Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp

Header Page of 89 LỜI CAM ĐOAN Đây công trình nghiên cứu riêng tôi, luận án có sử dụng phần kết đề tài cấp Thành phố“ Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng sản phẩm thực phẩm nông nghiệp” mã số 01C-06/03-2013-2 làm chủ nhiệm Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chƣa đƣợc tác giả khác công bố, thông tin trích dẫn luận án đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016 Ngƣời hƣớng dẫn Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học Khoa học PGS-TS Trần Liên Hà GS-TS Đặng Thị Thu i Footer Page of 89 Tác giả Nguyễn Chí Dũng Header Page of 89 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS-TS Trần Liên Hà GS-TS Đặng Thị Thu – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, định hƣớng, đào tạo giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội bảo, truyền đạt kinh nghiệm tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp đỡ trau dồi kiến thức chuyên môn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới bạn, anh chị Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Viện Công nghệ Sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam chia sẻ cho số kinh nghiệm trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp Trung tâm Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Sở Khoa học Công nghệ Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ thời gian vật chất để hoàn thành Luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng kính yêu biết ơn tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Chí Dũng ii Footer Page of 89 Header Page of 89 MỤC LỤC Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ đồ thị x MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu axit poly gamma glutamic 1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA giới Việt Nam 1.2.1 1.2.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA giới Tình hình nghiên cứu γ-PGA Việt Nam 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 1.4 Tính chất γ-PGA 11 1.5 Phân loại γ-PGA 12 1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 13 1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 15 1.7.1 1.7.2 1.7.3 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng 15 Ảnh hƣởng yếu tố ngoại cảnh đến trình lên men 21 Phƣơng pháp lên men γ-PGA 23 1.8 Xác định đánh giá chất lƣợng γ-PGA 24 1.8.1 1.8.2 1.8.3 1.8.4 Định tính định lƣợng γ-PGA 24 Thu nhận tinh γ-PGA 25 Đánh giá cấu trúc khối lƣợng phân tử γ-PGA 30 Xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA 31 1.9 Ứng dụng γ-PGA 32 1.9.1 1.9.2 1.9.3 1.9.4 Trong lĩnh vực môi trƣờng 32 Trong lĩnh vực y dƣợc 33 Trong lĩnh vực nông nghiệp 33 Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm 34 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 40 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 nghiệm 2.2.4 2.2.5 2.2.6 lụa VẬT LIỆU 40 Nguồn phân lập 40 Hóa chất 40 Môi trƣờng nuôi cấy: 40 Dụng cụ thiết bị 41 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 Phƣơng pháp vi sinh sinh học phân tử 41 Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA 42 Phƣơng pháp toán học - tối ƣu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực 43 Phƣơng pháp phân tích hóa lý, hóa sinh 46 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan 49 Nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hƣởng γ-PGA đến chất lƣợng giò 49 iii Footer Page of 89 Header Page of 89 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.3.8 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp Poly γ-glutamic 51 Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA 55 Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB 55 Định tên phƣơng pháp sinh học phân tử: 60 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 61 Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA 61 Ảnh hƣởng nhiệt độ 62 Ảnh hƣởng tốc độ lắc 63 Ảnh hƣởng pH 64 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp γ-PGA 65 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ 66 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 67 Ảnh hƣởng nồng độ natri-glutamat 68 3.4 Tối ƣu điều kiện ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA 69 3.5 Nghiên cứu động học trình lên men 75 3.6 Nghiên cứu yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γ-PGA chủng B5 quy mô 100 lít/mẻ 77 3.6.1 3.6.2 3.7 Ảnh hƣởng chế độ khuấy sục khí 77 Sự thay đổi hàm lƣợng oxy hòa tan trình lên men 78 Tinh γ-PGA 79 3.7.1 Tinh dựa tiêu chí hàm lƣợng protein carbonhydrat 79 3.7.