Xác định đồng thời thành phần caffeine, theobromine và theophylline trong một số loại chè phân bố ở miền bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội –2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số:60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri, Bộ môn Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội giao đề tài cho tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt trình làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Chu Đình Bính định hƣớng nghiên cứu cho luận văn này, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Ngọc Châu tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ hoàn thành luận văn Để hoàn thành đƣợc luận văn này, nhận đƣợc nhiều giúp đỡ thầy cô Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự Nhiên Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghiệp rừng, Bộ môn Bảo quản Lâm sản tạo điều kiện thuận lợi để luận văn đƣợc hoàn thành Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè, ngƣời quan tâm giúp đỡ động viên, khuyến khích suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, Ngày 08 tháng 12 năm 2016 Học viên cao học Đoàn Thị Bích Ngọc i MỤC LỤC MỞ ĐẦU 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .12 1.1 Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) Kuntze) 12 1.1.1.Nguồn gốc phân loại loài Chè .12 1.1.2 Thành phần hoá học chè 13 1.2 Hoạt tính nhóm ankaloid 15 1.2.1 Hoạt tính sinh học caffeine 15 1.2.2 Hoạt tính sinh học theophyline 17 1.2.3 Hoạt tính sinh học theobromine .18 1.3.Các phƣơng pháp phân tích thành phần ankaloid 18 1.3.1 Phƣơng pháp điện di mao quản .18 1.3.2 Phƣơng pháp phổ hồng ngoại gần 19 1.3.3 Phƣơng pháp phổ Raman 21 1.3.4 Phƣơng pháp sắc lỏng .22 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Đối tƣợng, mục tiêu nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tƣợng mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị phƣơng pháp HPLC Error! Bookmark not defined 2.2.2 Sắc ký hấp phụ pha ngƣợc RP-HPLC Error! Bookmark not defined ii 2.2.3 Detector UV-Vis Error! Bookmark not defined 2.2.4 Phân tích định lƣợng HPLC Error! Bookmark not defined 2.3 Hóa chất, dụng cụ thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.3.2 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.3 Hóa chất Error! Bookmark not defined Chƣơng KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Khảo sát điều kiện xác định đồng thời caffeine, theobromine theophylline phƣơng pháp HPLC Error! Bookmark not defined 3.1.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký Error! Bookmark not defined 3.1.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đƣờng chuẩn xác định đồng thời caffeine, theophylline theobromine Error! Bookmark not defined 3.2.2 Xác định giới hạn phát LOD giới hạn định lƣợng LOQ Error! Bookmark not defined 3.2.3 Độ chụm (độ lặp lại) Error! Bookmark not defined 3.2.4 Độ (độ thu hồi) Error! Bookmark not defined 3.2.5 Đánh giá, so sánh kết phân tích caffeine mẫu chè phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao luận văn.Error! Bookmark not defined 3.3 Phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phân tích mẫu chè Error! Bookmark not defined 3.3.2 Phân tích mẫu búp chè Error! Bookmark not defined 3.3.3 Đánh giá kết phân tích Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined iii TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG: Bảng 1.1: Thành phần hóa học chè 13 Bảng 1.2: Tổng quan phƣơng pháp RP-HPLC gần cho việc xác định methylxanthine Error! Bookmark not defined Bảng 2.1: Bảng địa điểm lấy mẫu búp chè chè.Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Mối quan hệ bƣớc sóng diện tích picError! Bookmark not defined Bảng 3.2: Khảo sát dung môi pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Khảo sát pH pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Khảo sát thay đổi tốc độ pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Khảo sát dung môi chiết mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Khảo sát khả chiết mẫu chè năm cấp nhiệt độ khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Khảo sát thời gian chiết mẫu chè khác nhauError! Bookmark not defined Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% đƣợc sử dụng trình chiết Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Điều kiện tối ƣu xác định đồng thời TB, TP CF chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.11: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: Bảng giá trị đánh giá sai số hệ thống đƣờng chuẩn Error! Bookmark not defined iv Bảng 3.13: Giới hạn phát tính theo phƣơng trình hồi quyError! Bookmark not defined Bảng 3.14: Giới hạn định lƣợng theo phƣơng trình hồi quy.Error! Bookmark not defined Bảng 3.15: Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Error! Bookmark