Cơng nghệ enzyme CƠNG NGHỆ ENZYME ENZYME TECHNOLOGY http://www.touregypt.net/featurestories/bread.htm 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Cơng nghệ enzyme Nguyễn Hữu Trí Cơng nghệ enzyme • Do có cấu hình gấp cuộn phức tạp nên enzyme xúc tác phổ hẹp chất, giới hạn chất nhiệt độ • Trong ứng dụng cơng nghiệp, tạo sản phẩm có chất lượng cao, sản phẩm phụ, dễ tinh sạch,… • Enzyme khơng độc có khả bị phân giải (thân thiện mơi trường) • Có thể tạo lượng lớn nhờ vi sinh vật • Tham gia giải vấn đề xã hội đại: sản xuất lượng thực, thiếu hụt bảo tồn lượng, cải thiện mơi trường, với ứng dụng y học 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Vai trò xúc tác enzyme • Sản xuất sử dụng enzyme lĩnh vực thành cơng CNSH gia tăng 12% năm suốt 10 năm qua • Có 400 cơng ty khắp giới sản xuất enzyme, châu âu chiếm đa số (60%) 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Cơng nghệ enzyme • “Without enzymes there can be no life” • Enzyme: phức hợp protein hình cầu, tế bào sống, thực xúc tác sinh hóa chuyển đổi chất cách nhanh chóng • Cơng nghệ Enzyme : sản xuất enzyme cho mục đích cơng nghiệp chế biến thực phẩm, y học, phục hồi sinh học (bioremediation),… 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí • Năng lượng hoạt hóa tức mức lượng chất tham gia phản ứng phải đạt • Chất có tác dụng thúc đẩy tốc độ phản ứng hóa học đựơc gọi chất xúc tác • Enzyme khơng làm lệch vị trí cân mà làm phản ứng chóng đạt trạng thái cân 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Vai trò xúc tác enzyme Phản ứng Saccharose + H2O glucose + fructose (calo/mol) H2O2 H2O + 1/2O2 (calo/mol) Khơng xúc tác 32.000 18.000 Xúc tác vơ (H+) 25.000 (Pt) 11.700 Enzyme (saccharase) 9.400 (catalase) 5.500 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Phân loại enzyme theo cấu tạo Apoenzym hay apoprotein: có protein thành phần cấu tạo Coenzym: enzym có protein kết hợp với phân tử kim loại tạo thành phức hữu – kim loại Các đồng yếu tố gọi nhóm ngoại prosthetic Còn phức chất chứa hai yếu tố gọi enzym hồn chỉnh – holoenzym 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế phân loại enzyme Phân loại: • Oxidoreductase: xúc tác phản ứng oxi hóa khử, chuyển electron, H, O • Transferase: xúc tác phản ứng chuyển nhóm chức từ chất cho sang chất nhận • Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân (Hydrolysis reaction) 29/09/2011 11:21 SA 11 Nguyễn Hữu Trí Vai trò xúc tác enzyme Đặc điểm Chất xúc tác vơ Bản chất hóa học Phân tử nhỏ gồm vài Đại phân tử protein ngun tố (Pt, HCl…) Chất xúc tác hữu Tăng tốc độ phản 102 – 106 lần ứng 106 – 1011 lần Cao ( 1000c) Acid kiềm mạnh Cao (vài atm) Thấp (36 – 450c) pH sinh lý Ap suất khí (1 atm) Nhiệt độ thích hợp Cao ( 1000c) Thấp (36 – 450c) pH thích hợp Acid kiềm mạnh pH sinh lý Các điều kiện: 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế phân loại enzyme • Danh pháp: • Tên thơng thường: trypsin, pepsin, renin… • Tên hệ thống: tên chất - tên kiểu phản ứng Pyruvate – decarboxylase enzyme khử CO2 acid pyruvic Glucophosphate – isomerase enzyme giúp chuyển gốc phosphate glucose 29/09/2011 11:21 SA 10 Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế phân loại enzyme • Lyase: xúc tác phản ứng cắt liên kết hóa học (chemical bonds) • Isomerase: xúc tác phản ứng chuyển hóa chất thành dạng đồng phân (isomer) • Ligase: xúc tác phản ứng liên kết nguyên tử (C-O, C-S, CN, C-C, phosphoric ester, C-kim loại) 29/09/2011 11:21 SA 12 Nguyễn Hữu Trí STT Nhóm enzyme Oxidoreductase Transferase Hydrolase Lyase Isomerase Ligase 29/09/2011 11:21 SA Phản ứng xúc tác Chuyển e- , H+ ngun tử H) Phản ứng chuyển nhóm chức A- + B A + BA-B + C A + B - C Phản ứng phân ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhóm chức cho phân tử nước) : A-B + H2O A-H + B-OH Phản ứng chuyển hóa nhờ bổ sung nhóm chức vào liên kết đơi tạo liên kết đơi nhờ lấy nhóm chức (phân giải khơng có nước tham gia) XY A-B A=B + X-Y Chuyển nhóm chức phân tử tạo dạng đồng phân XY YX A-B A-B Tổng hợp liên kết C-C, C-S, C-O C-N nhờ phản ứng trùng ngưng liên hợp13với thủy giải ATP Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế phân loại enzyme Danh pháp quốc tế phân loại enzyme 29/09/2011 11:21 SA 14 Nguyễn Hữu Trí Cường lực xúc tác lớn gam Rennine gây đơng tụ 7,2 sữa giây ≈ 5.4 GIỜ GIỜ Catalase Fe3+ 105 H2O2 105 H2O + 5.104 O2 29/09/2011 11:21 SA 15 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Tính đặc hiệu enzyme 17 Nguyễn Hữu Trí Đặc hiệu phản ứng • Oxy hố nhờ oxydase: RCHCOOH + 1/2O2 RCOCOOH + NH3 NH2 • Khử carboxyl nhờ decarboxylase: RCHCOOH RCH2NH2 + CO2 NH2 • Đặc hiệu phản ứng • Đặc hiệu chất – Đặc hiệu tuyệt đối – Đặc hiệu tương đối – Đặc hiệu nhóm – Đặc hiệu đồng phân quang học 29/09/2011 11:21 SA 16 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 18 Nguyễn Hữu Trí Đặc hiệu tương đối Đặc hiệu tuyệt đối Urease Urea NH2-CO-NH2 CO2 + H2O Acetamide Urease NH2-CO-CH3 H2O 2NH3 Khơng xả xảy 19 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí CH2 – O – CO - R1 CH – O – CO - R2 CH2 – O – CO - R1 R – C – N – CH O H COOH 21 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí R’ COOH Fumarathydratase HO–CH CH–COOH + H 2O CH2-COOH HOOC-CH L – malic Acid fumaric Nguyễn Hữu Trí O O N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C R H R’ Specificity Catalytic Site Site Active Site 23 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Specificity of Ser-Protease Family Trypsin cut at Lys, Arg O O –C–N–C–C–N– C C C