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau tinh 80 3.7.3 Kiểm tra mức độ tinh sản phẩm phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 81 3.7.4 Đánh giá chất lƣợng sản phẩm tinh sạch, cấu trúc γ-PGA qua kính hiển vi điện tử quét 83 3.7.5 Xác định cấu trúc độ γ-PGA thông qua phổ FT-IR phổ H NMR 84 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.8.4 3.9 3.9.1 3.9.2 phẩm 3.10 3.10.1 3.10.2 gia khác Nghiên cứu số đặc tính γ-PGA 86 Xác định khối lƣợng phân tử 86 Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic L – Glutamic γ-PGA 89 Nghiên cứu tính bền axit γ-PGA 89 Nghiên cứu tính bền nhiệt γ-PGA 90 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA 91 Nghiên cứu thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA 91 Đánh giá mức độ an toàn γ-PGA việc sử dụng làm phụ gia thực 92 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA ổn định nƣớc cam 94 Khảo sát chất lƣợng nguyên liệu 94 So sánh ảnh hƣởng γ-PGA đến độ ổn định nƣớc cam với phụ 95 iv Footer Page of 89 Header Page of 89 3.10.3 Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nƣớc cam 100 3.10.4 Ảnh hƣởng chế độ trùng tới chất lƣợng cảm quan nƣớc cam .101 3.11 3.11.1 3.11.2 3.11.3 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA cải thiện chất lƣợng giò 102 Ảnh hƣởng loại phụ gia đến độ dẻo khối thịt xay 103 Ảnh hƣởng loại phụ gia đến chất lƣợng giò 104 Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lƣợng giò 107 KẾT LUẬN 109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 PHỤ LỤC 121 v Footer Page of 89 Header Page of 89 Danh mục ký hiệu chữ viết tắt ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate CFU/ml Colony forming unit CMC Carboxyl Methyl Celullose D,L-PGA axit D,L- Poly γ- glutamic DHA Axit Docosa Hexaenoic DNA Axit Deoxyribonucleic D-PGA axit D-Poly γ- glutamic EDTA Axit Ethylenediaminetetraacetic EPA Axit Eicossa Pentaenoic FT-IR Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi GPC Sắc ký lọc gel H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân K – γ-PGA Kali – γ-PGA LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp L-PGA axit L-Poly γ- glutamic MEGA6 Phần mêm phân tích trình tự gen, phân loài NCBI Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ PCR Polymerase chain reaction RNA Axit Ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope TCA Axit Tricarboxylic v/p Vòng/ phút v/v Thể tích/ thể tích γ-PGA Axit Poly γ- glutamic vi Footer Page of 89 Header Page of 89 Danh mục bảng Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn giới Bảng 1.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic 13 Bảng 1.3 Thành phần môi trƣờng cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 15 Bảng 2.1 Khoảng biến đổi yếu tố 44 Bảng 2.2 Bảng bố trí thí nghiệm tối ƣu yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA 45 Bảng 3.1 Sự phát triển, tạo màng nhày trực khuẩn gram dƣơng môi trƣờng đặc hiệu 51 Bảng 3.2 Độ nhớt canh trƣờng nuôi cấy chủng tuyển chọn 53 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn môi trƣờng LB 55 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn 56 Bảng 3.5 Kết sinh tổng hợp enzym ngoại bảo chủng vi khuẩn 58 Bảng 3.6 Kết sử dụng carbon vi khuẩn B5 T1 Kit API 50 CHB 59 Bảng 3.7 Kết thực nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm 70 Bảng 3.8 Kết phân tích phƣơng sai ANOVA mô hình 71 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng tốc độ khuấy sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) 77 Bảng 3.10: Hàm lƣợng protein carbonhydrat lại sau tinh γ-PGA 80 Bảng 3.11 Các tiêu chí đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm γ-PGA 81 Bảng 3.12 Kết chạy sắc ký lọc gel (GPC) mẫu γ-PGA từ chủng B subtilis B5 88 Bảng 3.13 Tỷ lệ hỗn hợp đồng phân quang học axit glutamic 89 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng axit đến tính chất sản phẩm γ-PGA 90 Bảng 3.15 Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA 92 Bảng 3.16 Bảng phân tích tiêu hóa lý, hóa sinh γ-PGA sử dụng làm phụ gia thực phẩm 93 Bảng 3.17 Một số tiêu hóa học cam sành Hà Giang 94 