Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

Header Page of 258 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Quá trình sinh máu 1.1.1 Cơ quan sinh máu 1.1.2 Quá trình sinh máu 1.2 Bệnh bạch cầu cấp 1.2.1 Khái niệm chung .3 1.2.2 Dịch tễ học .3 1.2.3 Các nguyên nhân gây bệnh 1.2.4 Cơ chế bệnh sinh 1.2.5 Phân loại 1.2.6 Đặc điểm lâm sàng 1.2.7 Đặc điểm xét nghiệm 1.3 Tình hình nghiên cứu giới nhuộm hóa học tế bào 1.3.1 Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS) .9 1.3.2 Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER) 10 1.3.3 Kỹ thuật nhuộm sudan B 11 1.3.4 Kỹ thuật nhuộm esteraza 11 1.3.5 Kỹ thuật nhuộm photphataza 13 1.4 Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào y học 14 1.5 Nghiên cứu nước nhuộm hóa học tế bào .23 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn .28 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu .28 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2.2 Phương pháp thu thập mẫu số liệu 28 2.2.3 Kỹ thuật nghiên cứu .29 2.2.4 Xử lý số liệu 30 Footer Page of 258 Header Page of 258 2.2.5 Biện pháp hạn chế sai số 30 2.2.6 Thời gian địa điểm nghiên cứu 30 2.3 Thực nghiệm 30 2.3.1 Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc hóa chất nghiên cứu 30 2.3.2 Quy trình nhuộm hóa học tế bào 32 2.3.3 Đánh giá kết 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu .37 3.2 Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho 39 3.2.1 Đặc điểm chung nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho 39 3.2.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng kit nhuộm HICYTEC 41 3.2.3 Kết nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho .47 3.3 Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy 48 3.3.1 Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính tuổi 48 3.3.2 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết chẩn đoán Viện Huyết học-Truyền máu trung ương 50 3.3.3 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ kit nhuộm HICYTEC 51 3.3.4 Mức độ phù hợp chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy kít HICYTEC kết luận viện Huyết học-Truyền máu TW 53 3.4 Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T) 62 3.5 Kết nhuộm photphataza kiềm bạch cầu 67 3.6 Kết nhuộm sắt mẫu tủy bệnh nhân bạch cầu cấp Viện HHTM trung ương .69 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 Footer Page of 258 Header Page of 258 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Tên viết tắt ALL Tên Tiếng Việt Tên Tiếng Anh Bệnh bạch cầu cấp dòng Acute lymphoblastic lympho leukemia AML Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloid leukemia BCC Bạch cầu cấp Leukemia CE Cacboxyl esteraza Carboxyl esterase CS Cộng et al CD Dấu ấn miễn dịch Cluster of Differenciation FAB HHTB HLA - DR 10 LA 11 L1 12 L2 13 L3 14 M0 15 M1 16 M2 Footer Page of 258 Hội nhà huyết học Pháp Mỹ - Anh French - American - British Nhuộm Hóa học tế bào Cytochemistry Kháng nguyên bạch cầu người Human Leukocyte antigen Bệnh bạch cầu cấp Acute leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho biệt hóa Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chưa biệt hóa Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt Homogenous small blast type Heterogenous blast type Homogenous lager blast type Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Minimally differentiated biệt hóa tối thiếu acute myeloid Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy Acute myeloblastic leukemia, tế bào trưởng thành without maturation Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có Acute myeloblastic leukemia, tế bào trưởng thành with granulocytic maturation Header Page of 258 17 M3 18 M4 19 M5 20 M6 21 M7 22 NE 23 NE - NaF 24 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy Acute promyelocytic leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy - Acute myelomonocytic mono leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng mono Acute mono Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu Acute erythroid leukemia Bệnh bạch cầu cấp dòng Acute megakaryoblastic tiểu cầu leukemia Esteraza không đặc hiệu Non-specific esterase Esteraza không đặc hiệu ức chế Non-specific esteraza - NaF NaF inhibitor PA Photphataza axit Acid photphatase 25 PAL Photphataza kiềm