C NH3 + COOC Asp Deep and negatively charged pocket OC Ser 22 29/09/2011 11:21 SA Chymotrypsin Has A Site for Specificity 29/09/2011 11:21 SA 20 29/09/2011 11:21 SA R – C - N – CH O H CH2 COOH H2O CH2 CH2 – O – H HOOC – R1 CH – O – H + HOOC – R2 CH2 – O – H HOOC – R3 Đặc hiệu đồng phân quang học R’ R’ Carboxyl peptidase R – C – N – CH R – C – OH + NH2–CH H2O O H COOH COOH O Carboxyl peptidase HO - H Enzym có khả tác dụng lên kiểu nối hố học định phân tử chất mà khơng phụ thuộc vào cấu tạo phần tham gia tạo thành kiểu liên kết Đặc hiệu nhóm R’ LIPASE 29/09/2011 11:21 SA Chymotrypsin Elastase cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly O O –C–N–C–C–N– C O O –C–N–C–C–N– CH3 Shallow and non-polar pocket Non-polar pocket 24 Active Site Nguyễn Hữu Trí Enzyme Lịch sử phát triển enzyme • Cơng nghiệp tổng hợp enzyme cần thiết cho ngành cơng nghệ thực phẩm nước giải khát Enzymes sử dụng phân tích y học cơng nghiệp ngày chúng thêm vào bột giặt (cellulase, protease, lipase) • Enzyme tổng hợp thực vật, động vật, vi sinh vật ni cấy mơ động ,thực vật • Các enzyme động thực vật tổng hợp nhờ q trình lên men vi sinh vật Hầu hết enzyme tổng hợp tropophase amylases (bởi Bacillus stearothermophilus) tổng hợp idiophase, chất biến dưỡng thứ cấp 29/09/2011 11:21 SA 25 Nguyễn Hữu Trí Lịch sử phát triển enzyme • 1897, Eduard Buchner phát hiên khả lên men dịch chiết nấm men 1907, ơng nhận nobel prize cho phát minh “cell free fermentation” • 1926, James B Sumner kết tinh enzyme urease 1937 cho enzyme catalase • 1930, Northrop Staley kết tinh enzyem pepsin • Thế chiến thứ 2, sản xuất kháng sinh theo qui mơ cơng nghiệp 29/09/2011 11:21 SA 27 Nguyễn Hữu Trí • Cuối kỷ 18 đầu kỷ 19, phân giải chất nhờ enzyme ghi nhận chế chưa biết • Thế kỷ 19, Louis Pasteur phát chất có khả xúc tác q trình lên men chuyển hóa đường thành rượu gọi ferment có tế bào nấm men • 1877, Wilhelm Kuhne, sinh lý học người Đức dùng thuật ngữ enzyme • Thế chiến thứ 1, Weitzman sản xuất aceton Anh 29/09/2011 11:21 SA 26 Nguyễn Hữu Trí Lịch sử phát triển enzyme • Lysozyme enzyme xác đònh cấu trúc năm 1965 • 1969, xây dựng qui trình công nghiệp sản xuất amino acid sử dụng enzyme • 1972, Boyer et al áp dụng kỹ thuật di truyền công nghệ enzyme • 1973, sản xuất aspartic acid lên men cố đònh tế bào • 1984 đến nay, phát hàng trăm loại enzyme khác ứng dụng rộng rãi 29/09/2011 11:21 SA 28 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc lysozyme Cơng nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật 29/09/2011 11:21 SA 29 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 30 Nguyễn Hữu Trí Sinh vật hệ thống mở chế tạo enzyme • Sinh vật xem hệ thống mở liện quan mật thiết đến q trình trao đổi chất tế bào mơi trường bên ngồi • Q trình đường chuyển hố đóng vai trò quan trọng chu trình chuyển hố chất tự nhiên • Các phản ứng ngồi tế bào chu trình chuyển hóa xúc tác chất xúc tác sinh học có chất protein, gọi enzyme • Tuỳ theo nơi xúc tác ngồi tế bào: enzyme nội bào enzyme ngoại bào 29/09/2011 11:21 SA 31 Nguyễn Hữu Trí Ưu • Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao • Chủ động ngun liệu ni cấy giống vi sinh vật • Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn nên thu hoạch nhiều lần quanh năm • Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi vi sinh vật có khả cảm ứng với mơi trường nhanh • Giá thành tương đối thấp mơi trường ni cấy tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất • Vi sinh vật tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác 29/09/2011 11:21 SA 29/09/2011 11:21 SA 33 Nguyễn Hữu Trí Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt tính cao Nguyễn Hữu Trí Nguồn enzyme chủ yếu từ vi sinh vật Nguồn enzyme chủ yếu từ vi sinh vật • 1960, 70% enzyme từ thực vật động vật • Ngày nay, enzyme từ nguồn vi sinh vật chiếm 90% thị trường • Vi sinh vật nguồn enzyme qui mơ cơng nghiệp • Chun hóa khối lượng lớn chất • Ngun liệu sản xuất rẻ tiền, dể kiếm, khơng bị biến đơng theo mùa 32 Hoạt tính enzyme cao Tốc độ sinh sản nhanh Sản xuất chủ yếu nhờ vào q trình lên men chìm Vi sinh vật sản xuất enzyme nhờ thơng tin di truyền nguồn gene chuyển vào • Tốc độ sinh tổng hợp enzyme điều khiển • • • • 29/09/2011 11:21 SA 34 Nguyễn Hữu Trí Chọn lọc chủng sản xuất enzyme • Các nhà di truyền học chọn lựa cho cơng nghiệp sản xuất enzyme phải tìm đặc tính mong muốn tối ưu: – sản phẩm enzyme cao – khơng phụ thuộc chất cảm ứng – dễ dàng thu nhận… • Cố gắng loại bỏ ức chế đặc tính khơng mong muốn – chất đồng biến dưỡng có hại – mùi, màu… 29/09/2011 11:21 SA 35 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 36 Nguyễn Hữu Trí Bản chất sinh học enzyme • Enzyme tạo tế bào sinh vật • Enzyme tham gia phản ứng tế bào sống đươc tách khỏi tế bào sống • Enzyme tham gia phản ứng điều kiện nhiệt độ ơn hồ • Enzyme tham gia xúc tác từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hồn tồn lượng dự trữ • Enzyme thực phản ứng đơn lẻ • Phản ứng có enzyme giúp tiết kiệm lượng • Enzyme chịu điều khiển gene điều kiện phản ứng 29/09/2011 11:21 SA 37 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc enzyme Trung tâm hoạt động (active site) • Trung tâm hoạt động: nhóm hóa học tiếp xúc trực tiếp chất; nhóm hóa học khơng tiếp xúc chất tác dụng trực tiếp đến q trình xúc tác • Gồm amino acid có nhóm hố học hoạt động mạnh; ion kim loại; nhóm chức coenzyme • Enzyme thể có một, hai, chí trung tâm hoạt động 29/09/2011 11:21 SA 38 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 