Bảng 3.18 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch đến chất lƣợng cảm quan nƣớc cam 94 Bảng 3.19 Ảnh hƣởng phụ gia ổn định đến biến đổi độ nhớt nƣớc cam 96 Bảng 3.20 Sự biến đổi màu sắc sản phẩm sau thời gian bảo quản 97 Bảng 3.21 Chất lƣợng cảm quan nƣớc cam ép đục tỷ lệ bổ sung γ-PGA 100 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng chế độ trùng tới chất lƣợng màu sắc mùi vị nƣớc cam 102 Bảng PL1 Bảng thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA 122 vii Footer Page of 89 Header Page of 89 Bảng PL2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh γ-PGA 122 Bảng PL3 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh γ-PGA 123 Bảng PL4 Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan 127 Bảng PL5 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc cam 127 Bảng PL6 Thang điểm đánh giá chất lƣợng sản phẩm nƣớc cam 128 Bảng PL7 Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm 129 Bảng PL8 Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa 129 Bảng PL9 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò 129 viii Footer Page of 89 Header Page of 89 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Cấu trúc phân tử γ-PGA Hình 1.2 Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA Hình 1.3 Phản ứng polymer hóa γ-PGA ATP 10 Hình 1.4 Quy trình tinh γ-PGA theo phƣơng pháp Ho cộng 27 Hình 1.5 Quy trình tinh γ-PGA theo phƣơng pháp Seong cộng 28 Hình 1.6 Quy trình tinh γ-PGA theo phƣơng pháp Goto Kunioka 29 Hình 1.7 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA 31 Hình 1.8 Quy trình thử nghiệm chế phẩm γ-PGA sản phẩm giò lụa 37 Hình 3.1 Ảnh chụp tạo màng chủng vi khuẩn thử nghiệm môi trƣờng đặc hiệu 52 Hình 3.2 Sắc ký mỏng dịch nhớt canh trƣờng sau thủy phân 54 Hình 3.3 Khả sinh γ-PGA chủng tuyển chọn 54 Hình 3.4 Đặc điểm hình thái tế bào chủng B5 T1 dƣới kính hiển vi quang học 56 Hình 3.5 Ảnh hƣởng pH đến khả phát triển vi khuẩn 57 Hình 3.6 Cây phát sinh chủng (B5) dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA 60 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng (T1) dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA 60 Hình 3.8 Ảnh hƣởng tiền chất đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 61 Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 62 Hình 3.10 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 63 Hình 3.11 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 64 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến hình thành γ-PGA 66 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến hình thành γ-PGA 67 Hình 3.14 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 68 Hình 3.15 Ảnh hƣởng nồng độ Natriglutamat đến tổng hợp γ-PGA 69 Hình 3.16 Biểu đồ bề mặt đáp ứng thời gian nhiệt độ thay đổi 73 Hình 3.17 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ tiền chất thay đổi 74 Hình 3.18 Biểu đồ bề mặt đáp ứng pH nhiệt độ thay đổi 74 Hình 3.19 Biểu đồ bề mặt đáp ứng pH thời gian thay đổi 75 Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn động học trình tổng hợp γ-PGA 76 Hình 3.21 Sự biến đổi hàm lƣợng oxy hòa tan trình lên men 78 Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC mẫu γ-PGA thủy phân thành glutamic 82 Hình 3.23 Sắc ký đồ axit L-Glutamic sử dụng sinh tổng hợp γ-PGA 82 Hình 3.24 Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần 83 Hình 3.25 Phổ FT-IR γ-PGA tinh thu đƣợc chủng B subtilis B5 84 Hình 3.26 Phổ FT-IR γ-PGA chuẩn hãng Merck 85 Hình 3.27 Phổ H NMR γ-PGA tinh thu đƣợc chủng B subtilis B5 85 Hình 3.28 Phổ HNMR mẫu γ-PGA chuẩn hãng Merck 86 ix Footer Page of 89 Header Page 10 of 89 Hình 3.29 Điện di SDS PAGE xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA 87 Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu γ-PGA tạo thành chủng B subtilis B5 sắc ký lọc gel 88 Hình 3.31 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến biến đổi độ nhớt dịch γ-PGA 91 Hình 3.32 Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng γ-PGA phụ gia thƣờng dùng khác việc ổn định cho nƣớc cam 95 Hình 3.33 Nƣớc cam đóng chai sau tháng bảo quản 98 Hình 3.34 Biểu đồ ảnh hƣởng phụ gia ổn định đến chất lƣợng cảm quan nƣớc cam 99 Hình 3.35 Biểu đồ đánh giá tiêu cảm quan nƣớc cam ép đục tỷ lệ bổ sung γ-PGA 100 Hình 3.36 Biểu đồ ảnh hƣởng phụ gia tạo