Alkaline photphatase 26 PAS Periodic Axit Schiff Periodic -Acid - Schiff 27 PER Peroxydaza Peroxidase 28 SD Sudan đen Sudan black 29 SLTBT Số lượng tế bào tủy The number of myeloid cells 30 WHO Tổ chức Y tế giới World Heath Organization Footer Page of 258 Header Page of 258 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Glycogen bị oxi hóa axit periodic thành diandehit .9 Hình 1.2 Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit Hình 1.3 H2O2 bị khử xúc tác peroxidaza tạo oxi nguyên tử .10 Hình 1.4 Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl .10 Hình 1.5 Thủy phân chất este thành naphtol .11 Hình 1.6 Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo 12 Hình 1.7 Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol 14 Hinh 1.8 Quy trình thường quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo FAB 27 Hình 3.1 Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi giới tính .38 Hình 3.2 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp 39 Hình 3.3 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi .40 Hình 3.4 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy bệnh nhân Doãn Hữu T- thể L1 42 Hình 3.5 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy bệnh nhân Nguyễn Hữu T - thể L2 42 Hình 3.6 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 43 Hình 3.7 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Nguyễn Hiền A- Thể L2 .43 Hình 3.8 Ảnh nhuộm PER mẫu tủy bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 44 Hình 3.9 Ảnh nhuộm PER mẫu tủy bệnh nhân Nguyễn Hữu T- Thể L2 44 Hình 3.10 Ảnh nhuộm SD mẫu tủy bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 .44 Hình 3.11 Ảnh nhuộm SD mẫu tủy bệnh nhân Nguyễn Hữu T - Thể L2 44 Hình 3.12 Ảnh nhuộm photphataza axit 48 Hình 3.13 Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy theo độ tuổi giới 50 Hình 3.14 Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp theo kết chẩn đoán Viện Huyết học - Truyền máu trung ương 51 Hình 3.15 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Vũ Thị Ng-thể M1 .55 Hình 3.16 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy Vũ Thị Ng-thể M1 .55 Hình 3.17 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy Vũ Thị Ng-thể M1 55 Hình 3.18 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy Vũ Thị Ng-thể M1 .55 Footer Page of 258 Header Page of 258 Hình 3.19 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Bùi Thị T - thể M2 .56 Hình 3.20 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Hồ Ngọc A - thể M2 56 Hình 3.21 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy Đào Minh H-thể M2 56 Hình 3.22 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy Đào Minh H-thể M2 .56 Hình 3.23 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Nguyễn Văn T-thể M3 .57 Hình 3.24 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Hà Thị Thu H-thể M4 57 Hình 3.25 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy Hà Thị Thu H-thể M4 57 Hình 3.26 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy Hà Thị Thu H-thể M4 58 Hình 3.27 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy Hà Thị Thu H-thể M4 58 Hình 3.28 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Trần Thị T-thể M5a 58 Hình 3.29 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Đặng Thị Thu M-thể M5b 58 Hình 3.30 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Dương Quang T-thể M6 59 Hình 3.31 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy Dương Quang T-thể M6 59 Hình 3.32 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Nguyễn Thanh T- Thể M0 60 Hình 3.33 Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy Nguyễn Thanh T- Thể M0 60 Hình 3.34 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy Nguyễn Thanh T 60 Hình 3.35 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy Nguyễn Thanh T 60 Hình 3.36 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy Nguyễn Thanh T 60 Hình 3.37 Ảnh nhuộm esteraza đặc mẫu tủy hiệu Nguyễn Thanh T 60 Hình 3.38 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P .61 Hình 3.39 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P .61 Hình 3.40 Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P 62 Hình 3.41 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P 62 Hình 3.42 