PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN e COLI o157

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E.COLI O157 (Tham khảo TCVN 7686:2007) Nguyên lý Các vi sinh vật hình thành khuẩn lạc điển hình môi trường thạch đổ đĩa sử dụng tiêu chuẩn này, có sinh indol dính kết đặc hiệu với kháng huyết kháng kháng nguyên O157 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôichuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 1: nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôiNguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật Thiết bị, dụng cụ, môi trường nuôi cấy, thuốc thử kháng huyết 4.1 Thiết bị dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: - Tủ sấy, nồi hấp áp lực; - Tủ ấm, nồi cách thủy, máy đo pH; - Ống nghiệm, bình cầu, ống đong, pipet chia độ xả hết, đĩa petri, que cấy…; - Thiết bị tách từ tính có giá đỡ từ; - Các hạt từ tính miễn dịch kháng Escherichia coli O157; - Ống nghiệm chất dẻo kiểu Eppendorf; - Bộ trộn quay: có khả quay với tốc độ 15 vòng/phút đến 20 vòng/phút; - Máy trộn vortex 4.2 Môi trường nuôi cấy thuốc thử - Canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N); - Thạch Macconkey sorbitol telurit xefixim (CT-SMAC); - Thạch EMB thạch Endo; - Thạch dinh dưỡng; - Môi trường trypton/tryptophan; - Thuốc thử Kovac; - Dung dịch muối 8,5%; - Dung dịch đệm phosphat cải biến 0,01 mol/l, pH 7,2 4.3 Kháng huyết Escherichia coli O157 Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan Nếu tiêu chuẩn cụ thể riêng liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm bên liên quan nên thỏa thuận Cách tiến hành 6.1 Phần mẫu thử huyền phù ban đầu Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho x g x ml phần mẫu thử vào 9x ml 9x g canh thang trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N) (4.2), làm ấm sơ tủ ấm 41,5oC để thu tỷ lệ phần mẫu thử mTSB + N 1/10 (khối lượng/thể tích thể tích/thể tích) 6.2 Tăng sinh Ủ huyền phù ban đầu chuẩn bị theo 6.1 41,5C/6 giờ, ủ tiếp 12 đến 18 Việc tách từ miễn dịch cấy lên đĩa thạch chọn lọc sau ủ cho kết dương tính giả, sau ủ tiêp 18 trở thành âm tính 6.3 Tách từ miễn dịch (IMS) 6.3.1 Khái quát Sau ủ từ 12 đến 18 sau tiến hành IMS, cần Các dẫn để hướng dẫn chung, cần kết hợp với hướng dẫn nhà sản xuất liên quan đến cách tiến hành phương pháp sử dụng bắt giữ miễn dịch thiết bị cần thiết 6.3.2.Bắt giữ miễn dịch Việc sử dụng thiết bị tách từ tính hạt từ miễn dịch phủ kháng thể, cần thực quy trình bắt giữ/tách đây: Trộn dịch cấy tăng sinh để yên cho nguyên liệu thô lắng xuống Cho 20µl hạt từ miễn dịch chuẩn bị nhiệt độ phòng vào ống nghiệm Eppendorf Lấy ml dịch lỏng phía dịch cấy tăng sinh, có thể, tránh hết hạt thực phẩm chất béo, cho vào ống nghiệm Eppendorf Trộn huyền phù máy trộn quay với tốc độ khoảng từ 12 vòng/phút đến 20 vòng/phút 10 phút Chú ý: Sử dụng kỹ thuật vô trùng để tránh nhiễm bẩn từ bên việc tạo bọt khí Thực tủ an toàn mang găng tay bảo vệ 6.3.3.Tách Đặt ống Eppendorf vào giá từ hạt từ dính kết dựa vào nam châm cách dịch chuyển nhẹ nhàng giá từ qua lại 180o Mở nắp cẩn thận mà không làm nhiễu loạn hạt thành ống Dùng pipet Pasteur vô trùng cho mẫu ống nghiệm giá từ, loại bỏ dung dịch cách hút từ từ dịch lỏng từ đáy ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch đệm rửa vô trùng đậy nắp Lấy nam châm khỏi giá Trộn phần chứa ống cách đảo nhẹ nhàng giá qua lại 180o đặt nam châm trở lại giá Chú ý: tránh làm nhiễm bẩn chéo bổ sung dung dịch đệm Tiến hành trên, sử dụng pipet Pasteur vô trùng cho mẫu để loại bỏ dịch rửa Lặp lại quy trình rửa vài lần Lấy ống nghiệm khỏi thiết bị từ tính, cho 100 µl dung dịch đệm rửa vô trùng vào ống nghiệm hòa lại hạt từ tính Chú ý: quy trình gặp phải khó khăn sản phẩm chất