cấu trúc đến chất lƣợng khối thịt xay 103 Hình 3.37 Biểu đồ lực nén lực cắt giò thành phẩm 104 Hình 3.38 Biểu đồ đánh giá cƣờng lực gel mẫu sản phẩm giò 105 Hình 3.39 Biểu đồ điểm đánh giá cảm quan mẫu giò sử dụng phụ gia 106 Hình 3.40 Cƣờng lực gel mẫu giò sử dụng γ-PGA 107 Hình PL1 Ảnh khuẩn lạc môi trƣờng LB, môi trƣờng E ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm bào tử, nhuộm gram vi khuẩn Bacillus subtilis B5 121 Hình PL2 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng γ-PGA 123 Hình PL3 Ảnh peak giải trình tự chiều 124 Hình PL4 Đƣờng chuẩn đánh giá hàm lƣợng carbonhydrat 126 Hình PL5 Bảng phối màu từ ba màu 126 x Footer Page 10 of 89 Header Page 126 of 89 69 King, E.C; Blacker, A.J and Bugg, T.D.H (2000), "Enzymatic Breakdown of Polyγ-d-glutamic Acid in Bacillus licheniformis:  Identification of a Polyglutamyl γHydrolase Enzyme", Biomacromolecules 1(1), pp 75-83 70 Krop, J.J (1974), The mechanism of cloud loss phenomena in orange juice, Agricultural University, The Netherlands, Agricultural 71 Kubota, H.; Matsunobu, T.; Uotani, K.; Takebe, H.; Satoh, A.; Tanaka, T and Taniguchi, M (1993), "Production of Poly(gamma-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 57(7), pp 12121213 72 Leonard, C G ; Mattheis, D K ; Mattheis, M J and Housewright, R D (1964), "Transformation to Prototrophy and Polyglutamic Acid Synthesis in Bacillus licheniformis", Journal of Bacteriology 88(1), pp 220-225 73 Leonard, C G.; Housewright, R.D and Thorne, C.B (1958), "Effects of some metallic ions on glutamyl polypeptide synthesis by bacillus subtilis", J Bacteriol 76(5), pp 499-503 74 Liang, H F.; Chen, S C.; Chen, M C ; Lee, P W.; Chen, C T and Sung, H W (2006), "Paclitaxel-Loaded Poly γ-glutamic acid -poly lactide Nanoparticles as a Targeted Drug Delivery System against Cultured HepG2 Cells", Bioconjugate Chemistry 17(2), pp 291-299 75 Liang, H F.; Yang, T F.; Huang, C T.; Chen, M C and Sung, H W (2005), "Preparation of nanoparticles composed of poly γ-glutamic acid -poly lactide block copolymers and evaluation of their uptake by HepG2 cells", Journal of Controlled Release 105(3), pp 213-225 76 Luana, P; Moraes, N and Ranulfo, M (2013), "The Existing Studies on Biosynthesis of Poly(ɣ-glutamic acid) by Fermentation", Food and Public Health 3(1), pp 2836 77 Mahmoud, B.; Aliaa, M.E.B.; Samia, M.E.S.; Yasser, R.A.F and Samy., E.A (2006), "Optimization of Culture Conditions for Production of Polyamide Biopolymer (Polyglutamate) by Bacillus sp Strain-R", Journal of Biological Sciences 6(4), pp 687-694 78 Mahmoud, M B and Mohamed, S A O (2013 ), "Enhanced production of poly glutamic acid by Bacillus sp SW1-2 using statistical experimental design", African Journal of Biotechnology 12(5), pp 481-490 79 Masaaki, M (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering 101(1), pp 1-8 80 Mitsui, N; Murasawa, H and Sekiguchi, J (2011), "Disruption of the cell wall lytic enzyme CwlO affects the amount and molecular size of poly-gamma-glutamic acid produced by Bacillus subtilis (natto)", The Journal of General and Applied Microbiology 57(1), pp 35-43 81 Moraes, L.P ; Alegre, R M and Brito, P N (2012 ), "Optimisation of Poly(γGlutamic Acid) Production by Bacillus velezensis NRRL B – 23189 in Liquid Fermentation with Molasses as the Carbon Source without Addition of Glutamic Acid ", International Review of Chemical Engineering 4(6), pp 618-623 116 Footer Page 126 of 89 Header Page 127 of 89 82 Morikawa, M; Kagihiro, S; Haruki, M; Takano, K; Branda, S; Kolter, R and Kanaya, S (2006), "Biofilm formation by a Bacillus subtilis strain that produces γpolyglutamate", Microbiology 152(9), pp 2801-2807 83 Nagai, T.; Tran, P L S.; Inatsu, Y and Itoh, Y (2000), "A New IS4 Family Insertion Sequence, IS4Bsu1, Responsible for Genetic Instability of Poly-γGlutamic Acid Production in Bacillus subtilis", Journal of Bacteriology 182(9), pp 2387-2392 84 Nuttawut, K.; Chaniga, C.; Chiravoot, P and Sarote, S (2012), "Production of Poly-γ-glutamic acid by Bacillus licheniformis Synthesis and Characterization", Journal of Metals, Materials and Minerals 22(2), pp 7-11 85 Ogawa, Y.F; Yamaguchi, K and Yuasa, T (1997), "Efficient production of γpolyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters.", Biosci Biotechnol Biochem 