàm lượng các chất này quá cao sẽ gây nguy hiểm bởi chúng có thể ôxy

hoá với các thành phần của tế bào như protein, lipít, carbohydrate và ADN in vivo

Để kiểm soát và làm giảm quá trình này, cơ thể con người sản sinh ra các chất chống ôxy hoá như super oxide dismutase (SOD), catalase, peroxidase…Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, những hợp chất này lại không đủ để bảo vệ cơ thể chống lại stress ôxy hoá

Các nghiên cứu cho thấy, astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hoá cao gấp 10 lần so với các carotenoid khác như zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β - carotene và cao hơn 100 lần so với α - tocopherol Vì vậy, astaxanthin được gọi là một “supper vitamin E” Astaxanthin thực hiện các hoạt động chống ôxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc tự do (chúng phản ứng với các gốc này để tạo ra các hợp chất không độc khác) hoặc dập tắt các phản ứng ôxy hoá Đặc tính này của astaxanthin có thể do sự tương tác vật lý và hóa học của astaxanthin với các màng tế bào (Ambati và cs, 2014)

1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin

Chất màu tự nhiên astaxanthin với hoạt tính chống ôxy hóa cao đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như làm thức ăn bổ sung cho người, thuốc điều trị trong y học, thức ăn bổ sung cho cá hồi và cá cảnh …

1.1.8.1 Astaxanthin trong nuôi trồng thuỷ sản

*/ Trong nuôi cá hồi

Mầu sắc của cá hồi và các loại giáp xác được xem là một chỉ tiêu về chất lượng Màu đỏ của những sinh vật này bắt nguồn từ màu sắc của các carotenoid được chúng thu nhận từ thức ăn Loại carotenoid chiếm ưu thế trong hầu hết các loài giáp xác và cá hồi là astaxanthin Mặc dù trên thực tế, astaxanthin được sử dụng rộng rãi với mục đích duy nhất là tạo màu cho các động vật trong NTTS, tuy nhiên astaxanthin còn có nhiều vai trò quan trọng khác như thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ sống sót của trứng, cải thiện sự phát triển của phôi

Một nghiên cứu gần đây ở Na Uy đã chứng minh rằng cá hồi Đại Tây Dương

ở giai đoạn còn non sẽ phát triển tốt khi được cung cấp đầy đủ astaxanthin trong khẩu phần ăn Astaxanthin được xem như một loại dinh dưỡng thiết yếu với hàm lượng cần thiết tối thiểu là 5,1 mg/kg Tuy nhiên, nếu hàm lượng astaxanthin trong khẩu phần ăn đạt 13,7 mg/kg thì hàm lượng lipít trong thịt cá sẽ tăng lên 20% và sự phát triển của cơ thể sẽ đầy đủ hơn so với mức 5,3 mg/kg astaxanthin (Lorenz và Cysewski, 2000)

*/ Trong nuôi cá cảnh

Cá cảnh không tự tổng hợp được carotenoid mà lấy từ nguồn thức ăn như vi tảo, san hô hoặc con mồi có chứa loại chất màu này Khi bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn, cá sẽ chuyển hóa astaxanthin có trong thức ăn thành tuaxanthin và tích lũy chúng trong da và làm cho cá có màu sắc rực rỡ Cá có khả năng hấp thụ các loại carotenoid tốt theo thứ tự như sau: zeaxanthin (không phổ biến) > astaxanthin > lutein (có nhiều trong các loại thực vật như ngô…)

Như vậy, việc sử dụng astaxanthin trong NTTS không chỉ quan trọng khi đứng trên phương diện tạo sắc tố mà astaxanthin còn được xem như là một chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh sản đầy đủ của các loài thuỷ hải sản

có giá trị thương mại

1.1.8.2 Astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho con người

Astaxanthin có tác dụng trong việc bảo vệ võng mạc khỏi bị ôxy hóa, cải thiện những tổn thương võng mạc, bảo vệ các tế bào tiếp nhận ánh sáng khỏi thoái hóa, chống lại sự thoái hóa điểm vàng do tuổi tác - nguyên nhân gây mù loà (Palozza và cs, 2009) Chúng giúp bảo vệ nơ ron thần kinh và có thể làm chậm lại tác động của tuổi tác (giảm các triệu chứng như giảm trí nhớ, suy giảm chức năng thần kinh) Con người sử dụng astaxanthin thường xuyên sẽ giảm đáng kể sự tích tụ hydroperoxide phospholipid, một hợp chất được chứng minh là đã được tích tụ nhiều ở những người bị bệnh mất trí nhớ, hay quên ở người lớn tuổi Do đó, nó có thể chống lại bệnh Alzheimer Ngoài ra, astaxanthin giúp cải thiện tuần hoàn máu