béo phomat tươi 6.4 Cấy lên đĩa thạch chọn lọc nhận dạng khuẩn lạc E.coli O157 6.4.1 Cấy lên đĩa Sử dụng pipet man, hút 50 µl hạt từ tính hòa lại rửa vào đĩa thạch Macconkey sorbitol telurit xefixim làm khô 50 µl vào đĩa môi trường phân lập thứ hai (do phòng thử nghiệm chọn) Dùng que cấy vòng vô trùng ria cấy hạt để thu nhiều khuẩn lạc tách biệt rõ khắp đĩa thạch Ủ môi trường nuôi cấy 37oC/18-24 ủ môi trường nuôi cấy chọn lọc thứ hai nhiệt độ thời gian theo quy định 6.4.2 Nhận dạng khuẩn lạc E.coli O157 điển hình Trên đĩa thạch CT-SMAC: khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc có đường kính xấp xỉ 1mm, suốt, gần không màu viền có màu vàng nâu nhạt Trên đĩa thạch phân lập chọn lọc thứ hai: đặc điểm khuẩn lạc theo dẫn nhà sản xuất 6.5 Khẳng định 6.5.1 Chọn khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc điển hình đĩa, đĩa có khuẩn lạc lấy tất số khuẩn lạc có mặt để kiểm tra Cấy ria khuẩn lạc chọn lên đĩa thạch dinh dưỡng Ủ môi trường nuôi cấy 37oC/18-24 tủ ấm 6.5.2 Khẳng định tính chất sinh vật hóa học: khả sinh indol Chọn khuẩn lạc khiết đĩa thạch dinh dưỡng cấy vào ống đựng môi trường trypton/tryptophan Ủ môi trường nuôi cấy 37oC/24 tủ ấm Nhỏ khoảng 1ml thuốc thử Kovac để yên 10 phút nhiệt độ phòng Kết quả: Xuất vòng màu đỏ ống môi trường nuôi cấy chứng tỏ phản ứng dương tính, màu vàng/nâu chứng tỏ phản ứng âm tính 6.5.3 Khẳng định huyết Chỉ kiểm tra khuẩn lạc dương tính với indol phản ứng huyết chúng với kháng huyết O157 6.5.3.1 Loại bỏ vi khuẩn phân lập tự kết dính Cho giọt nước NaCl 8,5% lên lam kính Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng, nghiền vi khuẩn giọt nước NaCl 8,5% cho thu huyền phù đục đồng Di chuyển phiến kính nhẹ nhàng 30 giây đến 60 giây Quan sát kết thu dựa vào màu đen dùng kính lúp, cần Kết quả: huyền phù tạo thành mảng nhìn thấy, chủng coi tự kết dính không dùng để kiểm tra tiếp 6.5.3.2 Phản ứng kháng huyết E.coli O157 Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ đĩa thạch dinh dưỡng, nghiền vi khuẩn giọt nước NaCl 8,5% cho thu huyền phù đục đồng Thêm giọt kháng huyết E.coli O157, trộn Kết quả: vòng phút, thấy xuất hiện tượng dính kết có nghĩa phản ứng dương tính, không dính kết phản ứng âm tính 6.5.3.3 Nhận dạng dương tính Các vi khuẩn cho phản ứng dương tính với indol với kháng huyết O157 O157 cộng với kháng huyết H7 coi vi khuẩn dương tính 6.6 Đặc trưng khác Để nhận dạng khuẩn lạc dương tính cho việc phát kháng nguyên roi đặc tính gây bệnh, cần gửi chủng tới phòng thử nghiệm chuẩn Đảm bảo chất lượng 7.1 Kiểm tra chủng mục đích đảm bảo chất lượng Các chủng E.coli O157 không mang yếu tố độc thuộc loại gây bệnh có sẵn từ quan lưu giữ vi khuẩn quốc tế quốc gia Các chủng dùng để kiểm tra đảm bảo chất lượng môi trường kháng huyết 7.2 Phương pháp cấy Để kiểm tra khả phòng thử nghiệm môi trường để phát số lượng nhỏ E.coli O157 mẫu thực phẩm cần thử nghiệm phương pháp mô tả tiêu chuẩn này, mẫu đối chứng có lượng nhỏ dịch cấy E.coli O157 không gây bệnh lượng lớn dịch cấy chủng E.coli khác cần thực song song với mẫu thử Biểu thị kết Theo phần diễn giải kết quả, ghi lại có mặt hay mặt Escherichia coli O157 phần mẫu thử, tính theo gam theo mililit Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - Nhiệt độ ủ sử dụng; - Mọi chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - Các kết thử nghiệm thu Báo cáo kết phải nêu rõ phép thử thực phòng thử nghiệm chuẩn, thực nêu kết thu Một số môi trường nuôi cấy Môi trường Macconkey sorbitol telurit xefixim (CT-SMAC) 1.1 Môi trường Thành phần Dịch thủy phân casein enzym 17,0 g Dịch thủy phân đậu tương enzym 3,0 g Sorbitol 10,0 g Muối mật No.3 1,5 g NaCl 5,0 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,001 g Thạch 9g đến g Nước 1000 ml Pha chế Hòa tan thành phần môi trường hoàn chỉnh khô nước đun sôi Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,1 ± 0,2 25oC, cần Khử trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 121oC/15 phút 1.2 Dung dịch kali telurit Thành phần Kali telurit 0,25 g Nước 100 ml Pha chế Hòa tan kali telurit nước lọc qua màng lọc để khử trùng Bảo quản: tháng nhiệt độ oC ± oC, xuất kết tủa trắng loại bỏ 1.3 Dung dịch xefixim Thành phần Xefixim 5,0 mg Nước 100 ml Cách pha Hòa tan xefixim nước lọc qua màng lọc để khử trùng Chú ý: Xefixim cần phải hòa tan etanol Dung dịch bảo quản tuần nhiệt độ oC ± oC 1.4 Môi trường hoàn chỉnh Thành phần Môi trường 1000 ml Dung dịch kali telurit 1,0 ml Dung dịch xefixim 1,0 ml Pha chế Làm nguội môi trường khử trùng đến nhiệt độ khoảng từ 44oC đến 47oC, cho ml dung dịch kali telurit ml dung dịch xefixim vào 1000 ml môi trường Nồng độ cuối kali telurit 2,5 mg/l xefixim 0,05 mg/l Bảo quản: môi trường bảo quản tuần nhiệt độ oC ± oC Thạch dinh dưỡng Thành phần Cao thịt 3,0 g Pepton 5,0 g Thạch 9g đến 18g Nước 1000 ml Pha chế Hòa tan thành phần môi trường hoàn chỉnh khô nước cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 25oC, cần Phân phối môi trường vào bình có dung tích thích hợp Khử trùng nồi hấp áp lực 121oC/15 phút Bảo quản: môi trường bảo quản tuần nhiệt độ oC ± oC Môi trường trypton/tryptophan Thành phần Sản phẩm thủy phân casein emym 10 g DL-Tryptophan g NaCl 10 g Nước 1000 ml Pha chế Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần lọc Chuyển lượng môi trường ml vào ống nghiệm Khử trùng 121oC/15 phút Canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB+N) 4.1 Canh thang đậu tương trypton cải biến Thành phần Dịch thủy phân casein enzym 17 g Dịch thủy phân đậu tương enzym g D(+)-glucose 2,5 g Muối mật No.3 1,5 g NaCl 5,0 g K2HPO4 4,0 g Nước 1000 ml Pha chế Hòa tan thành phần môi trường hoàn chỉnh khô nước, cách đun nóng, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH= 7,4 ± 0,2 25oC, cần Phân phối môi trường vào bình có dung tích thích hợp Khử trùng nồi háp áp lực 121oC/15 phút 4.2 Dung dịch novobioxin Thành phần Novobioxin 0,45 g Nước 100 ml Pha chế Hòa tan novobioxin nước lọc qua màng lọc để khử trùng Chuẩn bị ngày sử dụng 4.3 Môi trường hoàn chỉnh Ngay trước sử dụng, cho 1ml ml dung dịc novobioxin vào 225 900 ml môi trường mTSB nguội Nồng độ cuối mTSB 20mg/l Thuốc thử kovacs Thành phần : 4-dimethylaminbenzaldehyd 5g 2-metylbutan-1-ol pentan 75ml Acid clohydric (p20 1.18 đến 1.19 g/ml 25ml Pha chế : Hòa tan 4-dêmthylaminbenzaldehyd cồn bắng cách đun nóng nhẹ nồi cách thủy trì nhiệt độ 50-550C , làm nguội thêm acid Bảo quản : tránh ánh sáng , nhiệt độ 40C Thuốc thử phải có màu vàng nhạt hoăc nâu nhạt Dung dịc đệm rửa: duung dịch đệm phosphat cải biến 0,01mol/l, pH 7,2 Thành phần NaCl g KCl 0,2 g Na2HPO4 (khan) 1,44 g KH2PO4 (khan) 0,24 g Polyoxyetylen sorbitan monolaurat 0,2 ml Nước 1000 ml Pha chế Hòa tan thành phần nước Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 25oC, cần Phân phối môi trường vào bình cầu có dung tích thích hợp Khử trùng nồi háp áp lực 121oC/15 phút  ... trường để phát số lượng nhỏ E. coli O157 mẫu thực phẩm cần thử nghiệm phương pháp mô tả tiêu chuẩn này, mẫu đối chứng có lượng nhỏ dịch cấy E. coli O157 không gây bệnh lượng lớn dịch cấy chủng E. coli. .. thạch chọn lọc nhận dạng khuẩn lạc E. coli O157 6.4.1 Cấy lên đĩa Sử dụng pipet man, hút 50 µl hạt từ tính hòa lại rửa vào đĩa thạch Macconkey sorbitol telurit xefixim làm khô 50 µl vào đĩa môi... từ tính miễn dịch kháng Escherichia coli O157; - Ống nghiệm chất dẻo kiểu Eppendorf; - Bộ trộn quay: có khả quay với tốc độ 15 vòng/phút đến 20 vòng/phút; - Máy trộn vortex 4.2 Môi trường nuôi