quy trình phân tích xác định shigella trong mẫu thực phẩm: tổng quan, loài , uy trình phân tích, các bước tiến hành, test sinh hóa, khẳng định kháng huyết thanh, môi trường phân lập, biến đổi trong quá trình phân lập cũng như định danh, biểu hiện cơ bản của shigella trong môi trường phân lập, tân sinh chọn lọc, mãu sắc biến đổi test sinh hóa, biểu hiện kháng huyết thanh
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NHÓM: 10 Quy trình định tính Shigella GVHD: Danh sách sinh viên: Trần Thị Diễm Kiều 2005140251 Nguyễn Phương Hồng Thúy 2005140591 Võ Thị Thu 2006140329 4.Nguyễn Hồng Ngọc 2006140213 5.Nguyễn Thị Ánh tuyết 2006140393 1.Tình hình ngộ độc TP Đặc điểm vi khuẩn Shigella NỘI DUNG CHÍNH Nguyên tắc Môi trường hóa chất Quy trình phân tích Bước tiến hành I Tình hình ngộ độc Thực phẩm • • • Lỵ Shigella bệnh phổ biển, tỷ lệ mắc bệnh tử vong cao Hàng năm có 165 triệu đợt lỵ : 99% nước phát triển, 69% trẻ em tuổi Trong 1,1 triệu người bị tử vong Shigella nước phát triển 60% trẻ tuổi Theo nhóm huyết thanh: • • Ở nước phát triển: S.flexnerie; S.sonnei; S.dysenteriae S.boydii Ở nước phát triển: S.sonnei; S.flexnerie; S.dysenteriae S.boydii Theo tuyp huyết thanh: Các địa dư khác phân phó theo tuyp huyết khác II Đặc điểm vi khuẩn Shigella - Những trực khuẩn gram âm dài 1-3 m - Không sinh nha bào, không di động hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi Thuộc họ enterobacteriaceae - o Topt 37 C phát triển T 8-40 C - pHopt 7,8 phát triển pH 6,6 -8, - Các Shigella có nội độc tố số có ngoại độc tố + Nội độc tố: Nội độc tố có tính độc mạnh, kháng nguyên yếu tác dụng chủ yếu gây phản ứng ruột + Ngoại độc tố: Ngoại độc tố có tính độc cao, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh trung ương Hình thể tính chất bắt màu • Shigelia có dạng hình que thẳng dài 1-3 m, lông, không di động, vỏ, không sinh bào tử, bắt màu Gram âm Shigella flexneri Shigella dưới kính hiển vi Đặc điểm sinh hóa khác Hầu hết loài không lên men tạo axit từ lactose, saccarose (trừ S sonnei lên men chậm sau 48 giờ) Không có enzym lysine decarboxylase => Có phản ứng LDC âm tính Lên men đường mannitol (trừ S dysenteria) Lên men đường glucose không sinh (trừ S.Flexneri 6, S Boydii 14 sinh yếu) Không có khả sử dụng citrate molonate Không sinh indol Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae nên có tính chất chung họ oxydase (-), glucose (+) Không làm lỏng gelatin PHÂN LOẠI Shigella − Shigella có kháng nguyên thân O, kháng nguyên H Dựa vào kháng nguyên O Nhóm A: Nhóm B: Nhóm C: Nhóm D: S dysenteria (có 10 typ huyết S flexneri (có typ huyết S boydii (có 15 typ huyết thanh) S soinnei (chi có typ huyết thanh; S.shiga có typ huyết typ huyết phụ) tính chất sinh hoá, Shigella chia thành nhóm với nhiều typ huyết thanh: typ huyết phụ) + thanh) Nhóm A: S.dysenteriae: có 15 typ huyết thanh, đáng ý S.dysenteriae typ (Sh.shiga) + + + thanh) Nhóm B: S.flexneri (có typ huyết thanh) Nhóm C: S.boydii (có 19 typ huyết thanh) Nhóm D: S.sonnei (có typ huyết thanh) III Nguyên tắc xác định Shigella Tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc o Phần mẫu thử cấy vào canh thang Shigella có chứa novobioxin 0,5 µg/ml, ủ kỵ khí 41,5 C ± oC 16h-20h Đổ đĩa nhận biết khuẩn lạc Cấy dịch cấy tăng sinh thu vào ba môi trường phân biệt chọn lọc: thạch MacConkey agar có tính chọn lọc thấp; thạch XLD o agar có tính chọn lọc trung bình thạch Hektoen enteric agar có độ nhạy cao Tất đĩa ủ 37 C 20h-24h Khẳng định thử ngiệm sinh hóa kháng huyết Sau thời gian ủ, khuẩn lạc điển hình nghi ngờ môi trường từ ba môi trường thạch chọn lọc kiểm tra khẳng định sinh hóa kháng huyết 6.1 Tăng sinh chọn lọc Môi trường canh thang shigella - Dịch thủy phân casein enzym 20,0 g Lấy Lấy 25g 25g mẫu mẫu cho cho vào vào túi túi dập dập mẫu, mẫu, thêm thêm 225ml 225ml canh canh thang thang shigella shigella bổ bổ - Kalihydrophosphat (khan) sung sung thêm thêm 5ml 5ml Novobioxin Novobioxin 2,0 g - Kali dihydrophosphat (khan) 2,0 g - Natri clorua 5,0 g - D (+)-GlucozaĐồng mẫu (không phút), đo chỉnh pH 7± 0,2 1,0 g - Polyoxyetylensorbitan monooleat (Tween 80) 1,5 ml - Nước - Novobioxin 000 ml o Buộc chặt túi đem ủ 47 C 16- 20 5ml 6.2 Phân lập Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên môi trường thạch đĩa chọn lọc : XLD agar, Hektoen enteric agar MacConkey agar o Sau cấy,lật ngược đĩa, ủ đĩa 37 C 24h lấy xem Kết MÔI TRƯỜNG MAC Thạch MacConkey - Dịch thủy phân casein mô động vật enzym a Shigella sonnei 20,0 g Không màu đến hồng nhạt, mờ, lactoza âm tính 10,0 g - Lactoza Lactoza 1,5 g Muối mật 5,0 g - Muối mật - Natri clorua - Đỏ trung tính Shigella, loài khác - Tím thể tính Đỏtinh trung - Thạch Tím tinh thể - Nước Không màu, 0,03 mờ,g lactoza âm tính 0,001 g g đến 18 g 000 ml a MÔI TRƯỜNG XLD Thạch XLD - Chất chiết nấm men 3,0 g 5,0 g Trong hồng suốt,màu giống - L-lysin HCl - Xyloza thạch tâm đen - Lactoza - Sacaroza - Natri clorua - Natri deoxycholat - Natri thiosulfat - Sắt (III) amoni xitrat - Đỏ phenol Đỏ phenol - Thạch - Nước 3,75 g 7,5 g 7,5 g 5,0 g 1,0 g 6,8 g 0,8 g 0,08 g g đến 18 g 000 ml a MÔI TRƯỜNG HE Thạch HE Sản phẩm thủy phân thịt 12,0 g enzym Màu xanh khuẩn lạc tăng ẩm ướt - Chất chiết nấm men 12,0 g - Lactoza Lactoza - Sacaroza 9,0 g - Muối mật 5,0 g - Natri clorua - Natri thiosulfat - Sắt (III) amoni xitrat Sắt (III) amoni xitrat - Axit fucxin - Xanh bromothymol - Nước 12,0 g 2,0 g - Salixin - Thạch 3,0 g Xanh bromothymol 5,0 g 1,5 g 0,1 g 0,065 g 12 g đến 18 g 000 ml a 6.3 Phục hồi Chọn khuẩn lạc cấy môi trường không chọn lọc (NA/TSA) TH1: từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp thid kết luận phát Shigella mẫu Nếu khuẩn lạc điển hình ủ thêm 24h Chọn ủ môi trường không chọn lọc NA/TSA TH2: khuẩn lạc cho kết sinh hóa không phù hợp Tiến hành thử khuẩn lạc lại Test sinh hóa 6.4 Test sinh hóa + kháng huyết Vùng cấy Biểu Cho thấy Thạch sắt ba đường (thạch nghiêng TSI) Màu không - Cấy đâm sâu cấyvàng vạch trêncóbềmàu mặtđen thạch nghiêng Lên men glucoza: dương tính o không rạn đâmđĩa sâutrong không -Cấy Ủ tủ bọt 37 khí C 24h đếnkhông 48h Sinh khí nứt Diễn giải thay đổi môi trường sau Cấy bề mặt nghiêng : Màu đỏ không đổi màu Không sử dụng lactoza sacaroza: âm tính dinh dưỡng nửa đặc để dùng cho phép thử Thạch tính di động • • • • Dùng kim cấy cấy đâm sâu khuẩn lạc vào thạch dinh dưỡng nửa đặc Ủ tủ 37 oC ± oC 18 h đến 24 h Kiểm tra đường cấy phát triển lan rộng Các vi sinh vật không di động cho đường rời rạc; chủng di động phát triển phân tán xung quanh đường cấy Tất loài Shigella không di động 6.4 Test sinh hóa + kháng huyết Thạch ure - Cấy ria bề mặt thạch - Ủ tủ 37 oC 24 h ± h - Thuốc thử: phenol red Nếu ure bị thủy phân có màu hồng đến hồng đậm giải phóng amoniac từ việc phân hủy ure với đổi màu chất thị pH Khi đổi màu thạch chứng tỏ phản ứng âm tính Các loài Shigella không thủy phân ure.=> âm tính Môi trường L-Lysin decacboxylaza (LDC) Cấy phía bề mặt canh thang Thuốc thử: bromocresol đỏ tía Ủ tủ 37 oC 24 h Sau thời gian ủ: – Thấy đục đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính – Màu vàng phản ứng âm tính Các loài Shigella không khử nhóm carboxyl lysin CHÚ THÍCH: Sử dụng parafin phủ lên ống đảm bảo điều kiện kỵ khí 6.4 Test sinh hóa + kháng huyết Loại trừ chủng tự ngưng kết: Nhỏ giọt NaCl 0,85% lên lam kính Dùng que cấy lấy Khuẩn lạc lên lam kính Lắc nhẹ 30-60 giây Nếu thấy có hạt ngưng kết không tiếp tục thử tiếp 6.4 Test sinh hóa + kháng huyết Ngưng kết với kháng nguyên O: • • • Làm tương tự, thay NaCl kháng nguyên O đa giá Nếu có ngưng kết tiếp tục thử với kháng nguyên (A,B,C,D) Nếu có kháng nguyên bề mặt K: đun sôi dịch 30 phút, sau tiến hành lại từ biết thử nghiệm kháng nguyên O Các loài vi khuẩn Thạch chọn lọc Thạch MacConkey Shigella sonnei a Thạch XLD Thạch Hektoen Không màu đến hồng Trong mờ, có tâm màu Màu xanh lam và các nhạt, mờ, lactoza đỏ/đỏ hồng, màu khuẩn lạc tăng ẩm âm tính ướt giống thạch Shigella, loài khác Không màu, trong mờ, Trong mờ, có tâm màu Màu xanh lam và ẩm lactoza âm tính đỏ/đỏ hồng, màu giống ướt thạch tất môi trường có khuẩn lạc tròn có bề mặt trơn nhẵn viền mép liền Phép thử Thử nghiệm TSI Tính di động Ureaza L-Lysin decacboxylaza Biểu - Trên đỏ dưới vàng không đen không rạn nứt - Đường cấy rời rạt không lan rộng - Không đổi màu môi trường - Màu vàng CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE CHÀO TẠM BIỆT!!!