not defined Bảng 3.16: Bảng tính toán kết độ lặp phép đoError! Bookmark not defined Bảng 3.17: Độ lặp phƣơng pháp mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.18: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Error! Bookmark not defined Bảng 3.19: Độ thu hồi phƣơng pháp phân tích Error! Bookmark not defined Bảng 3.20: Kết xác định phần trăm caffeine mẫu chè hai phòng thí nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 3.21: Bảng chi tiết địa lấy mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.22: Kết phân tích đồng thời theobromine, theophylline caffeine mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.23: Đánh giá kết phần trăm ankaloid mẫu chè tỉnh khác theo phƣơng pháp song sánh giá trị trung bìnhError! Bookmark not defined Bảng 3.24 Bảng chi tiết địa lấy mẫu búp chè.Error! Bookmark not defined Bảng 3.25: Kết phân tích đồng thời theobromine, theophylline caffeine mẫu búp chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.26: Độ lệch chuẩn tƣơng đối mẫu búp chè đo đƣợc tỉnh khác Error! Bookmark not defined v Bảng 3.27: Đánh giá kết phần trăm ankaloid mẫu búp chè tỉnh khác theo phƣơng pháp song sánh giá trị trung bìnhError! Bookmark not defined Bảng 3.28: Tỉ lệ phần trăm khối lƣợng ankaloid mẫu mẫu búp chè Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH VẼ: Hình 1.1: Cấu trúc caffeine, theophyline theobromine 15 Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined Hình 2.2: Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao LC-ATVP Shimazu Nhật Bản Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Phổ hấp thụ cực đại theobromine, theophylline caffeine Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Mối quan hệ bƣớc sóng diện tích pic.Error! Bookmark not defined Hình 3.3: Sắc đồ khảo sát hai loại cột Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Khảo sát dung môi pha động Error! Bookmark not defined vi Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát pH pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Ảnh hƣờng %ACN đến diện tích pic thời gian lƣu Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Ảnh hƣởng tốc độ pha động đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined Hình 3.9: Sắc đồ khảo sát tốc độ pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Quy trình phân tích ankaloid chè Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Ảnh hƣởng dung môi chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Sắc đồ khảo sát dung môi chiết mẫu chè.Error! Bookmark not defined Hình 3.13: Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined Hình 3.14: Sắc đồ điểm nhiệt độ chiết mẫu khác nhauError! Bookmark not defined Hình 3.15: Ảnh hƣởng thời gian chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined Hình 3.16: Sắc đồ thời gian chiết mẫu khác nhauError! Bookmark not defined Hình 3.17: Ảnh hƣởng lƣợng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% với diện tích pic Error! Bookmark not defined Hình 3.18: Sản phẩm phản ứng EGCG với amoniac.Error! Bookmark not defined Hình 3.19: Sắc đồ khảo sát ảnh hƣởng lƣợng dung dịch NH3 1%/ Etanol 60% đƣợc sử dụng trình chiết Error! Bookmark not defined vii Hình 3.20: Khảo sát khoảng tuyến tính (a) theobromine, (b) theophylline (c) caffeine Error! Bookmark not defined Hình 3.21: Đƣờng chuẩn (a) theobromine, (b) theophylline (c) caffeine Error! Bookmark not defined Hình 3.22: Độ lệch chuẩn tƣơng đối ankaloid nồng độ khác Error! Bookmark not defined Hình 3.23: Độ thu hồi ankaloid nồng độ khác nhau.Error! Bookmark not defined Hình 3.24: Phần trăm khối lƣợng ankaloid mẫu chè Error! Bookmark not defined Hình 3.25: Phần trăm khối lƣợng ankaloid mẫu búp chè Error! Bookmark not defined Hình 3.26: Tỉ lệ ba thành phần ankaloid mẫu búp với mẫu chè Error! Bookmark not defined viii 1.1.2.4 Protein axit amin Protein búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lƣợng chất khô chè tƣơi Các axit amin chè bao gồm: aspartic, arginin, alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin theanin … Trong theanin chiếm hàm lƣợng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lƣợng axit amin tự Theanin axit amin đặc trƣng chè, theanin đƣợc tìm thấy họ chè số loài nấm [1] 1.2 Hoạt tính nhóm ankaloid Alkaloid hợp chất hữu hấp dẫn có nhiều nghiên cứu quan tâm đến chúng Các chất caffeine, theophylline theobromine nhóm ankaloid chất thông dụng đƣợc ngƣời sử dụng hàng ngày Các alkaloid có hoạt tính dƣợc lý nhƣ tác nhân trị liệu sinh học Mặc dù cấu trúc hóa học chúng: caffeine (1,3,7-trimethylxantine), theophylline (1,3 dimethylxantine) theobromine (3,7-dimethylxantine) giống nhau, hoạt tính sinh học khác nhau; Ví dụ, tác dụng lợi tiểu thứ tự dƣợc tính tăng: caffeine < theophylline