61, pp 1684-1687 86 Park, C; Choi, J C and Choi, Y.H (2005), "Synthesis of super-high-molecularweight poly-γ-glutamic acid by Bacillus subtilis subsp chungkookjang", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 35(4-6), pp 128-133 87 Peng, S F; Yang, M J; Su, C J; Chen, H L; Lee, P W; Wei, M C and Sung, H W (2009), "Effects of incorporation of poly(γ-glutamic acid) in chitosan/DNA complex nanoparticles on cellular uptake and transfection efficiency", Biomaterials 30(9), pp 1797-1808 88 Poo, H.; Park, C.; Kwak, M S.; Choi, D Y.; Hong, S P.; Lee, I H.; Lim, Y T.; Choi, Y K.; Bae, S R.; Uyama, H.; Kim, C J and Sung, M H (2010), "New Biological Functions and Applications of High-Molecular-Mass Poly-γ-glutamic Acid", Chemistry & Biodiversity 7(6), pp 1555-1562 89 Radu, J E F.; Novak, L.; Hartmann, J.; Beheshti, N.; Kjøniksen, A L.; Nyström, B and Borbély, J (2008), "Structural and dynamical characterization of polygamma-glutamic acid-based cross-linked nanoparticles", Colloid and Polymer Science 286(4), pp 365-376 90 Richard, A and Margaritis, A (2003), "Optimization of cell growth and poly(glutamic acid) production in batch fermentation by Bacillus subtilis", Biotechnology Letters 25(6), pp 465-468 91 Sawamura, S (1913), "On Bacillus Natto", J Coll Agric Tokyo 5(189-191) 92 Seong, H C.; Jong, S P.; Kyung, S W.; Min, H Y and Wang, Y C (2004), "Production of Microbial Biopolymer, Poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis BS 62", Agricultural Chemistry & Biotechnology 47(2), pp 60-64 93 Shi, F; Xu, Z and Cen, P (2006), "Efficient production of poly-γ-glutamic acid by bacillus subtilis ZJU-7", Applied Biochemistry and Biotechnology 133(3), pp 271-281 94 Shih, I L.; Chen, L D and Wu, J Y (2010), "Levan production using Bacillus subtilis natto cells immobilized on alginate", Carbohydrate Polymers 82(1), pp 111-117 95 Shih, I L and Van, Y T (2001), "The production of poly-(gamma-glutamic acid) from microorganisms and its various applications", Bioresource Technology 79(3), pp 207-25 117 Footer Page 127 of 89 Header Page 128 of 89 96 Shih, I L.; Van, Y T and Chang, Y N (2002), "Application of statistical experimental methods to optimize production of poly(γ-glutamic acid) by Bacillus licheniformis CCRC 12826", Enzyme and Microbial Technology 31(3), pp 213220 97 Shih, I L.; Van, Y T and Sau, Y Y (2003), "Antifreeze activities of poly(γglutamic acid) produced by Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters 25(20), pp 1709-1712 98 Shih, I L.; Van, Y T.; Yeh, L C.; Lin, H G and Chang, Y N (2001), "Production of a biopolymer flocculant from Bacillus licheniformis and its flocculation properties", Bioresource Technology 78(3), pp 267-272 99 Shih, I L and Yu, Y T (2005), "Simultaneous and selective production of levan and poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis", Biotechnology Letters 27(2), pp 103-106 100 Shih, I L.; Yu, Y T.; Shieh, C J and Hsieh, C Y (2005), "Selective Production and Characterization of Levan by Bacillus subtilis (Natto) Takahashi", Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(21), pp 8211-8215 101 Stanley, N R and Lazazzera, B A (2005), "Defining the genetic differences between wild and domestic strains of Bacillus subtilis that affect poly-γ-dl-glutamic acid production and biofilm formation", Molecular Microbiology 57(4), pp 11431158 102 Stellato, D A and Camesano, T A (2005), "Quantitative Analysis of Biopolymer Conformation Using Atomic Force Microscopy: Copper-Induced Conformational Changes in Poly-γ-glutamic Acid", Formatex, pp 25-32 103 Sumihiko, S.; Takeo, M.; Sawao, M and Seijiro, O (1973), "Isolation and Purification of Polyglutamic Acid Produced by Bacillus subtilis No E, and Studies on its Chemical Properties", Japan society for bioscience, biotechnology, and agrochemistry 47 (3), pp 159-165 104 Sung, M H.; Park, C.; Kim, C J.; Poo, H.; Soda, K and Ashiuchi, M (2005), "Natural and edible biopolymer poly-γ-glutamic acid: synthesis, production, and applications", The Chemical Record 5(6), pp 352-366 105 Suzuki, T and Tahara, Y (2003), "Characterization of the Bacillus subtilis ywtD Gene, Whose Product Is Involved in γ-Polyglutamic Acid Degradation", Journal of Bacteriology 185(7), pp 2379-2382 106 