và giảm huyết áp Nó rất có lợi cho màng tim, có tác động tốt lên máu, tăng lượng

HDL (high density lipoprotein - cholesterol, cholesterol có lợi) và giảm triglycerides (Iwamoto và cs, 2001) Do có khả năng bắt giữ các gốc tự do được hình thành trong quá trình quang hoá nên astaxanthin có tác dụng tích cực đối với

da như giảm nếp nhăn, tăng độ ẩm, độ đàn hồi… Astaxanthin có thể bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím bằng cách vô hiệu hóa hoặc phá hủy các gốc tự do được hình thành do tia cực tím và ngăn chặn những tác hại như cháy nắng hoặc viêm da Chúng còn có chức năng bảo vệ chống tác hại của tia tử ngoại (Rao và cs, 2013) Một đặc điểm đặc biệt quan trọng của astaxanthin là chúng không có hoạt tính của một tiền vitamin A Vì vậy, trong các cơ thể đã không xảy ra nguy cơ ngộ độc cấp tính do có sự tích lũy quá nhiều astaxanthin Kết quả thực nghiệm trên chuột đã cho thấy không có một tác dụng nguy hại nào khi sử dụng liều astaxanthin 400 mg/kg trong 41 ngày (Nishikawa và cs, 2005)

Astaxanthin tách chiết từ tảo H pluvialis đã được chứng minh là an toàn,

không có tác dụng phụ và được sử dụng rộng rãi trong hơn 15 năm như là một thực phẩm chức năng (Rao và cs, 2013, Yuan và cs, 2011; Yang và cs, 2013 ) Đối với người, liều dùng an toàn có thể đạt đến 14,4 mg astaxanthin/ngày trong vòng 2 tuần (Miki và cs, 1998)

1.1.8.3 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi gia cầm

Astaxanthin đã được dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi gia súc, gia cầm, làm tăng màu vàng cam cho lòng đỏ trứng, tăng tỷ lệ nở con, giảm khả

năng nhiễm khuẩn Salmonella (Lorenz & Cysewski, 2000) Khi bổ sung astaxanthin

tự nhiên từ tảo H pluvialis vào thức ăn của gà đã cho thấy màu sắc của lòng đỏ

trứng gà được tăng cường, tăng khả năng sinh sản ở gà mái, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và giảm tỷ lệ tử vong (Lignell & Inborr, 2000)

Để sản xuất astaxanthin từ tự nhiên hiệu quả thì cần phải tìm được các chủng

tiềm năng để khai thác Vi tảo lục H pluvialis đã được chứng minh là nguồn sản

xuất astaxanthin tự nhiên hiệu quả nhất Chính vì vậy, ở phần tiếp theo, chúng tôi trình bày khái quát về đặc điểm sinh học, công nghệ nuôi trồng cũng như những tiềm năng và thách thức khi nuôi trồng loài tảo này ở qui mô lớn

1.2 Giới thiệu chung về chi vi tảo lục Haematococcus

1.2.1 Vị trí phân loại và phân bố

Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau: H pluvialis nằm trong ngành Tảo lục (Chlorophyta), lớp Chlorophyceae, bộ Volvocales, họ Haematococcaceae, chi Haematococcus (Bold & Wynne, 1985)

Tảo H pluvialis được phân bố rộng rãi trong nhiều môi trường sống trên

toàn thế giới Tảo này được tìm thấy ở các vùng ôn đới trên thế giới và đã được phân lập từ châu Âu, châu Phi, Bắc Mỹ và Himachal Pradeslv Ấn Độ (Suseela và Toppo, 2006) Nhiều công trình công bố đã cho thấy tảo này có thể sinh sống trong những điều kiện môi trường và khí hậu đa dạng như vũng nước lợ trên những tảng