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P 62 Hình 3.43 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P 62 Hình 3.44 Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy bệnh nhân Lý Trọng Đ 64 Hình 3.45 Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 64 Footer Page of 258 Header Page of 258 Hình 3.46 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 64 Hình 3.47 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 64 Hình 3.48 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 65 Hình 3.49 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C .65 Hình 3.50 Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 65 Hình 3.51 Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 65 Hình 3.52 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 66 Hình 3.53 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C .66 Hình 3.54 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy Trương Thị T 66 Hình 3.55 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 66 Hình 3.56 Ảnh nhuộm photphataza kiềm mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 68 Hình 3.57 Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 68 Footer Page of 258 Header Page of 258 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Biến đổi di truyền tiên lượng bạch cầu cấp dòng lympho Bảng 1.2 Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB Bảng 1.3 Phân loại tế bào lympho thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker di truyền 16 Bảng 1.4 Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker di truyền 19 Bảng 1.5 Quy trình kỹ thuật bước nhuộm đơn 24 Bảng 2.1 Thành phần kít nhuộm hóa học tế bào .31 Bảng 2.2 Pha chế dung dịch nhuộm 32 Bảng 2.3 Nhuộm glycogen biệt hóa 33 Bảng 2.4 Nhuộm nhân 34 Bảng 2.5 Nhuộm tăng màu 34 Bảng 2.6 Đánh giá kết định tính .35 Bảng 2.7 Đánh giá kết bán định lượng 36 Bảng 3.1 Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp 37 Bảng 3.2 Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính 38 Bảng 3.3 Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính 39 Bảng 3.4 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 41 Bảng 3.5 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ kít HICYTEC kết chẩn đoán xác định Viện Huyết học-Truyền máu trung ương bệnh nhân 46 Bảng 3.6 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 46 Bảng 3.7 Kết nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T 47 Bảng 3.8 Bảng phân bố bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính 49 Bảng 3.9 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính .49 Bảng 3.10 Kết phân loại thể bệnh kit nhuộm HICYTEC .51 Bảng 3.11 Kết chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy kít HICYTEC kết luận viện Huyết học-Truyền máu TW đôi 53 Bảng 3.12 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy 63 Bảng 3.13 Kết nhuộm photphataza kiềm bệnh nhân bạch cầu cấp 67 Bảng 3.14 Kết nhuộm Perls mẫu tủy bị bệnh bạch cầu cấp 68 Footer Page of 258 Header Page of 258 MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp nhóm bệnh máu ác tính hệ thống tạo máu với đặc trưng tăng sinh tích tụ tế bào non máu tủy xương Bạch cầu cấp chia thành nhóm bạch cầu cấp dòng tủy bạch cầu cấp dòng lympho Bạch cầu cấp dòng tủy kết tích lũy tế bào non bất thường tủy xương Bạch cầu cấp dòng lympho bệnh tăng sinh ác tính trình tạo máu dòng lympho Những tế bào lấn át sinh máu bình thường tủy xương, chúng thoát máu ngoại vi thâm nhiễm vào quan nội tạng [23] Bệnh có hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng dẫn tới tử vong không phát điều trị kịp thời Vì vậy, việc xác định xác thể bệnh dòng tế bào bị ung thư có vai trò định điều trị Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào thể bệnh bạch cầu cấp dựa hai tiêu chuẩn FAB WHO Tiêu chuẩn FAB nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa năm 1976 tổng hợp kết hình thái học hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn bổ sung thêm kết miễn dịch di truyền [15, 17] Nhuộm hóa học tế bào gồm kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế NaF không ức chế, photphataza kiềm axit Ưu điểm phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành 1/4 so với phương pháp miễn dịch 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc đại, dễ triển khai Hiện