Tanaka, T.; Hiruta, O.; Futamura, T.; Uotani, K.; Satoh, A.; Taniguchi, M and Susumu, O (1993), "Purification and Characterization of Poly(γ-glutamic acid) Hydrolase from a Filamentous Fungus, Myrothecium sp TM-4222", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 57(12), pp 2148-2153 107 Tanimoto, H.; Mori, M.; Motoki, M.; Torii, K.; Kadowaki, M and Noguchi, T (2001), "Natto Mucilage Containing Poly- gamma- glutamic Acid Increases Soluble Calcium in the Rat Small Intestine", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 65(3), pp 516-521 108 Tarui, Y; Iida, H.; Ono, E.; Miki, W.; Hirasawa, E; Fujita, K.; Tanaka, T and Taniguchi, M (2005), "Biosynthesis of poly-gamma-glutamic acid in plants: 118 Footer Page 128 of 89 Header Page 129 of 89 transient expression of poly-gamma-glutamate synthetase complex in tobacco leaves", J Biosci Bioeng 100(4), pp 443-448 109 Thitikorn, M and Piyawan, G (2011), "Effect of freeze - drying and maltodextrin matrix on poly γ glutamic acid productivity from Bacillus subtilis starter powder", Proceeding of IFC 2011 1, pp 80-84 110 Thorne, C.B and Leonard, C.G (1958), "Isolation of D- and L-glutamyl polypeptides from culture filtrates of Bacillus subtilis", J Biol Chem 233(5), pp 1109-1112 111 Tianlei, Q.; Xiang, Y.; Meilin, H.; Xuming, W and Qunhui, W (2012), "Optimization of fermentative production of poly-(γ-glutamic acid) by a newly isolated Bacillus subtilis BABRC-11", African Journal of Microbiology Research 6(42), pp 7035-7039 112 Toshio, H and Seinosuke, U (1982), "Regulation of Polyglutamate Production in Bacillus subtilis (natto): Transformation of High PGA Productivity", Agricultural and Biological Chemistry 46(9), pp 2275-2281 113 Troy, F.A (1973), "Chemistry and biosynthesis of poly γ D glutamyl capsule in Bacillus licheniformis", J Biol Chem 248, pp 305 - 316 114 Vedan, I (2006), Gamma-poly-glutamic acid, Vedan Taiwan 115 Wang, L L.; Wu, Y X.; Xu, R W.; Wu, G Y and Yang, W T (2008), "Synthesis and Characterization of Poly L-Glutamic Acid-Co-L-Aspartic Acid", Chinese Journal of Polymer Science 26(04), pp 381-391 116 Wang, N.; Yang, G.; Che, C and Liu, Y (2011), "Heterogenous expression of poly-γ-glutamic acid synthetase complex gene of Bacillus licheniformis WBL-3", Applied Biochemistry and Microbiology 47(4), pp 381-385 117 Weber, J (1990), "Poly gamma-glutamic acids are the major constituents of nematocysts in Hydra (Hydrozoa, Cnidaria)", Journal of Biological Chemistry 265(17), pp 9664-9669 118 Weizhong, S (2011), "Method of low cost preparing gamma- polyglutamic acid utilizing farm and side line products solid fermentation", Euro Patent office(CN2005191813 20050806) 119 Weng, T M and Chen, M T (2010), "Changes of Protein in Natto (a fermented soybean food) Affected by Fermenting Time", Food Science and Technology Research 16(6), pp 537-542 120 Wu, Q; Xu, H; Liang, J and Yao, J (2010), "Contribution of Glycerol on Production of Poly(γ-Glutamic Acid) in Bacillus subtilis NX-2", Applied Biochemistry and Biotechnology 160(2), pp 386-392 121 Wu, Q; Xu, H; Xu, L and Ouyang, P (2006), "Biosynthesis of poly(γ-glutamic acid) in Bacillus subtilis NX-2: Regulation of stereochemical composition of poly(γglutamic acid)", Process Biochemistry 41(7), pp 1650-1655 122 Wu, Q.; Xu, H.; Shi, N.; Yao, J.; Li, S and Ouyang, P (2008), "Improvement of poly(γ-glutamic acid) biosynthesis and redistribution of metabolic flux with the presence of different additives in Bacillus subtilis CGMCC 0833.", Appl Microbiol Biot 79(4), pp 527-535 119 Footer Page 129 of 89 Header Page 130 of 89 123 Xu, H; Jiang, M; Li, H; Lu, D and Ouyang, P (2005), "Efficient production of poly(γ-glutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2", Process Biochemistry 40(2), pp 519-523 124 Yang, L C; Wu, J B; Ho, G H; Yang, S C; Huang, Y P and Lin, W C (2008), "Effects of Poly-γ-glutamic Acid on Calcium Absorption in Rats", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 72(12), pp 3084-3090 125 Yasuhiro, I; Keitarou, K and Yoshifumi, I (2002), "Characterization of Bacillus subtilis Strains Isolated from Fermented Soybean Foods in Southeast Asia: Comparison with B subtilis (natto) Starter Strains", Japan Agricultural Research Quarterly 36(3), pp 169-175 126 Yokoi, H; Arima, T; Hirose, J; Hayashi, S and Takasaki, Y (1996), "Flocculation properties of poly(γ-glutamic acid) produced by Bacillus subtilis", Journal of Fermentation and Bioengineering 82(1), pp 84-87 127 Yoon, S H.; Jin, H D.; Sang, Y L and Ho, N C (2000), "Production of poly-γglutamic acid by fed-batch culture of Bacillus licheniformis", Biotechnology Letters 22(7), pp 585-588 128 Yoshihito, I.; Takeshi, T.; Tetsuo, O and Yoshihiro, A (1996), "Glutamic Acid Independent Production of Poly(γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis TAM-4", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 60(8), pp 1239-1242 129 Yung, S S and Wen, C S (2010), "Improving The Emulsion Stability of Sponge Cake by The Addition of γ-Polyglutamic Acid", Journal of Marine Science and Technology 18(6), pp 895-900 130 Zeng, W.; Chen, G.; Zhang, Y.; Wu, K and Liang, Z (2012), "Studies on the UV spectrum of poly(γ-glutamic acid) based on development of a simple quantitative method", International Journal of Biological Macromolecules 51(1–2), pp 83-90 120 Footer Page 130 of 89 Header Page 131 of 89 PHỤ LỤC Hình PL1 Ảnh khuẩn lạc môi trƣờng LB, môi trƣờng E ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm bào tử, nhuộm gram vi khuẩn Bacillus subtilis B5 121 Footer Page 131 of 89 Header Page 132 of 89 Bảng PL1 Bảng thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA L-glutamic Môi trƣờng E (g/l) 20,00 Axit citric 12,00 12,00 12,00 12,00 Glycerol 80,00 80,00 80,00 80,00 20,00 10,00 Thành phần Natri glutamat Môi trƣờng E1 (g/l) Môi trƣờng E2 (g/l) Môi trƣờng E3 (g/l) 20,00 Đậu tƣơng bột Môi trƣờng E4 (g/l) 10,00 20,00 112,00 NH4Cl 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 MgSO4.7H2O 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 FeCl3.6H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 K2HPO4 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 CaCl22H2O 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 MnSO4.H2O 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Bảng PL2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh γ-PGA 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C 24h 0,100 ± 0,008 0,741 ± 0,004 0,952 ± 0,006 0,053 ± 0,005 0,042 ± 0,001 48h 1,430 ± 0,008 1,941 ± 0,014 5,768 ± 0,005 3,959 ± 0,004 0,027 ± 0,001 72h 1,851± 0,007 2,179 ± 0,004 8,076 ± 0,013 1,554 ± 0,005 0,029 ± 0,003 96h 3,932 ± 0,009 4,131 ± 0,007 9,076 ± 0,010 0,602 ± 0,003 0,039 ± 0,001 120h 5,084 ± 0,002 5,444 ± 0,010 6,995 ± 0,011 0,138 ± 0,003 0,038 ± 0,005 122 Footer Page 132 of 89 Header Page 133 of 89 Bảng PL3 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh γ-PGA pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 24h 0,046 ± 0,003 0,005 ± 0,002 0,316± 0,007 0,342± 0,004 0,005 ± 0,001 48h 0,104 ± 0,006 0,736 ± 0,007 4,470 ± 0,012 4,488 ± 0,007 0,240± 0,007 72h 0,094 ± 0,002 3,985 ± 0,007 5,481 ± 0,009 5,050 ± 0,02 0,279 ± 0,009 96h 0,012 ± 0,001 6,569 ± 0,009 9,780 ± 0,012 13,020 ± 0,008 0,038 ± 0,002 120h 0,008 ± 0,001 5,363 ± 0,011 4,535 ± 0,010 8,947 ± 0,010 OD 216 nm 0.7 0,001 ± 0,000 y = 0.005x + 0.012 R² = 0.991 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 γ PGA (µg/ml) Hình PL2 Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng γ-PGA 123 Footer Page 133 of 89 Header Page 134 of 89 Hình PL3 Ảnh peak giải trình tự chiều 124 Footer Page 134 of 89 Header Page 135 of 89 125 Footer Page 135 of 89 Header Page 136 of 89 OD 490 nm 0.8 y = 0.0583x + 0.1795 R² = 0.992 0.7 0.6 0.5 0.4 10 11 Cacbonhydrat (µg/ml) Hình PL4 Đƣờng chuẩn đánh giá hàm lƣợng carbonhydrat Hình PL5 Bảng phối màu từ ba màu Tiêu chí đánh giá cảm quan sản phẩm nước cam Phƣơng pháp để đánh giá tổng quan mức chất lƣợng sản phẩm loại tất tiêu cảm quan: màu sắc, mùi vị, hình thái Các tiêu đƣợc xây dựng thang thống gồm mức độ điểm( đến điểm) Đối với sản phẩm nƣớc cam cần đánh giá tính chất cảm quan sau: màu sắc, mùi vị hình thái 126 Footer Page 136 of 89 Header Page 137 of 89 Tổng hệ số trọng lƣợng tất tiêu đƣợc đánh giá cho sản phẩm Chất lƣợng sản phẩm đƣợc tính điểm trung bình tiêu nhân với hệ số trọng lƣợng nó.Hệ số trọng lƣợng sản phẩm nƣớc cam đƣợc tính nhƣ sau: Bảng PL4 Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan Màu sắc 1,2 Mùi, vị 2,0 Hình thái 0,8 Tổng Để tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm thành lập hội đồng đánh giá cảm