40 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc enzyme Trung tâm hoạt động (active site) • Cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động enzyme kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức enzyme – chất • Các loại enzyme thường tạo trung tâm hoạt động có cấu trúc khơng gian định • Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt Koshland: chất làm thay đổi cấu trúc khơng gian trung tâm hoạt động, giúp trung tâm hoạt đơng tham gia xúc tác 29/09/2011 11:21 SA 39 Nguyễn Hữu Trí Các tiền chất enzyme • Tiền enzyme (proenzyme; zymogen): số enzyme khơng có khả xúc tác sau tổng hợp mà phải trải qua giai đọan biến đổi định (giai đoạn hoạt hố) • Tiền enzyme trải qua giai đoạn hoạt hố nhằm loại bỏ đoạn peptide che lấp trung tâm hoạt đơng enzyme Pepsinogen pepsin Trypsinogen trypsin Chymotrypsinogen chymotrypsin 29/09/2011 11:21 SA 41 Nguyễn Hữu Trí Ý nghĩa q trình xúc tác tế bào sinh vật • Giảm lương hoạt hố gắn liền q trình tiến hóa sinh vật • Tăng tốc độ phản ứng sinh hóa thể, giúp tế bào tăng nhanh số lương khối lượng 29/09/2011 11:21 SA 42 Nguyễn Hữu Trí Cơ chế tác dụng enzyme Cơ chế tác dụng enzyme lên chất • Trong phản ứng có enzyme, chất hoạt hóa mạnh, thay đổi tính chất hóa học sản phẩm phản ứng • Q trình xúc tác enzyme gồm giai đoạn: • Giai đoạn 1: enzyme kết hợp chất liên kết yếu tạo phức hợp tạm thời • Giai đoạn 2: Cơ chất bị thay đổi cấu hình khơng gian • Giai đoạn 3: sản phẩm tạo tách khỏi enzyme 43 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí 44 29/09/2011 11:21 SA Mô hình “chìa khóa” Fisher (1894) Nguyễn Hữu Trí Mô hình “khớp cảm ứng” Koshland (1958) Cơ chất Trung tâm hoạt động Cơ chất Cơ chất Cơ chất Trung tâm hoạt động Enzyme 29/09/2011 11:21 SA Enzyme Enzyme 45 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 46 Nguyễn Hữu Trí Phương trình động học Michaelis Menten Phương trình động học Michaelis - Menten • 1913, Michaelis Menten xây dựng phương trình động học giải thích phản ứng xúc tác có enzyme • Phương trình thể mối quan hệ vận tốc phản ứng với nồng độ chất enzyme • Enzyme kết hợp chất tạo phức ES • Phức hợp chuyển hóa tạo sản phẩm P, enzyme giải phóng tiếp tục xúc tác phản ứng Enzyme • V0 : vận tốc ban đầu phản ứng • Vmax: vận tốc tối đa phản ứng • [S]: nồng độ chất • 29/09/2011 11:21 SA 47 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 48 Nguyễn Hữu Trí Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme • • • • Nhiệt độ pH Chất kiềm hãm Chất hoạt hóa Nhiệt độ • Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nhiệt độ giới hạn định • Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao gọi nhiệt độ tối ưu • Mỗi enzyme có nhiệt độ tối ưu khác • Nhiệt độ cao nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme giảm enzyme bi biến tính • Ở nhiệt độ thấp nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme yếu tăng trở lại tăng dần nhiệt độ 49 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Ảnh hưởng nhiệt độ 51 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 50 Nguyễn Hữu Trí Ảnh hưởng nhiệt độ 29/09/2011 11:21 SA 52 Nguyễn Hữu Trí Ảnh hưởng nhiệt độ, pH pH • pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa enzyme chất • Tùy enzyme có pH tối ưu khác • Để đạt hiệu xúc tác, nghiên cứu xác định nhiệt độ pH tối ưu enzyme quan trọng 29/09/2011 11:21 SA 53 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 54 Nguyễn Hữu Trí Ảnh hưởng pH Ảnh hưởng pH Enzyme Pepsin Trypsin Chymotrypsin Amylase Lipase Phosphatase acid Phosphatase kiềm 29/09/2011 11:21 SA 55 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Nguồn gốc Dòch vò Dòch tụy Dòch tụy Nước bọt, dòch tụy Dòch tụy Tuyến tiền liệt Xương, gan 56 pHop 1,8 8,1- 8,6 7,0 7,0 – 7,5 5,0 – 5,6 8,6 – 9,1 Nguyễn Hữu Trí Chất kìm hãm họat hóa enzyme Chất hoạt hố: chất làm tăng hoạt tính enzyme, chúng có chất hố học khác Chất kìm hãm: Là chất làm giảm hoạt tính enzyme làm giảm lực enzyme với chất làm enzyme khả kết hợp với chất 29/09/2011 11:21 SA 57 Nguyễn Hữu Trí Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme- Chất hoạt hóa • Giúp tăng hoạt tính enzyme nồng độ định • Tác dụng ức chế vượt q nồng độ • Giúp phá vỡ số liên kết phân tử tiền enzyme phục hồi nhóm chức trung tâm hoạt đơng enzyme 29/09/2011 11:21 SA 59 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 58 Nguyễn Hữu Trí Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme – chất kìm hãm • Chất kìm hãm làm giảm hoạt tính enzyme khơng bị thay đổi enzyme Cơ chế kìm hãm thuận nghịch khơng thuận nghịch – Chất kìm hãm cạnh tranh – Chất kìm hãm khơng cạnh tranh – Kìm hãm sản phẩm phản ứng 29/09/2011 11:21 SA 60 Nguyễn Hữu Trí 10 Hoạt hóa carbodiimide Hoạt hóa 3-Aminopropyltriethoxysilane • Hoạt hóa chất mang nhóm carboxyl Hoạt hóa vật liệu trơ thủy tinh 29/09/2011 11:21 SA 109 Nguyễn Hữu Trí Các phương pháp cố định enzyme 29/09/2011 11:21 SA 110 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp hóa học – carrier bound • Phương pháp hóa học cố định enzyme phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang Gồm kiểu: – Covalent immobilization(Cố định enzyme với chất mang liên kết cộng hóa trị) – Non – covalent immobilization (Cố định enzyme với chất mang liên kết khơng cộng hóa trị – phương pháp hấp phụ): 29/09/2011 11:21 SA 111 Nguyễn Hữu Trí Covalent immobilization • Liên kết cộng hóa trí nhóm chức (functinal group) chất mang hoạt hóa nhóm chức acid amin enzyme: -OH; -SH; -NH2; -COOH • Khó thu hồi lại