nay, kít nhuộm có bán thị trường kít đơn, giá thành cao có nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu kỹ thuật nhuộm Sudan Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu nhiều lần Tại Việt Nam, thuốc thử hầu hết tự pha kết hợp với yếu điểm nên độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Theo Trần Ngọc Vũ cộng (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán hình thái học-hóa học tế bào miễn dịch 89,1%, giá trị dự báo bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 88,88% độ đặc Footer Page of 258 Header Page 10 of 258 hiệu 73,77% [25] Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa phương pháp nhuộm hóa học cần phải có điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch di truyền [19] Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an nghiên cứu chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls Bộ kít khắc phục yếu điểm Nhằm đánh giá giá trị sử dụng kít, tiến tới thay hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết Mục tiêu đề tài là: Đánh giá phù hợp kít nhuộm hóa học tế bào phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học di truyền bệnh nhân bạch cầu cấp chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986) Nội dung nghiên cứu:  Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp bệnh nhân chọc tủy lần đầu Viện Huyết học-Truyền máu trung ương  Đánh giá tính phù hợp phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch di truyền bệnh nhân chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB  Đánh giá giá trị kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC, nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp Footer Page 10 of 258 Header Page 70 of 258 Hình 3.40 Ảnh nhuộm sudan B Hình 3.41 Ảnh nhuộm esteraza mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P Hình 3.42 Ảnh nhuộm esteraza không Hình 3.43 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P Hình ảnh nhuộm hóa học tế bào kỹ thuật nhuộm CE, SD B, peroxidaza, NE-NaF mẫu tủy bệnh nhân Đỗ Thị P chụp kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.000 lần cho thấy tế bào dòng tủy lên dương tính ít, tiêu tủy cho thấy hầu hết hình ảnh tế bào blast dòng mono Kết phù hợp với chẩn đoán thể bệnh bệnh nhân Đỗ Thị P thể M5a (85% tế bào mono blast) theo tiêu chuẩn FAB 3.4 Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T) Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tuỷ kít HICYTEC kết chẩn đoán xác định Viện Huyết học-Truyền máu trung ương bệnh nhân thể bảng 3.12 62 Footer Page 70 of 258 Header Page 71 of 258 Bảng 3.12 Kết phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy TT Mã BN Họ tên Năm sinh Ngày XN Kết luận Kết luận viện thể bệnh HH-TM sử dụng kit TW HICYTEC 15011531 Lý Trọng Đ 2009 21/05/2015 Lai L-T Lai L-T 15011862 Lê Tiến N 2012 13/05/2012 Lai L-T Lai L-T 15009743 Trần Văn C 1989 08/05/2015 Lai L-T Lai L-T 497 Đỗ Hoàng P 1986 25/04/2015 Lai L-T Lai L-T 1940 09/04/2015 Lai L-T Lai L-T 15008086 Ngô Quang C Kết nhuộm hóa học tế bào kít nhuộm HICYTEC cho thấy có trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy chiếm 8,3% (xem bảng 3.4) Tỷ lệ cao so với nghiên cứu Nguyễn Triệu Vân cs (2004) bạch cầu cấp thể lai tủy-lympho chiếm 6,2% [22] Đây thể hỗn hợp dòng tế bào dòng lympho dòng tủy Khó khăn lớn việc phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tủy sử dụng phương pháp hình thái học - hóa học tế bào dùng để phân loại thể bệnh tỷ lệ tế bào dòng lympho dòng tủy biến động mẫu tủy Một số tế bào đột biến số chất hóa học enzym nguyên sinh chất tế bào nên dẫn đến không nhận định kết Dưới số hình ảnh thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho - tủy: Hình 3.44 3.45, ảnh nhuộm Giemsa với độ phóng đại 1.000 lần bệnh nhân bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy (bệnh nhân Lý Trọng Đ Trần Văn C) cho thấy tiêu tế bào blast tủy hỗn hợp dòng lympho dòng tủy Ở hình 3.44, tế bào blast dòng lympho có kích thước nhỏ so với tế bào dòng tủy, kích thước to nhỏ không đều, nhân không đồng nhất, số tế bào blast lympho có hạt nhân nhìn rõ, tỷ lệ nhân bào tương lớn, bào tương ưa bazơ đậm Blast lympho chiếm số lượng nhiều blast dòng tủy Hình 3.45, lam nhuộm Giemsa tế bào blast tủy chiếm số lượng có kích thước lớn 63 Footer Page 71 of 258 Header Page 72 of 258 nhiều