quan gồm thành viên Thành viên đánh giá cảm quan đƣợc yêu cầu quan sát màu sắc, ngửi mùi, nếm vị, thử trạng thái mẫu nƣớc cam, sau đƣa ý kiến cách điền vào phiếu đƣợc phát Lƣợng nƣớc sử dụng 50ml/thành viên/lần đánh giá Tất thành viên đƣợc tập huấn phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng theo bảng hƣớng dẫn sau: Bảng PL5 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc cam Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Màu sắc Mức điểm Yêu cầu Sản phẩm có màu vàng cam Sản phẩm có màu vàng Sản phẩm có màu vàng nhạt Không đặc trƣng Biến màu Biến màu sản phẩm hƣ hỏng Mùi thơm đặc trƣng cam, vị dịu, chua dịu, 1,2 Mùi vị mát 2,0 Mùi thơm đặc trƣng cam có mùi đƣờng, vị vừa Có mùi nồng, vị đậm chua gắt 127 Footer Page 137 of 89 Header Page 138 of 89 Sản phẩm mùi thơm đặc trƣng, vị nhạt, Sản phẩm có mùi vị khác lạ Sản phẩm có mùi vị hƣ hỏng Hình Có lẫn bột quả, lắc phân tán thái Vón nhẹ, lắc tan Vón nhẹ, lắc tan Vón, lắc không tan Vón cục có tạp chất Vón cục lớn, có tạp chất 0,8 Cộng 15 Bảng PL6 Thang điểm đánh giá chất lƣợng sản phẩm nƣớc cam Chất lƣợng tốt 18,6 – 20,0 Chất lƣợng khá: 15,2 – 18,5 Chất lƣợng trung bình: 11,2 – 15,1 Chất lƣợng kém: 7,2 – 11,1 Chất lƣợng kém: – 7,1 Chất lƣợng hỏng: – 3,9 Sau thử, phiếu đƣợc tập hợp lại đễ xử lý thông kê cho tiêu ghi mẫu mẫu đạt điểm cao coi nhƣ tốt Phép thử cho điểm thị hiếu: Để đánh giá tiêu cảm quan, sử dụng phƣơng pháp đánh giá cảm quan cho điểm ƣa thích (Dùng phép thử mô tả thang cƣờng độ có cấu trúc gồm bậc), đánh giá mức độ ƣa thích nhƣ sau: 128 Footer Page 138 of 89 Header Page 139 of 89 Bảng PL7 Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm Cực kì thích điểm Rất thích điểm Thích điểm Hơi thích điểm Không thích không chê điểm Hơi chán điểm Chán điểm Rất chán điểm Cực kì chán điểm Về hình thức mẫu đƣợc giới thiệu hoàn toàn giống đƣợc mã hóa cách ngẫu nhiên để đảm bảo tính khách quan Số liệu thu đƣợc đƣợc phân tích so sánh dựa phƣơng sai sử dụng phần mềm SPSS Tiêu chí đánh giá cảm quan sản phẩm giò Bảng PL8 Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa Màu sắc 0,8 Hình dạng Mùi, vị 0,8 Độ giòn, dai 1,4 Điểm chất lƣợng sản phẩm có giá trị từ đến 20 theo mức chất lƣợng sau: Để tiến hành đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm lập hội đồng đánh giá cảm quan gồm 10 thành viên Các thành viên ngƣời làm giò lụa ngƣời có kiến thức phân tích cảm quan tất thành viên đƣợc tập huấn phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng theo bảng hƣớng dẫn sau: Bảng PL9 Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò Thang điểm Màu sắc Có màu Có màu Có màu Có hồng nhạt, hồng hồng đậm, hồng đậm, hồng đậm, nâu, sáng đồng nhạt, màu 129 Footer Page 139 of 89 tối màu Có màu Có tối, không sẫm, màu tối Header Page 140 of 89 không màu màu màu Mùi, vị Mùi thơm Có đặc trƣng thơmcủa thịt Vị hài Vị hòa, vị nhiên thịt màu mùi Có thịt không mùi Không - thịt Không - mùi thơm Không mùi có mùi thịt, thơm thịt gia mùi gia vị thịt, xuất vị, có mùi Vị vừa tự tự nhiên thịt giảm, đi, xuất của thịt, có vị mặn mùi lạ có vị của gia vị mùi lạ lạ gia vị Hình dạng Phẳng Phồng, méo, cắt mịn, mặt lát méo, phẳng,có lỗ mịn, có mặt lát cắt xơ, có lỗ xơ, bề méo, Phồng bề méo, bề bề mặt lát cắt mặt lát cắt mặt lát cắt gồ xơ, gồ nhiều lỗ mịn, có lỗ hút to ghề, có lỗ ghề, có lỗ hút nhỏ hút to hút vừa có Giò dai hút to Giò có độ Giò không Giò tốt, độ dai độ giòn, giòn, dẻo, giòn, tốt không đƣợc dai 130 Footer Page 140 of 89 Phồng bề phồng, giòn, Độ giòn Giò dai Hơi bề mặt lát đều, hút nhỏ Độ đều, Phẳng dai độ giòn, bở, nát, cấu không dai, trúc nhão nát ... sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày Mục tiêu nghiên cứu đề tài:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ -glutamic từ vi sinh vật  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ -glutamic sản. .. thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ -glutamic  Tinh sạch, thu nhận khảo sát đặc điểm cấu trúc axit poly γ -glutamic  Bƣớc đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ -glutamic vào số sản phẩm thực phẩm Những... thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, đƣợc tổ chức nƣớc quốc tế công nhận Để đáp ứng phần nhu cầu đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận axit poly γ -glutamic hướng ứng dụng thực phẩm