chất mang • Hiệu suất cố định enzyme thấp • Động học enzyme thường bị thay đổi • Tính linh động độ ổn định cao 29/09/2011 11:21 SA 113 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 112 Nguyễn Hữu Trí Covalent immobilization Multi point covalent attachment • Enzyme cố định vào chất mang thơng qua liên kết nhiều cấu tử acid amin lên chất mang • Chất nền: thủy tinh xốp, polyacrylamide, cellulose, hạt từ tính… • VD: glyoxyl – agarose: enzyme gắn vào chất mang thơng qua liên kết vùng giàu lysine 29/09/2011 11:21 SA 114 Nguyễn Hữu Trí 19 Non - covalent Covalent • Non – covalent (Phương pháp hấp phụ -Khơng cộng hóa trị): Phương pháp liên kết ion (ionic exchange; van der Waals; tương tác kỵ nước (strong hydrophobic interaction) VD: Ionic exchange: liên kết chất mang truyền thống enzyme dễ bị phá vỡ thay đổi nồng độ muối pH • Porous glass, agarose gel, hạt từ (magnetic particle) phủ lớp ionic polymers:polyethylenimine (PEI); dextran sulfate chứa nhiều nhóm có khả tạo liên kết ion (ionic group) có cấu trúc linh động dễ dàng tương thích enzyme 29/09/2011 11:21 SA 115 Nguyễn Hữu Trí • Covalent (cộng hóa trị): liên kết cộng hóa trí nhóm chức (functinal group) chất mang nhóm chức acid amin enzyme: -OH; SH; -NH2; -COOH • Multi – point covalent attachment: đa vị trí có khả tạo liên kết cơng hóa trị enzyme chất mang • Support: Porous glass, agarose gel, hạt từ (magnetic particle) • Spacer arm: ngắn 29/09/2011 11:21 SA Liên kết cộng hóa trị 117 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Carrier free 119 118 Nguyễn Hữu Trí Carrier free • Enzyme tự động cố định khối protein mà khơng có hỗ trợ chất mang với diện bifuntional reagents glutaraldehyde • Cross - linked enzyme (CLEs • Cross - linked enzyme crystal (CLECs • Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs) 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Covalent • Các chất mang thường sử dụng: polypeptide, polysacharide, agarose… • Các liên kết đồng hóa trị chất mang E phân loại sau: • Diazo hóa: chất mang- N=N- E • Tạo cầu amit: chất mang-CO-NH- E • Alkyl Aryl hóa: chất mang-CH2-NH2-E • Tạo bazơ Schiff: chất mang-CH=N-E • Trao đổi tiol disulfua: chất mang-S-S- E • Khuyết điểm • Ưu điểm: – Đắt tiền quy trình – Bền, khơng bị ly giải phức tạp theo sản phẩm – Có nhiều lựa chọn – Có thể làm thay đổi vị trí chất mang phù hợp hoạt động enzyme 29/09/2011 11:21 SA 116 Nguyễn Hữu Trí • Cross - linked enzyme (CLEs): Được tạo từ liên kết chéo enzyme hòa tan • Cross - linked enzyme crystal (CLECs): tạo từ liên kết chéo tinh thể enzyme tính ổn định cao điều kiện khắc nghiệt • Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs): tạo từ liên kết chéo protein trang thái tủa • Tủa ( muối, dung mơi…) khuấy mạnh tạo liên kết diện glutaraldehyde 29/09/2011 11:21 SA 120 Nguyễn Hữu Trí 20 Carrier free Liên kết chéo Dựa liên kết cộng hóa trị enzyme tạo thành khối khơng gian ba chiều • Ưu điểm: – Liên kết enzyme chặt – Kết hợp với phương pháp khác tạo liên kết bền vững • Khuyết điểm: 29/09/2011 11:21 SA – Có thể làm thay đổi đáng kể vị trí hoạt động – Mất hoạt tính enzyme q trình cố định 121 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp containment • Phương pháp nhốt enzyme (entrapment) • Phương pháp giữ màng: ultrafiltration 123 29/09/2011 11:21 SA microcapsule; Nguyễn Hữu Trí Phương pháp bẫy (nhốt) 1.1 Microencapsulation (gói enzyme bao cực nhỏ) Màng polymer thẩm thấu dày 200Ao(cellulose, polysacarit, phi tinh bột) gói enzyme bên Màng cho chất sản phẩm enzyme qua khơng cho đại phân tử qua 125 122 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp nhốt enzyme (entrapment) • Enzyme giữ lại khoảng khơng nhỏ tạo q trình polymer hóa Enzyme hòa tan vào dung dich monomer trước polymer hóa tác nhân vật lý, hóa học • Chất (matrix): Alginate Polyacrylamide; polyvinyl alcohol… 29/09/2011 11:21 SA 124 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp giữ màng • Enzyme microcapsule: q trình polymer hóa tiến hành bề mặt giọt enzyme phân tán dung mơi với hỗ trợ chất hoạt tính bề mặt (surfactant) • vỏ bọc bên ngồi • Màng siêu lọc (Ultrafilatration membrane): enzyme nhốt màng siêu lọc, cho phép chất sản phẩm vào màng enzyme hoạt động cần coenzyme • Nhược điểm: dễ bị tắc lỗ màng bọt khí; tụ tập chất khơng mong muốn 1.2 Bẫy gel: việc bẫy enzyme thể gel đạt cách thực phản ứng polymer hóa, tủa / làm đơng với diện enzyme 29/09/2011 11:21 SA 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 126 Nguyễn Hữu Trí 21 Hấp phụ enzyme lên chất khơng tan Một số chất mang sử dụng + Hữu cơ: than hoạt tính, tinh bột, cellulose agarose… + Vơ cơ: Silic, thủy tinh xốp, oxyt kim loại… + Polymer tổng hợp: polyamit, nilon, polyacrylamide… + Chất trao đổi ion: amberit, dietyl-amino-etyl sephadex (DEAE – sephadex), DEAE – cellulose, carboxyl metyl cellulose (CM cellulose) 29/09/2011 11:21 SA 127 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng sản xuất cơng nghiệp Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase Ưng dụng enzyme raffinase cố định Ưng dụng enzyme invertase cố định Sản xuất L – amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định • Ưng dụng lactase cố định • Sản xuất kháng sinh • • • • 29/09/2011 11:21 SA 129 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng enzyme raffinase cố định • Sản xuất: Ni nấm mốc Mortierella vinacea var faffinoseutilizer hạt sấy khơ sử dụng enzyme cố định • Ưng dụng: Raffinase (– galactosidase) cố định giúp loại bỏ raffinose stachyose từ sữa đậu