lần so với tế bào blast lympho, nhân không đồng nhất, tỷ lệ nhân bào tương thấp, bào tương ưa bazơ Hình 3.44 Ảnh nhuộm Giemsa Hình 3.45 Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy bệnh nhân Lý Trọng Đ mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C Trên hình 3.46 3.47 ảnh nhuộm PAS với độ phóng đại 1.000 lần bệnh nhân bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Trương Thị T Trần Văn C) Hình 3.46, cho thấy tế bào blast dòng tủy dương tính lan tỏa màu đỏ tươi mịn không thành hạt Các tế bào blast dòng lympho dương tính PAS dạng hạt nhỏ nằm rìa nguyên sinh chất tế bào Trên hình 3.47, tương tự hình 3.46 tiêu nhuộm giemsa xuất hai loại tế bào blast dòng tủy lympho Các tế bào blast lympho dương tính với kỹ thuật nhuộm PAS, hạt to phân bố bào tương giả túc tế bào; bên cạnh số tế bào dòng tủy dương tính lan tỏa hồng cầu màu xanh thuộc tế bào dòng tủy Hình 3.46 Ảnh nhuộm PAS Hình 3.47 Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 64 Footer Page 72 of 258 Header Page 73 of 258 Hình 3.48 3.49 ảnh nhuộm peroxidaza bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lai lympho - tủy Các tế bào blast dòng tủy dương tính mạnh có màu vàng nâu bào tương Các tế bào blast lympho âm tính không bắt màu vàng nâu nguyên sinh chất Hình 3.48 Ảnh nhuộm peroxidaza Hình 3.49 Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C Hình 3.50 3.51 ảnh nhuộm Sudan bệnh nhân bạch cầu cấp lai lympho - tủy Các tế bào blast dòng tủy cho kết dương tính mạnh, có nhiều hạt to màu đen bào tương chí che kín nhân tế bào Trên tiêu có tế bào blast dòng lympho cho kết âm tính Hình 3.50 Ảnh nhuộm Sudan B Hình 3.51 Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 65 Footer Page 73 of 258 Header Page 74 of 258 Trên hình 3.52 3.53 kết nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu lai lympho-tủy Các tế bào blast dòng tủy bắt màu đỏ đậm nguyên sinh chất xen lẫn tế bào blast dòng lympho cho kết âm tính Hình 3.52 Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu Hình 3.53 Ảnh nhuộm esteraza đặc mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T hiệu mẫu tủy bệnh nhân Tr Văn C Phản ứng esteraza không đặc hiệu không đặc hiệu ức chế NaF để phân định dòng mono dòng hạt Hình 3.54 3.55 hình ảnh nhuộm bệnh nhân bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy Các tế bào lai lympho không bị ức chế chất, tế bào lai dòng tủy bị ức chế Hình 3.54 Ảnh nhuộm esteraza không đặc Hình 3.55 Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy bệnh nhân hiệu mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C Trương Thị T 66 Footer Page 74 of 258 Header Page 75 of 258 Qua phản ứng nhuộm trên, vi trường vừa có tế bào blast nhuộm dương tính với dòng lympho (PAS) tế bào blast nhuộm dương tính với dòng tủy (peroxidaza, sudanB esteraza đặc hiệu), điều chứng tỏ mẫu tủy xuất tế bào blast hai dòng tủy lympho gọi thể lai lympho-tủy 3.5 Kết nhuộm photphataza kiềm bạch cầu Bảng 3.13 Kết nhuộm photphataza kiềm bệnh nhân bạch cầu cấp Điểm nhuộm Số lượng Tỷ lệ 146 1,7% Tổng 60 100% Trong tổng số 60 trường hợp chẩn đoán bạch cầu cấp hầu hết giảm điểm nhuộm (71,7%) 20 điểm, có trường hợp tăng điểm có định hướng nhiễm trùng (xem Bảng 3.13) Nhuộm photphataza kiềm bạch cầu dùng để phân biệt bệnh bạch cầu kinh bệnh bạch cầu cấp hội chứng nhiễm trùng bạch cầu đơn nhân Nếu bệnh bạch cầu kinh thường có tượng giảm điểm nhuộm (có thể giảm đến mức điểm Trong trường hợp bạch cầu cấp điểm nhuộm mẫu tuỷ thường nằm mức giảm vừa có tăng cao tế bào blast Nếu trường hợp bị nhiễm trùng (một triệu chứng bệnh) điểm nhuộm mẫu tăng lên dấu giúp bác sỹ lâm sàng theo dõi tiên lượng bệnh Tuy vậy, biến động lớn tế bào thành phần tế bào mẫu tuỷ bệnh nhân bạch cầu cấp nên xét nghiệm thường có giá trị có giá trị theo dõi mang tính động học [40] Hình 3.56 thể phản ứng nhuộm photphataza kiềm dương tính, nguyên sinh chất tế bào bắt màu đỏ nhân hồng cầu màu xanh 67 Footer Page 75 of 258 Header Page 76 of 258 Hình 3.56 Ảnh nhuộm photphataza kiềm mẫu tủy bệnh nhân Trần Văn C 3.6 Kết nhuộm sắt mẫu tủy bệnh nhân bạch cầu cấp Viện HH-TM trung ương Bảng 3.14 Kết nhuộm Perls mẫu tủy bị bệnh bạch cầu cấp Giới Số trường hợp Tỷ lệ Có tế bào mạng lưới nội mô sắt 10,0% Không có tế bào mạng lưới nội mô sắt 54 90,0% 60 100% Tổng Nhuộm sắt (Perls) phát nguyên hồng cầu sắt tế bào mạng lưới nội mô sắt [42] (hình 3.57) Kết nhuộm Perls kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC cho thấy 60 bệnh nhân bạch cầu cấp có trường hợp (chiếm 10,0%) có tế bào mạng lưới nội mô sắt (xem bảng 3.14) Theo Elisabeth Rybo cs tế bào mạng lưới nội mô sắt có giá trị theo dõi tình trạng ứ sắt tốt so với nguyên hồng cầu sắt [50] Hình 3.57 Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt mẫu tủy bệnh nhân Trương Thị T 68 Footer Page 76 of 258 Header Page 77 of 258 KẾT LUẬN Sử dụng kít nhuộm hóa học tế bào HICYTEC đồng 10 kỹ thuật để phân loại thể bệnh chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp 202 mẫu tủy bệnh nhân chọc tủy lần đầu chưa điều trị có triệu chứng nằm tiêu chuẩn mặt lâm sàng chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp, đề tài thu số kết sau: Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp 31,2%, cao bạch cầu cấp dòng tủy chiếm 50,0%, bạch cầu cấp dòng lympho chiếm 41,7% thấp bạch cầu cấp lai lympho - tủy chiếm 8,3% Bạch cầu cấp dòng lympho chủ yếu trẻ em chiếm 60% có tỷ lệ nam giới mắc bệnh cao nữ giới, nam/nữ = 1,3 Đã đánh giá giá trị sử dụng kít phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB đạt phù hợp 100% dòng lympho 93,3% dòng tủy so với kết chẩn đoán Viện Huyết học - Truyền máu trung ương phương pháp hình thái học, miễn dịch di truyền Có trường hợp bạch cầu cấp thể lai lympho-tủy, mức độ phù hợp chẩn đoán đạt 100% Đã đánh giá giá trị kít nhuộm hóa học tế bào đồng HICYTEC nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm photphataza kiềm nhuộm Perls bệnh nhân bạch cầu cấp: 20% mẫu tủy có photphataza axit dương tính định hướng dòng lympho T; 1,7% có điểm nhuộm photphataza kiềm tăng định hướng có nguy nhiễm trùng; 3,3% mẫu tủy gặp tế bào mạng lưới nội mô sắt có giá trị theo dõi tình trạng ứ sắt tốt so với nguyên hồng cầu sắt 69 Footer Page 77 of 258 Header Page 78 of 258 KIẾN NGHỊ Sử dụng kít nhuộm HICYTEC đồng 10 kỹ thuật để nhuộm mẫu tủy chọc tủy lần đầu phòng xét nghiệm Huyết học để xác định thể bệnh 70 Footer Page 78 of 258 Header Page 79 of 258 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Trần Văn Tính, Vũ Thị Thủy, Lê Thị Thanh Thủy, Ngô Thị Thảo, Đoàn Văn Thuyết, Bùi Phương Thuận (2015), “Đánh giá kết kít nhuộm HICYTEC chẩn đoán bệnh bạch cầu bệnh nhân chọc tủy lần đầu viện Huyết học-Truyền máu trung ương”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 19 (4) tr 508-513 71 Footer Page 79 of 258 Header Page 80 of 258 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Minh An cộng (1995), “Tình hình bệnh lơ xê mi cấp số bệnh viện địa phương bệnh viện bạch mai”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Đại học Y Hà Nội, tr.185-192 Đỗ Thị Vinh An, Phạm Quang Vinh, Phan Văn Chi, Nguyễn Thị Bích Nhi (2010), “Bước đầu tìm hiểu số biến đổi protein bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng lympho khoa Huyết học Truyền máu bệnh viện Bạch Mai”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 373, tr.267-270 Bộ môn Huyết học-Truyền máu (1984), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học truyền máu, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mặc (1978), Thuốc thử hữu cơ, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trần Thị Hồng Hà (2004), Nghiên cứu đặc điểm, giá trị số yếu tố sinh học lâm sàng trẻ em bị lơ xê mi cấp dòng lympho bệnh viện nhi Trung ương, Luận án Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Thị Hằng (2004), “Thiếu máu thiếu sắt”, Giáo trình Huyết học-Truyền máu, NXB Y học, Hà Nội Trần Thị Minh Hương, Đỗ Trung Phấn (2002), “Tình hình bệnh máu Viện Huyết học truyền máu, bệnh viện Bạch Mai”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Huyết học Truyền máu 1999-2000, NXB Y học, tr.15-24 Nguyễn Công Khanh cộng (1987), “Phân loại bệnh lơ xê mi cấp trẻ em”, Y học Việt Nam (140), tr 28-32 Bùi Ngọc Lan (2007), Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh lơ xê mi cấp dòng lympho điều trị thể nguy không cao trẻ em, Luận án Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội 10 Lâm Thị Mỹ, Trần Thái Bình, Nguyễn Thanh Hưng, Huỳnh Nghĩa (2004), “Đặc điểm bệnh bạch cầu cấp khu vực phía Nam năm 2002-2003”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 1(8), tr 