đá trên bờ biển (Chekanov và cs, 2014); lưu vực nước ngọt trong đá đầy tuyết tan chảy trên đảo Blomstrandhalvøya; Na Uy (Klochkova và cs, 2013); đài phun nước khô gần Rozhen, Blagoevgrad ở Bulgaria (Gacheva và cs, 2015); ao cá nước ngọt ở Bihor, Romania (Dragos và cs, 2010); bề mặt tầng thượng của một tòa nhà của KIOST tại Seoul, Hàn Quốc (Kim và cs, 2015) Với khả năng chống chịu tốt ở điều kiện sống bất lợi, thích nghi được với điều kiện môi trường thay đổi đột ngột bằng cách hình thành màng dày bao bọc xung quanh tế bào (tế bào dạng cyst) và có khả năng nảy mầm trở lại khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi, do đó, chúng nhanh chóng trở thành loài chiếm ưu thế (Proctor, 1957)

1.2.2 Các loài Haematococcus

Có 15 loài Haematococcus đã được báo cáo, cụ thể là: H pluvialis, H allmani, H buetschlii, H capensis, H carocellus, H droebakensis var, H droebakensis, H grevillei, H insignis, H lacustris, H murorum, H salinus, H sanguineus, H thermalis, H zimbabwiensis Tuy nhiên, chỉ có 7 loài H pluvialis,

H buetschlii, H capensis, H carocellus, H droebakensis, H thermalis, H zimbabwiensis là được chấp nhận trong hệ thống phân loại hiện nay Trong đó, 5 loài H pluvialis, H buetschlii, H capensis, H droebakensis và H zimbabwiensis

đã được tìm thấy trong môi trường nước ngọt Trong các loài trên, vi tảo H pluvialis

là nguồn tiềm năng để sản xuất astaxanthin tự nhiên, với hàm lượng tích lũy trong tế bào

cao, chiếm khoảng 2 - 7% SKK (Lorenz & Cysewski, 2000)

1.2.3 Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái

H pluvialis là vi tảo lục nước ngọt, đơn bào, có hai roi và có khả năng

chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi tế bào Tế

bào của tảo H pluvialis có hai dạng: Tế bào sinh dưỡng và nang bào tử (Cyst)

(Hình 1.5) Trong đó:

ü Tế bào sinh dưỡng: Là các tế bào có màu lục, hình elip với đường kính khoảng 10-20 µm Tế bào được bao quanh bởi thành tế bào và có thể di động nhờ hai roi Dưới điều kiện thuận lợi, phần lớn tế bào ở dạng sinh dưỡng, các tế bào này

có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoid, đặc biệt là β-carotene và lutein

cao

ü Nang bào tử (cyst): khi điều kiện sống không thuận lợi (stress) như thiếu dinh dưỡng (thiếu nitơ, photpho, …), cường độ ánh sáng cao… tế bào sẽ chuyển sang dạng nang bào tử, có hình cầu Chúng mất đi roi và không còn khả năng di động, thành tế bào dầy lên Đường kính của tế bào tăng lên đột ngột từ 10-20 µm

lên 40-50 µm Các tế bào cyst trưởng thành chứa astaxanthin chiếm khoảng 5%

SKK (Lorenz & Cysewski, 2000)

Vòng đời của tảo H pluvialis

Hình 1.5 Hình thái tế bào tảo H pluvialis

(A: Tế bào sinh dưỡng, B: Tế bào cyst) (Nguồn: Lorenz & Cysewski, 2000)

Vòng đời và sự phân chia tế bào của tảo H.pluvialis cũng đã được Kobayashi

(ii) Giai đoạn tạo bào nang non (encyst): Ở giai đoạn này, các tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng tế bào nang non có màu nâu, hình cầu, mất roi Trong suốt giai đoạn nang bào, hàm lượng chlorophyll và protein giảm đi, trong khi mức độ sinh tổng hợp carotenoid và protein tăng lên (Hagen và cs, 2002)

(iii) Giai đoạn tế bào cyst hoàn chỉnh: Ở giai đoạn này, tế bào cyst đã hoàn chỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao nhất Trong suốt giai đoạn chín

này, quá trình tổng hợp carotenoid, chlorophyll và protein chậm lại

Hình 1.6 Sự thay đổi hình thái tế bào (A) và sự phân bào (B) trong

vòng đời của tảo H pluvialis

(Nguồn: Kobayashi và cs, 1992; Shah và cs, 2016)

(iv) Giai đoạn nảy mầm: Ở giai đoạn này xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và

protein, xuất hiện sự phân giải carotenoid Có 2 cách thức nảy mầm ở vi tảo H pluvialis đã được quan sát: (1) nảy mầm trực tiếp từ một nang bào tử hình cầu,

không di động thành 1 tế bào sinh dưỡng hình elip, có 2 roi; (2) nảy mầm gián tiếp thông qua pamella (cụm tế bào được bao bọc bởi một lớp màng) Khi đó màng bao bọc pamella bị vỡ, từ một tế bào nang tạo ra 8 tế bào sinh dưỡng Tỷ lệ về hàm lượng carotenoid/chlorophyll là một thông số quan trọng cho phép phân biệt 4 giai

đoạn khác nhau của tế bào H pluvialis Tỷ lệ này vào khoảng 0,5; 1,0 và 7,0 tương

ứng các tế bào sinh dưỡng (màu lục), các tế bào cyst còn non (màu nâu), và tế bào

cyst hoàn chỉnh (tế bào chín, màu đỏ) (Kobayashi và cs, 1997)

1.2.4 Thành phần sinh hóa học của tảo H pluvialis

Do tảo H pluvialis có chu kỳ sống phức tạp, vòng đời của tảo có sự xen kẽ

giữa tế bào sinh dưỡng màu xanh với tế bào cyst màu đỏ nên thành phần dinh dưỡng của tế bào tảo này thay đổi rất khác nhau giữa 2 giai đoạn sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy (Bảng 1.3)

Tảo H pluvialis ở giai đoạn sinh dưỡng có hàm lượng protein rất cao, dao

động từ 29 - 45% SKK, hàm lượng này giảm xuống 17 - 25% khi tảo chuyển trạng thái tế bào sang giai đoạn cyst (Kim và cs, 2015) Thành phần axít amin của protein trong SKK giai đoạn màu đỏ chủ yếu gồm axít aspartic, glutamic, alanin và leucine với hàm lượng khoảng 10,2 mg/100 mg axít amin tổng số, trong đó có 46,0% axít amin thuộc các axít amin thiết yếu

Hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 15 - 17% SKK ở giai đoạn sinh dưỡng và tăng lên 36 - 40% khi tảo ở giai đoạn cyst Tương tự, hàm lượng lipít cũng có xu hướng tăng ở giai đoạn cyst (chiếm 32 - 37% SKK), hàm lượng này cao gấp 1,5 lần so với hàm lượng lipít ở giai đoạn sinh dưỡng Thành phần axít béo tổng

số của H pluvialis tương đối phức tạp; chủ yếu là các axít béo mạch dài nhỏ hơn 18

nguyên tử carbon như palmitic (16: 0), linoleic (18: 2), và linolenic (18: 3) Hàm lượng các axít béo của tảo này thay đổi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, chất lượng dinh dưỡng, các điều kiện gây căng thẳng…Hàm lượng lipít của tảo này tăng

mạnh khi nuôi cấy trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng cho thấy tiềm năng sản xuất

dầu diesel sinh học từ vi tảo này (Saha và cs, 2013) Sự tích lũy astaxanthin ở tảo H pluvialis là một phản ứng của tế bào chống lại các điều kiện bất lợi, giúp tế bào tồn

tại Đồng thời với quá trình tích lũy astaxanthin là quá trình sinh tổng hợp của triacylglycerol (TAG) (Zhekisheva và cs, 2005; Cerón và cs, 2007) và giảm hoạt động của quang hệ II của quang hợp (photosystem II - PSII), mất cytochrom f, giảm tốc độ vận chuyển điện tử trong mạch vận chuyển điện tử quang hợp và tăng cường

hô hấp (Boussiba, 2000) Astaxanthin được tích lũy trong các giọt lipít ở tế bào chất (Lipid droplet - LD) (Aflalo và cs, 2007)

Thành phần carotenoid của các tế bào sinh dưỡng bao gồm chủ yếu là lutein (75 - 80%), β - carotene (10 - 20%) và những sắc tố khác (bao gồm chlorophyll a và

b, violaxanthin, neoxanthin, lactucaxanthin và zeaxanthin (Harker và cs, 1996) Trong giai đoạn đỏ, hàm lượng carotenoid tổng số tăng mạnh, trong đó sắc tố astaxanthin chiếm chủ yếu (80 - 99% carotenoid tổng số) (Dragos và cs, 2010) Tỷ

lệ carotenoid /chlorophyll đạt giá trị 0,2 trong giai đoạn sinh dưỡng Giá trị này tăng lên 2- 9 khi tảo chuyển sang giai đoạn tế bào cyst (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của tảo H pluvialis ở 2 giai đoạn sinh trưởng khác nhau

STT Hàm lượng các thành phần

(% SKK)

Giai đoạn sinh trưởng

Lipít trung tính (% lipít tổng số) 59 51,9-53,5

Photpho lipít (% lipít tổng số) 23,7 20,6-21,1

10 Chlorophyll 1,2-2 0

Ghi chú: n.d: không xác định (Nguồn: Shah và cs, 2016; Lorenz, 1999)

1.2.5 Quy trình sản xuất astaxanthin ở H pluvialis

Có 2 quy trình nuôi cấy thường được áp dụng để sản xuất sinh khối vi tảo H pluvialis giàu astxanthin là quy trình nuôi cấy một hoặc hai pha

1.2.5.1 Quy trình nuôi cấy một pha

Quy trình công nghệ nuôi cấy một pha gồm một giai đoạn nuôi cấy duy nhất Trong đó, quá trình sinh trưởng của tế bào diễn ra đồng thời với quá trình tích lũy astaxanthin trong cùng một hệ thống nuôi Cần kiểm soát tốt điều kiện nuôi cấy và nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường để duy trì sự tồn tại của cả tế bào sinh dưỡng và tế bào cyst trong cùng một hệ thống nuôi (Del Río và cs, 2008; García-Malea và cs, 2009) Tuy nhiên, MĐTB và hàm lượng astaxanthin của tảo tích lũy được bằng phương pháp này rất thấp (Olaizola, 2000)

1.2.5.2 Quy trình nuôi cấy hai pha

Quy trình công nghệ nuôi cấy hai pha đã được chứng minh là hiệu quả để sản

xuất thương mại astaxanthin từ tảo H pluvialis (Aflalo và cs, 2007) Quy trình này

gồm hai giai đoạn nuôi cấy khác nhau: (i) Giai đoạn tăng sinh khối tế bào (Pha

1-Giai đoạn xanh - Green Stage): H pluvialis được nuôi trồng dưới điều kiện hoàn toàn tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển nhằm mục đích tăng tối đa số lượng tế bào; (ii) Giai đoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin (Pha 2- Giai đoạn đỏ - Cyst stage): sự

tổng hợp astaxanthin được cảm ứng bằng cách thay đổi điều kiện môi trường theo hướng bất lợi (stress) Các yếu tố bất lợi như cường độ ánh sáng cao, ánh sáng kết hợp với thiếu hụt nitơ; acetate dư thừa, sốc muối hoặc bổ sung các chất ức chế phân

chia tế bào…đã được sử dụng để tăng cường tích lũy astaxanthin ở sinh khối tảo H pluvialis Lựa chọn được các tác nhân cảm ứng cũng sẽ quyết định đến hàm lượng và

sản lượng astaxanthin tổng số thu được (Li và cs, 2010; Choi và cs, 2011)

1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất astaxanthin từ H pluvialis

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi tảo lục H pluvialis trong giai đoạn

xanh và cảm ứng tích lũy astaxanthin trong giai đoạn đỏ được liệt kê chi tiết ở Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy astaxanthin ở vi

tảo lục H pluvialis

Giai đoạn xanh Giai đoạn đỏ

1 Nguồn N Muối nitrate; 2,5

-10 mM Thiếu hụt nitơ Shah và cs, 2016

photpho Borowitzka và cs, 1991

4 Nhiệt độ 15 - 27 o C 25 - 35 o C

Yoo và cs, 2012; Wan và cs, 2014a,b; Hata, 2001

5 Ánh sáng 1,1 - 2 klux 10 - 36 klux

Park và cs, 2014; Zhang và cs, 2014; Saha và cs, 2013

6 pH 6,5 – 8 7 Hata và cs, 2001

7 Sốc muối Không 0,2% NaCl Sarada và cs, 2002

8 Sắt (Fe) Fe

3+ - EDTA, 18 µmol/L

Fe2+ (0,45mM) + natri axetat

Kobayashi và cs, 1997; Cai và cs, 2009

Các thông số chỉ ra trên Bảng 1.5 đã cho thấy điều kiện thích hợp cho sinh

trưởng và tích lũy astaxanthin ở vi tảo lục H pluvialis là khác nhau Chính vì vậy,

để sản xuất astaxanthin hiệu quả thì quy trình nuôi cấy 2 pha thường được áp dụng

1.3 Tình hình nghiên cứu và công nghệ nuôi trồng tảo H pluvialis cho sản xuất

astaxanthin

H pluvialis là loài vi tảo có khả năng sinh trưởng quang tự dưỡng, dị dưỡng

và tạp dưỡng trong các hệ thống nuôi hở ngoài trời, các hệ thống nuôi kín (Closed photobioreactor) với chế độ nuôi theo mẻ, nuôi fed batch và nuôi liên tục (Shah và

cs, 2016) (Bảng 1.5)

Nuôi cấy tạp dưỡng và quang dị dưỡng ít có tiềm năng thương mại do nó có chi phí sản xuất cao (Mata và cs, 2010) Hệ thống nuôi cấy dị dưỡng có nhiều ưu điểm, giúp tảo tăng trưởng tốt với MĐTB cao Tuy nhiên chúng có hai hạn chế lớn là

rất dễ bị nhiễm trong sản xuất qui mô lớn (Olguin và cs, 2012) và chi phí cho nguồn carbon hữu cơ cao (Chen và cs, 2011) Mặc dù năng suất sinh khối tảo là thấp nhất so

nâng cấp qui mô thấp và ít bị nhiễm trong quá trình nuôi thì hệ thống nuôi cấy quang

tự dưỡng vẫn là lựa chọn thích hợp cho sản xuất tảo ở qui mô lớn (Mata và cs, 2010)

Bảng 1.5 So sánh một số thông số ở các kiểu nuôi trồng tảo khác nhau

Năng suất sinh khối

Hệ thống nuôi Ưu điểm

Nhược điểm

MĐTB thấp; giới hạn diện tích

Năng suất sinh khối cao, sử dụng

nước thải

Nhiễm tạp; giá

cơ chất cao

Nhiễm tạp, chi phí vận hành cao

vận hành cao

(Nguồn: Panis, 2015)

1.3.1 Nuôi cấy quang tự dưỡng

Nuôi cấy quang tự dưỡng tảo H pluvialis thực hiện chủ yếu trong các hệ

thông nuôi hở (HTNH) hoặc trong hệ thống nuôi kín (HTNK) (hệ thống có sục khí (bubble column), hệ thống nuôi cuộn khí (airlift) (Hình 1.7 và 1.8)

Theo công bố của Tocquin và cộng sự (2011), MĐTB tảo H pluvialis đạt giá

trường này, tảo H pluvialis đã duy trì trạng thái sinh dưỡng trong một thời gian dài

+/ Nuôi cấy vi tảo lục H pluvialis trong hệ thống bể hở

Sản xuất sinh khối tảo có thể thực hiện trong các hệ thống nuôi ngoài trời trong các hệ thống bể dài (Raceways), hệ thống bể nông (shallow ponds), hệ thống

bể nghiêng (cascade) Đây là hệ thống nuôi quy mô lớn với dạng bể nuôi tròn hoặc dài Dịch tảo được khuấy bằng thiết bị guồng Chiều sâu cột nước khoảng 20 - 50

cm Hệ thống này được thiết kế để thu nhận ánh sáng tối ưu và có chi phí xây dựng thấp nhất Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công ty ứng dụng thành công công nghệ

nuôi trồng loài tảo này như tập đoàn Cyanotech (Hawaii, Mỹ) đã nuôi H pluvialis

trong các hồ hở với thể tích lên tới 500.000 L và hàm lượng astaxanthin đạt được 1,5

- 3,0% SKK (Lorenz & Cysewki, 2000) Tuy nhiên, MĐTB đạt cao nhất trong các bể nuôi hở mới chỉ đạt từ 0,3 – 0,6 x 106 TB/mL

+/ Nuôi cấy vi tảo lục H pluvialis trong hệ thống nuôi kín

Nuôi trồng quang tự dưỡng loài H pluvialis trong các hệ thống nuôi kín có

thể được thực hiện theo kiểu nuôi theo mẻ (Batch), nuôi liên tục, nuôi fed-batch và nuôi kiểu “perfusion” Mỗi phương pháp nuôi có những ưu, nhược điểm riêng ü Nuôi theo mẻ (Batch): là kỹ thuật phổ biến để tăng số lượng tế bào, đặc biệt được áp dụng ở qui mô phòng thí nghiệm Choi và cộng sự (2003) đã công bố nuôi vi

tảo lục H pluvialis trong ống sục khí (bubble column) 2 L theo kiểu nuôi theo mẻ

MĐTB lớn nhất thu được trong điều kiện nuôi chiếu sáng với cường độ 1,5 klux là 5,2

0,23 /ngày

Hình 1.7 Nuôi tảo H pluvialis trong bể hở

(Nguồn: http://www.slideshare.net/Priyakapriya/biodiesel-from-microalgae-production-methods-a-review)

Khi nghiên cứu sinh trưởng của loài vi tảo này trong hệ thống photobioreactor dạng ống và dạng trụ đứng có cùng dung tích 55 L ở điều kiện ngoài trời sau 16 ngày nuôi, loài vi tảo này sinh trưởng trong hệ thống dạng ống tốt hơn ở hệ thống trụ đứng với khối lượng sinh khối tương ứng là 7,0 g/L và 1,4 g/L và hàm lượng carotenoid tương ứng là 2,0 và 0,5% SKK (Lopez và cs, 2006)

Năm 2011, Issarapayup và cộng sự đã công bố các điều kiện nuôi trồng tối ưu

tảo H pluvialis trong hệ thống kín dạng phiến phẳng có tốc độ sinh trưởng đặc

nuôi dạng này ở quy mô 17 - 200 L, tốc độ sinh trưởng đặc trưng đạt 0,45 - 0,53/

Tuy nhiên, MĐTB ở các hệ thống kín dạng ống với quy mô nhỏ hơn thường có MĐTB cao hơn và duy trì trạng thái sinh dưỡng tốt hơn các hệ thống có quy mô lớn Ở

Nhưng đối với hệ thống dạng này khi nâng quy mô lên 55 L, sinh khối đạt được thấp

D

Hình 1.8 Các dạng HTNK nuôi tảo H pluvialis

(A: Dạng ống (Tubular photobiorector); B: Dạng bán cầu; C: Dạng vành khuyên (Annular reactor); D: Dạng tấm phẳng (Flat plate reactor); E và F: Dạng cột thẳng đứng (Vertical column reactor))

(Nguồn: https://www.google.com.vn/search?q=photobioreactor for haematococcus)

hơn 5 lần so với hệ thống dạng ống tròn có cùng dung tích và điều kiện nuôi (Lopez và

Quá trình nuôi liên tục được áp dụng thành công trong nuôi tảo H pluvialis Olaizola

(2000) đã công bố kết quả của 9 tháng vận hành hệ thống kín nuôi loài vi tảo này có tên

là Aquasearch Growth Module (AGM) dung tích 25 000 L, có sử dụng hệ thống máy tính để điều khiển các quá trình, diện tích bề mặt là 100 m2, sử dụng ánh sáng tự nhiên

Hệ thống AGM được cấu tạo từ hệ thống ống lắp song song, đường kính 18 - 41 cm, nhiệt độ dao động 20 - 25oC, năng suất sinh khối 50 - 90 g/m2 (0,2 - 0,36 g/L; 4 - 19 g/m2/ngày)

Gần đây, Li và cộng sự (2011) cũng đã đánh giá hiệu quả kinh tế của việc sản xuất

astaxanthin bằng nuôi trồng Haematococcus ở quy mô lớn tại Trung Quốc với mô hình

nuôi trồng hai giai đoạn Trong đó, giai đoạn đầu nuôi theo kiểu bán liên tục trong hệ

quá trình chuyển giai đoạn Nguồn giống ban đầu được nuôi trong hệ thống photobioreactor kín 20 L, chuyển dần lên hệ thống 1000 và 8000 L MĐTB trong

TB/mL Với mô hình này, giá thành của SKK và astaxanthin đã giảm đáng kể

ü Nuôi theo kiểu “fed-batch”: Về bản chất đây là phương pháp nuôi theo mẻ có

bổ sung các chất dinh dưỡng (liên tục hoặc không liên tục) trong quá trình nuôi Kiểu

nuôi này đã được áp dụng để nuôi trồng tảo H pluvialis Trong hệ thống kín dạng cột

theo kiểu fed - batch làm tăng MĐTB lên trên 3,5 x 106 TB/mL sau 200 giờ nuôi

Trong khoảng thời gian này, tế bào tảo H pluvialis vẫn duy trì trạng thái sinh dưỡng

với 2 roi, màu xanh, không có sự thay đổi hình thái sang tế bào nang Sau khi đạt được

số lượng tế bào cao, sự giảm đột ngột nồng độ nitrate xuống dưới ngưỡng 4 mM và

cường độ ánh sáng cao tăng cường mạnh sự tích lũy astaxanthin để đạt hàm lượng trong khoảng 320 - 390 mg/L Sự tổ hợp của phương pháp bổ sung dinh dưỡng theo kiểu fed- batch và pha loãng dịch nuôi để làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng là phương pháp đầy hứa hẹn để đạt được MĐTB cao và hàm lượng astaxanthin cao trong bể phản ứng quang sinh cột bọt khí (Ranjbar và cs, 2008a)

ü Phương pháp nuôi thay môi trường mới “perfusion”: Park và cộng sự (2014)

đã thiết lập một hệ thống nuôi hai pha kiểu “nuôi thay môi trường mới” - “perfusion

culture” kết hợp chế độ chiếu ánh sáng từng bước để sản xuất astaxanthin từ tảo H

pluvialis (Hình 1.9)

Phương pháp này dựa trên nguyên lý môi trường sinh trưởng được thay thế lặp

đi lặp lại Dịch tảo trong hệ thống nuôi được lấy ra, lọc loại bỏ môi trường cũ, giữ lại tế bào và bổ sung môi trường nuôi mới Các tế bào này có thể sinh trưởng tốt nhờ sử dụng môi trường nuôi mới - không chứa các chất chuyển hóa ức chế Nuôi theo kiểu thay thế môi trường mới tạo ra năng suất sinh khối cao 0,18 g/L/ngày với chế độ từng bước tăng cường độ chiếu sáng (7,5 - 22,5 klux), MĐTB đạt cực đại là 12,3 g/L cao gấp 3,09 và 1,67 lần so với phương pháp nuôi liên tục và phương pháp nuôi fed - batch Nồng độ

astaxanthin đạt giá trị cao nhất là 602 mg/L

Như vậy, MĐTB của loài vi tảo lục H pluvialis trong các hệ thống nuôi kín có

thể tích khác nhau có sự sai khác lớn Ở các hệ thống nuôi kín có dung tích 1- 2 L,

Hình 1.9 Phương pháp nuôi tảo H pluvialis theo kiểu “Perfusion”

(Nguồn: Park và cs., 2014)

MĐTB có thể đạt 7 x 10 TB/mL Tuy nhiên, khi tăng thể tích nuôi lên 800 – 25000 L,

tích lũy đạt cao nhất là 602 mg/L và 7% SKK

1.3.2 Nuôi cấy dị dưỡng và tạp dưỡng

Chiếu ánh sáng cao thường được sử dụng để tăng cường tích lũy astaxanthin ở

tảo H pluvialis Tuy nhiên, sự hấp thụ ánh sáng và tán xạ ánh sáng gây ra bởi bóng của

các tế bào với nhau trong nuôi trồng qui mô lớn có ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sinh khối và các sản phẩm từ tảo Chi phí cao cho chiếu sáng là một

trở ngại lớn cho việc thương mại hóa các sản phẩm từ tảo H pluvialis Nuôi cấy dị

dưỡng có thể áp dụng để khắc phục nhược điểm này Dưới điều kiện nuôi dị dưỡng, ánh sáng không cần thiết, các chất hữu cơ có vai trò như nguồn carbon và năng lượng cho sự tăng trưởng và tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của tảo Các nguồn carbon

hữu cơ như acetate đã được sử dụng để nuôi dị dưỡng tảo Haematococcus cho sản xuất

astaxanthin (Hata và cs, 2001; Kang và cs, 2005) Wan và cộng sự (2015) báo cáo đã

nuôi thành công vi tảo lục H pluvialis trong hệ thống lên men 50 L với acetate là

nguồn carbon với chế độ nuôi cấy tuần tự dị dưỡng - quang tự dưỡng Với kiểu nuôi này, SKK đạt 26 g/L, MĐTB đạt 7 x 106 TB/mL và năng suất sinh khối đạt 64,1 mg/L/giờ sau 405 giờ lên men Pang và cộng sự (2017) cũng báo cáo về hiệu quả sử

dụng carbon hữu cơ (C5) – ribose để làm tăng MĐTB tảo H pluvialis thông qua cơ chế

duy trì trạng thái sinh dưỡng của tảo trong điều kiện nuôi tạp dưỡng

Tổng hợp về MĐTB, năng suất sinh khối; năng suất và hàm lượng

astaxanthin tích lũy từ loài vi tảo lục H pluvialis ở các cấp độ nuôi khác nhau được

trình bày ở Bảng 1.6