nành, tránh nguy bị đầy dùng thức uống 29/09/2011 11:21 SA 131 Nguyễn Hữu Trí Hấp phụ enzyme lên chất khơng tan • Ưu điểm: – Khơng thay đổi cấu trúc enzyme hay trung tâm tâm hoạt động – Khơng đòi hỏi hóa chất kèm – Đơn giản, rẻ tiền 29/09/2011 11:21 SA • Khuyết điểm: – Dễ ly giải thay đổi số đặc điểm pH, t… – Khơng đặc hiệu 128 Nguyễn Hữu Trí Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase • Glucose isomerase tạo từ Arthrobacter streptomyces sp, nhạy với tác nhân kim loại cố định enzyme collagen, bơng… • D- glucose D- fructose 29/09/2011 11:21 SA 130 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng enzyme invertase cố định • Enzyme invertase nấm men cố định than (tên thương hiệu Brimac TM) sản xuất siro nghịch đảo chất lượng tương đương, tránh đậm màu, giảm nồng độ muối tro sản phẩm, hiệu xuất chuyển đổi cao • Thời gian phản ứng giảm đáng kể: Enzyme invertase tự (24 giờ), enzyme invertase cố định (15 phút) 29/09/2011 11:21 SA 132 Nguyễn Hữu Trí 22 Sản xuất L – amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định Ứng dụng lactase cố định • Sản xuất theo phương pháp hóa học thu amino acid dạng đồng phân D – khơng có giá trị dinh dưỡng • L – amino acid tách khỏi hỗn hợp dựa vào khác biệt độ hòa tan DL – acylomino acid quay trở lại lò phản ứng • Giá thành cao enzyme lactase từ tế bào nấm men nhà khoa học Ý cố định với sợi cellulose triacetate • Lactase dễ bị ức chế sản phẩm tạo thành, chất béo, protein nhũ tương dùng xử lý huyết sữa nhiễm vi sinh vật 29/09/2011 11:21 SA 133 Nguyễn Hữu Trí Sản xuất kháng sinh 135 134 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng y học phân tích • Penicillin amidase từ E coli cố định sephadex G200 hoạt hóa cyanogen bromide thủy phân benzylpenicillin phenoxymethylpenicillin sinh từ q trình lên men giải phóng ampicillin 29/09/2011 11:21 SA 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí • Một số bệnh di truyền rối loạn chuyển hóa người thiếu loại enzyme đặc biệt thay cách sử dụng enzyme cố định vi hạt, sợi hay gel nhằm tránh gây đáp ứng miễn nhiễm thể • VD: Tạo thận nhân tạo, enzyme urease cố định hạt resin hấp phụ than chì tạo thành vi nang nơi hấp phụ sản phẩm q trình phân hủy urea thận 29/09/2011 11:21 SA 136 Nguyễn Hữu Trí Kỹ thuật tách chiết enzyme 29/09/2011 11:21 SA 137 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 138 Nguyễn Hữu Trí 23 Phá vỡ mơ tế bào (Disruption of tissues and cells) Phá vỡ mơ tế bào (Disruption of tissues and cells) • Vi sinh vật thường chọn làm host organism • Ưu điểm: tốc độ sinh trưởng nhanh • Nhược điểm: thiếu chế cải biên sau dịch mã enzyme thường dang inclusion body • Cải biên gene biểu giúp sản phẩm enzyme tiết mơi trường ngồi tế bào Lựa chọn mơ • Dựa vào giá thành, tính sẵn có phong phú enzyme • Recombinant DNA technology – xây dựng host cell (expression system) • Tránh hạn chế sử dụng mơ giàu proteinase Vd: gan, lách, thận… Ở vi sinh vật tạo mutant strain (dòng đột biến) thiếu số proteinase (E Coli, Bacillus subtilis) 29/09/2011 11:21 SA 139 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA • Mơ cắt nhỏ (loại bỏ mỡ mơ liên kết) • Mơ mềm đồng hóa thiết bị đồng hóa • Mơ cứng cần xay nhỏ máy xay trước cho vào thiết bị đồng hóa • Ly tâm • Nhiều loại tế bào có mơ • Huyền phù tế bào chuẩn bị phương pháp học phương pháp enzyme • Phương pháp học: ảnh hương tới ngun vẹn tế bào • Phương pháp enzyme: collagenase từ Clostridium histolyticum, trypsin, estalase… tách dựa vào điện tích, antigenicity, kịch thước, tỷ trọng 141 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Phá vỡ tế bào thực vật • Thu nhân enzyme từ tế bào thực vật tương đối khó khăn diện vách tế bào, khơng bào (vacuole) hợp chất phenolic • Việc phá vỡ khơng bào giải phóng proteinases, pH dịch chiết thấp • Khi có oxygen, phenol oxidases xúc tác chuyển hợp chất phenolic thành dạng polymeric pigment bất hoạt (inactivate) enzyme dịch chiết • Bổ sung chất khử – mercaptoethanol • Bổ sung polyvinylpolypyrollidone giúp hấp thu hợp chất phenolic 29/09/2011 11:21 SA 143 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào động vật Phá vỡ mơ – tách tế bào (disruption of tissue and separation of cells) 29/09/2011 11:21 SA 140 142 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào nấm men Vách tế bào Nhiều proteinase Tạo đột biến gây thiếu hụt vài proteinase Ngăn chặn tạo proteinase cách ni mơi trường khơng chứa chất protein • Phương pháp 1: ủ bánh men toluene (6% (v/w)) – mercaptoethonol (0.2 % (v/w)) 370 C h tách thành phần vách tế bào EDTA (15 mM) pH 7.0 chứa mM – mercaptoethanol, ủ qua đêm phá vỡ vách tế bào ly tâm 15 000 rpm 30 phút • • • • 29/09/2011 11:21 SA 144 Nguyễn Hữu Trí 24 Phá vỡ tế bào nấm men Phá vỡ tế bào vi khuẩn • Vách tế bào • Phương pháp học thường ảnh hưởng đến thành phần tế bào • Vi khuẩn gram dương (Bacillus, Micrococcus, Streptococcus) : dùng enzyme lysozyme phá hủy vách tế bào, ủ với lysozyme từ trứng gà (0.2 mg/ml) 370 C 15 phút • Vi khuẩn gram âm (E coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) : rửa tếbào với detergent (0.1% (v/v) N-lauroyl-sarcosine) xử lý với với sucrose (0.7 M), Tris (0.2 M), EDTA (0.04 M) • Phương pháp 2: lắc với hạt thủy tinh (đường kính mm) 1ml dịch ly tâm 2500 rpm 100 C • Nấm men Pichia pastoris dùng tế bào chủ, recombinant protein tiết vào mơi trường ni cấy 29/09/2011 11:21 SA 145 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào vi khuẩn 147 • Màng tế bào cần xử lý với non – ionic detergent Triton hay Tween Các detergent gây ảnh hương lên cấu trúc protein nói chung enzyme nói riêng • Quy luật sử dụng detergent: mg detergent dùng cho mg màng tế bào • CD – circular dichroism dùng để kiểm tra cấu trúc bậc enzyme tách chiết Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng enzyme 29/09/2011 11:21 SA 149 Nguyễn Hữu Trí Nguyễn Hữu Trí Enzyme gắn màng tếbào • Dna dịch chiết có có độ nhớt cao gây khó khăn việc tinh enzyme Hoặc xử lý với deoxyribonuclease (10 μg/ml) Hoặc xử lý với protamine ( protein giàu arginine cấu tạo) • Hoặc xử lý polymer tích điện dương (polyethyleneimine) 29/09/2011 11:21 SA 146 29/09/2011 11:21 SA 148 29/09/2011 11:21 SA Nguyễn Hữu Trí Các ứng dụng cơng nghiệp enzymes Ứng dụng Enzyme sử dụng Sử dụng Vấn đề Chất tẩy rửa sinh học - Đầu tiên protease, sản xuất dạng ngoại bào từ vi khuẩn - Amylase - sử dụng cho điều kiện trước ngâm ứng dụng lỏng trực tiếp - chất tẩy rửa cho máy rửa chén để loại kháng cặn tinh bột - phản ứng dị ứng cơng nhân chế biến; ngày vượt qua cơng nghệ chứa Cơng nghiệp bánh kẹo - Alpha-amylase nấm; bình thường bị bất hoạt 50oC, bị phá hủy q trình nung nóng - Proteinase - xúc tác cắt tinh bột từ bột thành đường, sử dụng nấm men Sử dụng sản xuất bánh mỳ trắng, bánh bao, bánh mỳ nhỏ - sản xuất bánh quy để hạ thấp mức protein bột Cơng nghiệp rượu bia -enzyme tạo từ lúa mạch suốt giai đoạn ngâm sản xuất bia - enzyme sản xuất cơng nghiệp: amylases, glucanases, proteinase, beta glucanase, amyloglucosidase proteinase - phân hủy tinh bột protein để tạo đường đơn, axit amin peptide sử dụng nấm men để thúc đẩy tạo cồn - ngày sử dụng rộng rải sản xuất rượu bia: cắt polysaccharide protein làm malt; cải thiện đặc tính lọc; bia thấp calo, loại vẩn đục trữ bia Cơng nghiệp chế biến bơ sữa - Rennin, từ dày từ động vật nhai lại non (bê, cừu, dê con) - enzyme tạo từ vi sinh vật - Lipase - Lactase - sản xuất phơ mai, sử dụng để phân cắt protein Ngày tìm thấy gia tăng sử dụng cơng nghiệp bơ sữa - kích thích làm chin phơ mai mốc xanh (phơ mai vân xanh, Roquefort) - bẻ gãy lactose thành glucose galactose 29/09/2011 11:21 SA 150 - động vật già khơng thể sử dụng gia tăng tuổi tác sản xuất rennin giảm thay thể proteinase, pepsin, khơng thích hợp cho sản xuất phơ mai Những năm gần gia tăng to lớn tiêu thụ phơ mai với gia tăng sản xuất thịt bò dẫn tới gia tăng thiếu Trígiá hụtNguyễn rennin vàHữu gia tăng 25 ứng dụng Enzyme sử dụng Sử dụng Vấn đề Cơng nghiệp tinh bột - Amylase, amyloglucosidases glucoamylases - Glucose isomerase - enzyme cố định - chuyển tinh bột thành glucose chất (siro) khác - chuyển glucose thành fructose (các siro cao fructose bắt nguồn từ chất liệu tinh bột kích thích tính làm thấp lượng) - sản xuất siro cao fructose Được sử dụng rộng rải Mỹ Nhật Châu Âu giới hạn để bảo vệ nơng dân trồng củ cải đường Cơng nghiệp dệt Enzyme Amylase - Các enzyme vi khuẩn - ngày sử dụng rộng rải để loại tinh bột, sử dụng chất dính hồ vải sợi vải bề mặt vải định để ngăn chặn hư hại dệt (theo cổ truyền, loại hồ dán sử dụng hóa chất mạnh phổ biến) - thơng thường dành cho loại hồ vải chúng có khả chịu nhiệt lên tới 100-110oC Cơng nghiệp thuộc da - Các enzyme tìm phân chó bồ câu - enzyme Trypsin từ lò mổ từ vi sinh vật - theo cổ truyền, sử dụng để xử lý da thuộc để làm mềm lại loại bỏ thành phần protein định (q trình gọi ngâm mềm; ngâm mềm mạnh đòi hỏi để làm cho miếng da mềm, mịn, ngâm mềm nhẹ cho đế giầy - thay lượng lớn enzyme để cập ngâm mềm sử dụng cho loại lơng từ da sống Sử dụng y - Trypsin học - trypsin tuyến tụy dược29/09/2011 học 11:21 SA - việc chuẩn bị có mùi khó chịu - giải phẩu loại mơ hư, làm tan cục máu nghẽn Nguyễn Hữu Trí - hổ trợ kiểm sốt phân151 cắt, xử lý sưng tấy,… - nhiều enzyme sử dụng hóa học lâm sàng cơng cụ chuẩn đốn Ứng dụng enzyme • Phần lớn enzyme sản xuất vi sinh vật (nấm sợi, vi khuẩn nấm men phần lại từ động vật thực vật) • Khi sử dụng tế bào vi vật lên men có để xúc tác lại có số nhược điểm: – Tiêu thụ chất – Hình thành sản phẩm khơng mong muốn – Thu nhận tinh sản phẩm khó khăn Hướng khắc phục: dùng enzyme cố định 29/09/2011 11:21 SA 153 Ứng dụng enzyme Nguyễn Hữu Trí Cơng nghê enzyme bắt đầu phát triển vào năm 1950, chiến II cần lượng lớn penicilline 29/09/2011 11:21 SA 152 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng enzyme • Phần lớn enzyme sử dụng cơng nghiệp enzyme ngoại bào (protease, amylase (mức độ hơn) cellulose, lipase…), thường khơng cần cofactor để hoạt động • Một số enzyme nội bào sản xuất cơng nghiệp bào gồm glucose oxidase cho bảo quản thực phẩm, asparaginase cho trị liệu ung thư penicillin acylase cho biến đổi kháng sinh 29/09/2011 11:21 SA 154 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng enzyme • Nhờ cơng nghệ di truyền, chuyển gene mong muốn từ sinh vật sang sinh vật chủ thích hợpsản xuất enzyme cơng nghiệp chất lượng độ tinh cao • Vi sinh vật tái tổ hợp ngày sử dụng rộng rải xu hướng chủ yếu tương lai 29/09/2011 11:21 SA 155 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng thực phẩm 29/09/2011 11:21 SA 156 Nguyễn Hữu Trí 26 Các enzyme sử dụng quy mơ cơng nghiệp cơng nghệ thực phẩm Chế biến chất từ tinh bột • Ngun liệu: tinh bột Bắp, Lúa mì, bột Khoai mì, Khoai tây 29/09/2011 11:21 SA 157 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 158 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 160 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 162 Nguyễn Hữu Trí • Giá cả: giá enzyme giảm đáng kể, mức chấp nhận thập kỷ qua • Gia tăng sử dụng enzyme tinh cao đặc hiệu cao • gia tăng lợi nhuận từ mua bán enzyme nhiều 29/09/2011 11:21 SA 159 Nguyễn Hữu Trí Protease thực vật – Bromelin (E.C.3.4.4.24) • Bromelin nhóm protease chứa nhóm sulfhydryl, thu nhận từ thực vật thuộc họ Bromeliaceae • Bromelin chiếm 50% protein dứa • pH hoạt động: pH – 8; Mw: 33 000 Da • Bromelin glycoprotein • Thịt dứa có hoạt tính enzyme bromelin kể từ tháng trước chín hoạt độ cao khoảng 20 ngày trước chín 29/09/2011 11:21 SA 161 Nguyễn Hữu Trí 27 Bromelin – Quy trình thu nhận tinh bromelin Quả/thân/chồi xay nhuyễn/lọc dịch lọc ly tâm dịch ly tâm kết tủa thu tủa (chế phẩm enzyme thơ) sấy khơ tinh sản phẩm enzyme tinh khiết 29/09/2011 11:21 SA 163 Nguyễn Hữu Trí Thu dịch thơ bromelin • • • • Xay nhuyễn thân, dứa máy xay Vắt kỹ Lọc thu dịch lọc Ly tâm 6000 rpm 10 phút thu dịch 29/09/2011 11:21 SA 165 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp tách bromelin • Phương pháp hấp phụ: Kaolin khơ trộn dung dịch nước dứa sau ly tâm theo tỷ lệ 25 mg kaolin/1ml dịch khuấy từ ly tâm thu tủa bromelin – kaolin • Phương pháp siêu lọc: loại bỏ chất có kích thước nhỏ phân tử bromelin giúp đặc bromelin • Điều khiển nhiệt độ thích hợp nhằm tránh tắt nghẽn lỗ lọc • Điều chỉnh áp suất giúp tăng tốc độ dòng chảy giúp tăng hiệu suất lọc 29/09/2011 11:21 SA 167 Nguyễn Hữu Trí Thu nhận bromelin • • • • • Thu dịch bromelin thơ Phương pháp tách bromelin Phương pháp kết tủa Phương pháp hấp phụ Phương pháp siêu lọc 29/09/2011 11:21 SA 164 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp tách bromelin • Phương pháp kết tủa protein: kết tủa phải thực điều kiện lạnh • Sử dụng aceton: dịch ép làm lạnh từ – 40 C, aceton giữ 200 C • Ethanol: dich chiết ethanol phải giữ lạnh Kết tủa thu phải rửa acetone làm khơ nhanh • Amonium sulphate: amonium sulphate nồng độ bão hòa (70%) giúp kết tủa bromelin Q trình thực nhiệt độ thấp 29/09/2011 11:21 SA 166 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp tinh bromelin • Tinh phương pháp thẩm tích • Hòa g bromelin thơ 10 ml đệm sodium phosphate 0.03 M pH 7.2 túi cellophane đựng cốc chứa sẵn lit đệm sodium phosphate 0.03 M pH 7.2 khuấy từ thay dung dịch đệm ngồi túi • Điều chỉnh nhiệt độ phù hợp • Tinh phương pháp lọc qua sephadex G – 50, G – 100 • Tinh phương pháp sắc ký 29/09/2011 11:21 SA 168 Nguyễn Hữu Trí 28 Protease thực vật – Papain (E.C.3.4.4.10) • Papain sulfhydryl protease tách từ nhựa đu đủ xanh • Quả xanh 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa Trong nhựa, nhồi thành phần papain (95%) chứa số protein khác • Papain endoprotease gồm 185 amino acid Mw: 20 900 Da • Papain có cấu trúc khơng gian dạng hình cầu, gồm nhân kỵ nước • Vùng trung tâm hoạt động papain: Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser - Cys 29/09/2011 11:21 SA 169 Nguyễn Hữu Trí Protease động vật – pepsin (E.C.3.4.4.1) • Pepsin enzyme quan trọng có tuyến tiêu hóa động vật, thuộc nhóm enzyme thủy phân • Cấu trúc: pepsin có dạng hình cầu, cấu trúc bậc gồm bốn tiểu đơn vị • Một liên kết S – S phân tử cần thiết cho trung tâm hoạt động • Papain gồm 329 amino acid pI : pH 1.0 • Trung tâm hoạt động pepsin gồm nhóm carboxyl acid glutamic, nhân thơm tyrosine • Pepsin có tính acid mạnh Mw: 34 500 Da • Tiền enzyme pepsin pepsinogen 29/09/2011 11:21 SA 171 Nguyễn Hữu Trí Protease động vật – trypsin (E.C.3.4.21.4) • Trypsin có dịch tụy người động vật • Trypsin protease kiềm tính hoạt động ruột • Tiền enzyme trypsin trypsinogen: hoạt hóa nhờ enzyme đường ruột enterokinase • Mw: 22.680 – 23.400 Da gồm 249 amino acid • pH tối ưu: pH 8; pH thích hợp: 7.8 – 9.5, ổn định pH thấp – • Nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ thể hoạt động tốt khoản 30 – 400 C • Trypsin hoạt hóa bởi: Ca, Co, Mn bị ức chế bởi: Cu, Ag, Hg 29/09/2011 11:21 SA 173 Nguyễn Hữu Trí Hoạt tính enzyme chế xúc tác • Papain cần nhóm sulhydryl tự để thể hoạt tính • Papain thủy phân protein thành polypeptide amino acid • Papain có khả thủy phân sâu • Papain có tính đặc hiệu rộng: thủy phân hầu hết liên kết peptide trừ liên kết với proline với glutamic có carboxyl tự • Khả thủy phân tùy thuộc vào trạng thái chất • Papain có hoạt tính esterase, thiol esterase transferase 29/09/2011 11:21 SA 170 Nguyễn Hữu Trí Hoạt động xúc tác pepsin • Protease có khả phân cắt 15% liên kết peptide protein đoạn peptide • Pepsin đặc hiệu cắt liên kết peptide acid amine nhân thơm với amino acid khác • Pepsin có khả cắt nối peptide Leu –Val, Val – Cys, Glu – Asn, Leu – Glu mức độ thấp • Pepsin phân cắt dễ dàng protein tan nước • Pepsin bị ức chế chất dạng epoxide 29/09/2011 11:21 SA 172 Nguyễn Hữu Trí Hoạt động tính đặc hiệu trypsin • Trung tâm hoạt động: -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro• Trypsin cắt liên kết peptide carboxyl lysine, arginine với nhóm amine amino acid khác • Trypsin tác dụng tốt với protein bị biến tính • Trypsin phân cắt 1/3 liên kết peptide phân tử protein, tạo peptide nhỏ amino acid • Trypsin khả thủy phân ester 29/09/2011 11:21 SA 174 Nguyễn Hữu Trí 29 Amylase Amylase • Amylase enzyme đóng vai trò chủ yếu hoạt động thủy phân tinh bột q trình nảy mầm hạt ngũ cốc • Có loại amyalse, enzyme khác đăc tính, pH hoạt động tính ổn định với nhiệt: – amylase, – amylase, – amylase (glycoamylase): thủy phân - 1,4 - glycoside tinh bột • Dextrin–6-glucanhydrolase, amylopectin–6– glucanhydrolase oligodextrin – – glucanhydrolase (dextrinaxe): thuỷ phân - 1,6 - glycoside tinh bột 29/09/2011 11:21 SA 175 Nguyễn Hữu Trí Amylase • loại amylase chia thành nhóm: Endoamylase: α – amylase nhóm enzyme khử nhánh Dextrin – 6- glucanhydrolase, amylopectin – – glucanhydrolase oligodextrin – – glucanhydrolase (dextrinaxe) Exoamylase: β – amylase, γ – amylase • Amylase từ nguồn khác có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu, đặc điểm thủy phân khác 29/09/2011 11:21 SA 176 Nguyễn Hữu Trí Thu nhận amylase từ vi sinh vật • Phân lập, chọn giống vi sinh vật • Chọn chất cảm ứng, thành phần mơi trường ni cấy thích hợp • Tiêu chuẩn hóa điều kiện ni cấy: nhiệt độ ni, pH, độ ẩm ban đầu, độ thống khí… 29/09/2011 11:21 SA 177 Nguyễn Hữu Trí Ni vi sinh vật tạo amylase phương pháp bề mặt • Ngun liệu: cám mì, cám gạo, chất lượng ngun liệu ảnh hưởng lớn hoạt lực amylase sinh • Độ ẩm tối thích: (nấm mốc: Asp niger, Asp awamort…) từ 58 – 60% • Nhiệt độ ni: • Giai đoạn nảy mầm đính bào tử (3-4 giờ): 23 – 300 C nấm mốc, 32 – 380 C vi khuẩn • Giai đoạn sinh trưởng nhanh hệ sợi, hơ hấp xảy mạnh, sinh nhiệt lớn (4-18 giờ) thổi khí vơ trùng nhiệt độ 28 -290 C độ ẩm cao • Giai đoạn tạo amylase mạnh (10 -20 giờ) • Thời gian ni để thu amylase cực lớn tùy vào loại vi sinh vật 179 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 29/09/2011 11:21 SA 178 Nguyễn Hữu Trí Ni vi sinh vật tạo amylase phương pháp bề sâu • Mơi trường dinh dưỡng: nguồn ngun liệu giàu tinh bột, chất cảm ứng cho sinh trường vi sinh vật tạo amylase Tùy loại vi sinh vật, người ta bổ sung thêm số loại muối vơ cơ, muối nitrate vi sinh vật sử dụng nguồn nitơ • Nhiệt độ ni: 30 -320 C nấm sợi; 370 C Bacillus subtilis Nhiệt độ ni ảnh hưởng tới độ bền nhiệt amylase tạo thành • Sục khí khuấy trộn: phần lớn vi sinh vật tạo amylase vi sinh vật hiếu khí, cần oxy hòa tan mơi trường để tăng trưởng 29/09/2011 11:21 SA 180 Nguyễn Hữu Trí 30 Pectinase • Enzyme xúc tác phân hủy polymer pectin • Trong tự nhiên, tượng thương xảy trái chín • Ưng dụng thực phẩm, giúp làm nước rau • Kiểm sốt hoạt động pectinase giúp điều chỉnh độ nhớt sản phẩm • Pectinase phân loại dựa chế tác dụng chúng 29/09/2011 11:21 SA 181 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Cellulase 183 Nguyễn Hữu Trí • Lipase enzyme tham gia thủy phân glyceride tạo monoglyceride acid béo • Phân loại: • Pancreatic lipase thu từ tuyến tụy heo Enzyme tham gia thủy phân triglyceride, dầu, chất béo, acid béo đơn giản… • Pregastric lipase: enzyme sản xuất từ động vật Enzyme tham gia thủy phân acid béo chuỗi ngắn chất béo sữa • Lipase từ vi sinh vật: sử dụng nấm sợi vi khuẩn sản xuất lipase theo qui mơ cơng nghiệp 29/09/2011 11:21 SA 185 Nguyễn Hữu Trí Enzyme lactase (-galactosidase) thu từ nấm mốc Aspergillus oryzae • Một số người khơng thể hấp thu lactose sữa nhiên lactose hệ tiêu hóa lên men vi khuẩn Hậu làm cho thể buồn nơn, co rút, sinh hơi, tiêu chảy sau khoảng sau sử dụng sản phẩm sữa • Lactase tiêu hóa lactose thực phẩm • Vì sản phẩm sữa khơng chứa lactose cần thiết 29/09/2011 11:21 SA 184 Lactase Lactose © 2008 Paul Billiet ODWS Nguyễn Hữu Trí Lipase • Trong thiên nhiên cellulose bị phân hủy bơi vi sinh vật điều kiện hiếu khí yếm khí • Q trình phân hủy xúc tác enzyme cellulase • Vi sinh vật tự nhiên có khả sinh tổng hợp cellulase: nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn • Đóng vai trò quan chuyển hóa vật chất tự nhiên cơng nghiệp thực phẩm, mơi trường 29/09/2011 11:21 SA 182 http://biotech.nikkeibp.co.jp/MUSEUM/3.html Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA © 2008 Paul Billiet ODWS 186 Nguyễn Hữu Trí http://www.biologie.uni-regensburg.de/ 31 Amylase Amylase Dệt: rủ bỏ hồ vải (tầng lớp hồ để mặt vải trở nên mịn, dễ bắt màu) 29/09/2011 11:21 SA 187 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA Pectinase 189 Nguyễn Hữu Trí Pectinase Thành phần Prozyme: Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Pectinase, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, Vitamin K3, Stay C…rất cần thiết cho tiêu hóa tăng trọng tơm 29/09/2011 11:21 SA 188 Pectinase có khả thủy phân pectin Sản xuất nước từ ngun liệu nhờ chế phá vỡ protopectin (chất làm liên kết tế bào), thủy phân protein, phá vỡ ngun sinh chất tế bào vỡ tế bào nước chảy ra, hiệu suất tăng Làm nước ép (bia, rượu) Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 190 Nguyễn Hữu Trí Chiến lược sản xuất enzyme tẩy rửa Novo Nordisk A/S Pectinase -Gene enzyme lipolase Humicola lanuginosa chuyển vơ Aspergillus oryzae thích hợp cho mục đích thương mại - Enzyme làm tăng hiệu điều kiện giặt tẩy Bảo quản thực phẩm : Phối hợp với catalase kéo dài thời gian bảo quản bột trứng, sữa khơ, làm ổn định bia Chống rỉ bao bì đựng nước giải khát CO2 ( đuổi O2 khỏi sản phẩm thêm nước vào ) 29/09/2011 11:21 SA 191 Nguyễn Hữu Trí - Ổn định với nhiệt pH liên quan tới giặt tẩy 29/09/2011 11:21 SA 192 Nguyễn Hữu Trí 32 Chân thành cảm ơn 29/09/2011 11:21 SA 193 Nguyễn Hữu Trí 33 ... phân tử enzyme đơn vị thời gian 29/09/2011 11:21 SA 66 Nguyễn Hữu Trí 11 Qui trình sản xuất enzyme • Sinh tổng hợp enzyme • Thu nhận enzyme: phá vỡ tế bào, tách enzyme, đặc enzyme • Tinh enzyme. .. pháp enzyme) • Phương pháp tự phân: tạo điều kiên enzyme tối ưu cho số enzyme phân giải thành phần thành tế bào Thủy phân chất khác enzyme • Phương pháp sử dụng enzyme từ ngồi tế bào: sử dụng enzyme. .. Trí Các tiền chất enzyme • Tiền enzyme (proenzyme; zymogen): số enzyme khơng có khả xúc tác sau tổng hợp mà phải trải qua giai đọan biến đổi định (giai đoạn hoạt hố) • Tiền enzyme trải qua giai