98-102 11 Đỗ Trung Phấn (2008), “Lơ xê mi cấp”, Bệnh lí tế bào nguồn, NXB Y học, tr 96 - 107 72 Footer Page 80 of 258 Header Page 81 of 258 12 Đỗ Trung Phấn (2008), “Sinh máu”, Bệnh lí tế bào nguồn, NXB Y học, tr 13-17 13 Trần Văn Tính (2014), “Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất, pH, muối điazo phản ứng nhuộm photphataza axit”, Tạp chí Y học thực hành (05), tr.29-30 14 Trần Văn Tính, Bùi Thanh Hương, Nguyễn Đắc Thảo, Đinh Ngọc Quân (2015), Nghiên cứu chế tạo kít nhuộm hóa học tế bào để chẩn đoán dòng tế bào bệnh ung thư máu, Đề tài cấp Bộ, Bộ Công an 15 Trần Văn Tính, Lê Đức Ngọc (1993), “Cải tiến phương pháp đánh giá số thay đổi hóa sinh tế bào bạch cầu ung thư dòng tuỷ”, Kỷ yếu Hội nghị hóa học toàn quốc Việt Nam lần thứ 3, tr.179 16 Trần Văn Tính, Phạm Hoài Thu, Nguyễn Anh Trí, Lưu Văn Bôi (2011), “Tổng hợp nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người naphtol AS cloaxetat”, Tạp chí Hóa học, Tập 49 (4), tr 479-488 17 Trần Văn Tính, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Đình Triệu (2000), “Nghiên cứu áp dụng chương trình Hyperchem để tính toán chế động học tối ưu hoá phản ứng nhuộm Esteraza không đặc hiệu bạch cầu người”, Tạp chí thông tin y dược học (03), tr.18-24 18 Trần Văn Tính, Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Đình Triệu (2000), “Nghiên cứu tối ưu hoá phản ứng nhuộm Esteraza không đặc hiệu phương pháp đơn hình”, Tạp chí thông tin y dược học (06), tr.31-35 19 Nguyễn Hữu Toàn (1999), Nghiên cứu phân loại leukemia cấp người lớn, rối loạn tạo máu tế bào miễn dịch thể M1, M2, M3, Luận án Tiến sĩ Y dược, Học viện Quân y 20 Phan Nguyễn Thanh Vân, Nguyễn Tấn Bỉnh (2006), “Triển khai kỹ thuật FISH RT-PCR nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể gen bệnh lý huyết học bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh” Tạp Chí Y Học Thực Hành, tập 545, tr 73-79 21 Phan Nguyễn Thanh Vân (2013), Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen khảo sát tổ hợp gen thường gặp bệnh lý bạch cầu cấp, Luận án Tiến sỹ Y học, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh 73 Footer Page 81 of 258 Header Page 82 of 258 22 Nguyễn Triệu Vân cộng (2004), “Giá trị số dấu ấn miễn dịch (marker) chẩn đoán phân loại lơ xê mi cấp dòng lympho người lớn Viện Huyết học truyền máu”, Tạp Chí Y học Thực hành, tập 497, tr.27-29 23 Nguyễn Triệu Vân (2014), “Một số hiểu biết bệnh nguyên, bệnh sinh, điều trị tiên lượng bệnh lơ xê mi cấp”, Một số chuyên đề Huyết họcTruyền máu, Tập 5, NXB Y học, tr 225-244 24 Phạm Quang Vinh (2003), Các biến đổi nhiễm sắc thể bệnh nhân lơ xê mi cấp Viện Huyết học- Truyền máu, bệnh viện Bạch Mai, Luận án Tiến sỹ Y học 25 Trần Ngọc Vũ, Nguyễn Duy Thăng, Phan Thị Thu Hoa, Trần Thị Phương Túy, Phan Hoàng Duy, Ngô Tứ Cương, Hoàng Thị Thanh Trang, Tôn Nữ Trà Mai (2014), “Nghiên cứu ứng dụng hóa học tế bào giá trị bổ sung dấu ấn miễn dịch chẩn đoán, phân loại lơ xê mi cấp”, Tạp chí Y học Việt Nam, Tập 423, tr 189-195 Tiếng Anh 26 Barnes A (1994), Acute leukemias: The F.A.B classification and more, Resource exchange intern'l-Vietnam 27 Bennett J M and et al (1976), "Proposals for the classification of the acute leukaemias French-American-British (FAB) co-operative group", Br J Haematol, 33 (4), pp.451-458 28 Brennan M L., Penn M S., Van Lente F., Nambi V., Shishehbor M H., Aviles R J., Goormastic M., Pepoy M L., McErlean E S., Topol E J., Nissen S E., Hazen S L (2003), "Prognostic value of myeloPeroxidaza in patients with chest pain", N Engl J Med 349 (17), pp 1595-604 29 Burstone, M S (1957), “Esteraza activity of developing bones and teeth”, A M A Arch Path Vol 60, pp 164 - 167 30 Chayen J., Bitensky L (1994), Practical histochemistry, Wiley, London 31 Connor J R , Dodds R A , James I E , Gowen M (1995), “Human osteoclast and giant cell differentiation, The apparent switch from nonspecific esteraza to tartrate resistant acid photphataza activity coincides with the in situ expression of osteopontin mRNA”, J Histochemistry and Cytochemistry Vol 43 (12), pp 1193-1201 74 Footer Page 82 of 258 Header Page 83 of 258 32 Craig F E., Foon K A (2008), "Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms", Blood, 111 (8), pp 3941-67 33 Dacie J V., Lewis S M (1994), Practical Haematology, Longman Group Ltd, Hong Kong 34 David Swirsky and Barbara J Bain (2006), Practical Haematology, Churchill Livingstone, Hong kong 35 Dissing J., Svensmark O (1990), "Human red cell acid photphataza: purification and properties of A, B and C isozymes", Biochim Biophys Acta Vol 1041, pp 232-42 36 Drexler H G (1987) "Classification of acute myeloid leukemias-a comparison of FAB and immunophenotyping", Leukemia, (10), pp 697-705 37 Estey E , Dohner H (2006), "Acute myeloid leukaemia" Lancet, 368 (9550), pp 1894-907 38 Gignac S M., Hu Z B., Denkmann S A., Uphoff C C., Drexler H G (1996), “Esteraza isoenzyme profiles of 255 leukemia-lymphoma cell lines from all hematopoietic cell lineages”, Leuk lymphoxítsm Vol 22, pp 143-151 39 Greer J P., Foerster J., Rodgers G M., Paraskevas F., Glader B., Arber D A., Means Jr T R (2009), Wintrobe’s clinical hematology Vol 1, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA 40 Hann I M ; Smith O P (2006), Pediatric hematology, Wiley-Blackwell, USA 41 Hayhoe F G J., Quaglino D (1994), Haematological cytochemistry, Edinburgh Churchill Livingstone, London 42 Heslop C L , Frohlich J J , Hill J S (2010), "MyeloPeroxidaza and C-reactive protein have combined utility for long-term prediction of cardiovascular mortality after coronary angiography" J Am Coll Cardiol 55 (11), pp 1102-9 43 Kantarjian H M., Deisseroth A., Kurzrock R., Estrov Z., Talpaz M (1993) "Chronic myelogenous leukemia: a concise update", Blood, 82, pp 691-703 44 Leong A S-Y, Cooper K., Leong F J W-M (2003), Manual of Diagnostic Antibodies for Immunohistology, Greenwich Medical Media, London, pp 325326 75 Footer Page 83 of 258 Header Page 84 of 258 45 Mathy-Hartert M., Bourgeois E., Grülke S., Deby-Dupont G., Caudron I., Deby C., Lamy M., Serteyn D (1998), "Purification of myeloPeroxidaza from equine polymorphonuclear leucocytes", Can J Vet Res, Vol 62 (2), pp 127-132 46 Merck (1995), “Enzyme cytochemistry Leucognost/HematoGnost Fe; Working intructions for simpified cytochemical staining for differentiation of leukaemias and myelodysplastic syndromes”, E.Merck, D-64271 Darmstadt 47 Moe W and et al (2008), “Diagnosis of acute myeloid leukemia according to the WHO classification in the Japan adult leukemia study group AML-97 protocol”, International Journal of Hematology Vol 87 (2), pp 144-151 48 Pui C H., Sallan S., Relling M V., Masera G., Evans W E (2001), “International Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia”, Leukemia, 15, pp 707-715 49 Pui C H., Robinson L L., Look A T (2008) “Acute lymphoblastic leukemia”, Lancet, 371 (9617), pp 1030-1072 50 Rybo E and Bengtsson C (1985), "Sideroblast count and examination of bone marrow reticuloendothelial iron in the diagnosis of iron deficiency", Scandinavian Journal of Haematology, Vol 34(S43), pp 77-85 51 Siegel M P H R., Deepa Naishadham MA, MS and Ahmedin Jemal DVM, PhD (2013), Cancer statistics, Vol 63(1), pp 11-30 52 Siegel M P H R., Deepa Naishadham MA, MS and Ahmedin Jemal D V M., PhD (2015), Cancer statistics, CA Cancer J Clin, vol 65(1), pp 5-29 53 Sigma (2006), Accustain iron stain, Procedure No HT20, Revised 2014-09, United Kingdom 54 Sigma-Aldrich (2008), Hematology & Histiology, Product guide, USA 55 Sigma (2014), Lymphocyte enzyme, Procedure No 181, Revised 2014-09, USA 56 Stok J E., Goloshchapov A., Cheng Song, Wheelock C E., M B H Derbel, C Morisseau, Hammock B D (2004), “Investigation of the role of a second conserved serine in carboxylesterazas via site-directed mutagenesis”, Archives of Biochemistry and Biophysics Vol 430, pp 247-255 57 William H E (1941), Stain technique, The Science press printing company lancaster 76 Footer Page 84 of 258 ... quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp theo FAB 27 Hình 3.1 Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi giới tính .38 Hình 3.2 Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp. .. Perls Bộ kít khắc phục yếu điểm Nhằm đánh giá giá trị sử dụng kít, tiến tới thay hàng nhập ngoại, đề tài Ứng dụng kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB ... xơ Nhuộm hoá học tế bào: Sử dụng hóa chất nhuộm số enzym chất  có tế bào, qua xác định dòng tế bào, kết hợp với kết hình thái học tiêu nhuộm giemsa phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn