CHUYEN HOA ACID NUCLEIC

Mục tiêu  Trình bày được quá trình chuyển hóa nucleotid tổng hợp và thoái hóa  Trình bày được các yếu tố tham gia, quá trình tái bản DNA  Trình bày được quá trình sao mã, các yếu tố t

CHUYỂN HÓA ACID NUCLEIC

TS: Trần Huy Thịnh

Bộ môn Hoá sinh, ĐH Y Hà Nội

Bài giảng Chuyên khoa định hướng

dinhhuonghs@gmail.com

Mục tiêu

  Trình bày được quá trình chuyển hóa

nucleotid (tổng hợp và thoái hóa)

  Trình bày được các yếu tố tham gia, quá trình tái bản DNA

  Trình bày được quá trình sao mã, các yếu

tố tham gia và hoàn thiện RNA

Sự hình thành và phát triển của công nghệ DNA/SHPT

 1859: Charle Darwin công bố: “Học thuyết tiến hoá”

 1865: Menden chứng minh: “Các đặc điểm của cha mẹ

có thể truyền cho thế hệ sau”

 1953: Watson & Crick: mô hình chuỗi xoắn kép cho DNA

 1974: Sanger: phát triển phương pháp giải trình tự gen

 1980: Mullis: Phát minh kỹ thuật PCR

 1990: Khởi động dự án giải trình tự gen người

 1996: Nhân bản thành công cừu Doly

 2001: Công bố bản draff trình tự bộ gen người

 1972: Paul Berg: tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp đâu tiên

 Bộ gen người với 24 NST chứa khoảng 3,2 tỷ base pair

 Trình tự nucleotide giống nhau đến hơn 99% và sự khác biệt giữa các cá thể được biểu hiện bằng các SNPs

 Bộ gen người chứa khoảng 30.000 gen

 Hoạt động của bộ gen người điều khiển các hoạt

động: tư duy, ngôn ngữ, đáp ứng miễn dịch…

 Các cá thể có sự khác biệt về tính cách, khả năng cảm nhận, nguy cơ mắc bệnh, đáp ứng với điều trị…

Đặc điểm của bộ gen người

Chuyển hóa nucleotid

Nucleotides

  Gồm 3 thành phần: pentose, base nitơ,

gốc phosphat

Các Base nitơ

Thoái hóa nucleotid

Acid nucleic

Nuclease (tụy), Phosphodiesterase (ruột)

Thoái hóa base nitơ

Thoái hóa base purin

Gout

  Nguyên nhân: tăng uric acid do

kém đào thải hoặc tổng hợp quá

Thoái hóa base

pyrimidin

Nguồn gốc cấu tạo nhân purin

Gồm 4 giai đoạn:

  Tạo glycinamid ribosyl-5’-phosphat

  Tạo nhân imidazol của purin

  Tạo nhân pyrimidin của purin và sự hình thành acid inosin

  Chuyển inosinat (IMP) thành adenylat

(AMP) và guanylat (GMP)

IMP Pathway

Tổng hơp base purin

GĐ1: Phản ứng 1

Tạo PRPP 5-Phosphoribosyl 1-Pyrophosphate

Tổng hơp base purin

5’-Phosphorybosyl- α-pyrophosphate

(PRPP)

Giai đoạn 1:

Phản ứng 2

Tổng hơp base purin

Formylglycinamide Ribotide

(FGRA)

ATP + Glutamine + H2O

ADP + Glutamate +

ATP ADP + Pi

AIR Synthetase

Formylglycinamidine Ribotide

(FGAM) 5-Aminoimidazole Ribotide (AIR)

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 2: Phản ứng 6

ADP + Pi

AIR Carboxylase

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 3: Phản ứng 7

Carboxyamidoimidazole Ribotide

(CAIR)

5-Aminoimidazole- 4-(N-succinylocarboxamide)

Ribotide (SAICAR)

Aspartate

+ ATP

ADP + Pi

SAICAR Synthetase

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 3: Phản ứng 8

5-Aminoimidazole-4-carboxamide)

Ribotide (AICAR)

5-Formaminoimidazole-

4-carboxamide Ribotide (FAICAR)

N 10 -Formyl-

AICAR Transformylase

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 3: Phản ứng 10

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 3: Phản ứng 11

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 4:

Chuyển IMP thành AMP

Tổng hơp base purin

Giai đoạn 4:

Chuyển IMP thành GMP

–  Enzym Amidophosphoribosyl transferase

(APRT) được hoạt hóa bởi nồng độ PRPP

–  Hoạt độ APRT được điều hòa ngược âm tính bởi

Điều hòa tổng hợp

Purine Nucleotid

Tổng hợp pyrimidin nucleotid

Gồm 2 giai đoạn:

  Giai đoạn 1: Tạo thành orotat

  Giai đoạn 2: sự tạo thành pyrimidin

nucleotid

Tổng hợp Pyrimidine nucleotid

Tổng hợp Pyrimidine

Ribonucleotide

Điều hòa tổng hợp pyrimidin Nucleotide

Điều hòa nồng độ Carbamoyl Phosphate qua Carbamoyl Phosphate Synthetase II

Tổng hợp deoxyribonucleotid

  Tổng hợp trực tiếp từ ribonucleotid bằng cách khử oxy ở vị trí C2

  Con đường tận dụng: từ các sản phẩm

chuyển hóa trung gian của quá trình thoái hóa

CHUYểN HÓA ACID NUCLEIC

Thoái hóa DNA

Các deoxyribonuclease thủy phân liên kết phosphodieste trong DNA gồm hai loại:

exonuclease và endonuclease

  Exonuclease thủy phân không chọn lọc

một nucleotid ở đầu 5’ hoặc đầu 3’

  Endonuclease thủy phân giữa chuỗi

polynucleotid

Thoái hóa RNA

  Các ribonuclease gồm hai loại:

  Exonuclease: tạo sản phẩm là

ribonucleotid-5’-phosphat

-  RNA II thuỷ phân theo chiều từ 3’ – 5’

-  RNase V theo chiều 5’ – 3’

  Endonuclease tạo sản phẩm là ribonucleosid

5’-phosphat

-  RNase I kiềm thủy phân vị trí bất kỳ

-  RNase P: hoàn thiện RNA

-  RNase H: đặc hiệu với phân tử lai RNA-DNA

  Quá trình tổng hợp DNA còn được gọi là quá trình tái bản (replication)

  Theo giả thiết của Watson và Crick, mỗi chuỗi DNA là một khuôn để tổng hợp

chuỗi DNA mới theo nguyên tắc bổ xung

  Sự tái bản trước hết được khu trú ở một vùng, sau đó di chuyển dọc theo chiều dài của chuỗi DNA, vùng này gọi là chạc ba tái bản (hình chữ Y)

Tổng hợp DNA

  Một sợi được tổng hợp liên tục (chuỗi

nhanh) còn sợi kia được tổng hợp ngắt

quãng (chuỗi chậm)

  Quá trình tổng hợp chuỗi chậm tạo nên

các đoạn Okazaki Kết thúc quá trình tổng hợp, các đoạn Okazaki này được nối với nhau nhờ sự xúc tác của enzym DNA

ligase

Tổng hợp DNA

Quá trình tái bản của DNA

  Các enzym tham gia quá trình tổng

hợp DNA

  DNA helicase, Protein gắn với chuỗi đơn (SSB

  DNA gyrase (Topoisomerase)

  RNA primase (DnaG protein):

  DNA polymerase I (Pol I)

  DNA polymerase II (Pol II):

  DNA polymerase III (Pol III):

  DNA ligase

Tổng hợp DNA

  Cấu trúc và hoạt động của DNA

polymerase I

Tổng hợp DNA

Tái bản DNA ở E.coli

Theo Kornberg gồm 3 giai đoạn:

  Giai đoạn mở đầu

  Giai đoạn kéo dài

  Giai đoạn kết thúc

Giai đoạn mở đầu

Nhận diện điểm mở đầu: ở E.coli, điểm

mở đầu là đoạn oriC chứa 245 base

  Tạo phức hợp mở đầu: DnaA protein

(52 kD), ATP và protein HU

Vùng giàu AT phía trái của đoạn oriC được

mở xoắn

  Tạo tiền phức hợp mồi: DnaA protein

định hướng cho DnaB6 và DnaC6 gắn vào, giải phóng DnaC

  Tháo xoắn: nhờ SSB, gyrase và DnaB,

enzym gyrase tiếp tục tháo xoắn theo cả hai hướng tạo điều kiện cho primase và

RNA polymerase gắn vào

  Tổng hợp RNA mồi: RNA polymerase

hoạt hóa primase tổng hợp đoạn RNA mồi theo nguyên tắc bổ xung

Giai đoạn mở đầu

Giai đoạn kéo dài

  Tổng hợp đoạn Okazaki: DNA

polymerase III xúc tác tổng hợp đoạn

okazaki nối tiếp với RNA mồi kéo dài tới đoạn RNA mồi tiếp theo

  Tách RNA mồi và thế chỗ bằng DNA:

nhờ DNA polymerase I

  Nối các đoạn Okazaki: nhờ DNA ligase

  Song song tổng hợp chuỗi chậm là tổng hợp chuỗi nhanh nhờ DNA polymerase III

  Yếu tố tham gia: Tus protein

  Tách 2 chuỗi DNA: Nhờ các enzym

topoisomerase

Giai đoạn kết thúc

Quá trình kết thúc sự tái bản

Phản ứng khuếch đại

chuỗi gen, PCR

Ứng dụng:

Chẩn đoán bệnh di truyền: Nhược cơ Duchenne,

 Chẩn đoán xác định bệnh,

 Chẩn đoán người mang gen,

 Chẩn đoán trước sinh

Ứng dụng:

 Điều trị ung thư

Xác định tình trạng gen trong:

“Liệu pháp điều trị đích”

Sửa chữa DNA

Gồm 4 hệ thống enzym sửa chữa:

  Hệ thống enzym sửa chữa những cặp đôi không đúng

  Hệ thống enzym sửa chữa theo từng base (thiếu, thừa, sai…)

  Hệ thống enzym sửa chữa theo cách cắt đoạn nucleotide

  Hệ thống enzym sửa chữa trực tiếp đối với di-pyrimidin và O6-methylguanin

Tổng hơp RNA

-  Tổng hợp RNA là

quá trình chuyển

thông tin di truyền

từ DNA sang RNA

Tổng hợp RNA

  Nguyên tắc giống như sự tái bản DNA:

1) Chiều tổng hợp từ 5’ - 3’

2) Năng lượng do ATP cung cấp

  Khác:

1) Khuôn DNA được bảo tồn hoàn toàn

trong quá trình tổng hợp RNA

2) RNA polymerase không có hoạt tính của

nuclease

3) Quá trình tổng hợp không cần có sự

tham gia của mồi

  Các enzym tham gia tổng hợp RNA

  RNA polymerase phụ thuộc RNA

  Ở E.coli, RNA polymerase phụ thuộc DNA

tổng hợp cả mRNA, tRNA và rRNA vànhận biết vị trí khởi đầu sự sao chép

  Ở tế bào có nhân:

-  RNA polymerase I: tổng hợp rRNA

-  RNA polymerase II: tổng hợp mRNA

-  RNA polymerase III: tổng hợp tRNA và

snRNA (RNA nhỏ của nhân)

Tổng hợp RNA

Các giai đoạn tổng hợp RNA

  Giai đoạn mở đầu

  Giai đoạn kéo dài

  Giai đoạn kết thúc

Tổng hợp RNA

  Giai đoạn mở đầu

  Tạo phức hợp đóng: RNA polymerase

liên kết với promoter trên DNA ở vị trí -35 cùng các yếu tố sao chép TRII và các

protein đặc hiệu

  Tạo phức hợp mở: DNA tháo xoắn 17nu,

RNA polymerase di chuyển đến vị trí -10 xúc tác tổng hợp đoạn ngắn RNA (≈12

nu)

Quá trình

mở đầu sự sao chép

Tổng hợp RNA

  Giai đoạn kéo dài chuỗi:

  RNA polymerase di chuyển, kéo dài chuỗi RNA theo chiều 5’ - 3’ với sự tham gia của các yếu tố kéo dài

  Đoạn DNA sau khi đã được làm khuôn thì ngay tức thì được xoắn lại

Tổng hợp RNA

  Giai đoạn kết thúc:

  Dấu hiệu kết thúc: là một đoạn DNA chứa

các nucleotid có tính chất bổ xung tạo thành đoạn kẹp tóc trên RNA

  Yếu tố tham gia: yếu tố kết thúc Rho

  Tổng hợp đoạn polyA: Khi qua dấu hiệu

kết thúc, RNA polymerase tổng hợp thêm

một đoạn poly U

  RNA polymerase giải phóng khỏi DNA, được dephosphoryl hóa để bắt đầu một chu kỳ

sao chép mới

Quá trình tổng hợp RNA

Hoàn thiện RNA

Quá trình hoàn thiện của các RNA sau sao chép nhờ các enzym có bản chất là

Hoàn thiện mRNA

Cắt đoạn intron: 3 cách

  Cách 1: cần guanin nucleosid làm cầu nối

giữa 2 đầu intron

  Cách 2: cần AMP làm cầu nối

  Cách 3: cần phức hợp nucleoprotein TLPT

nhỏ (snRNPs)

Hoàn thiện mRNA

  Tạo mũ 7-methylguanosin ở đầu 5’ tế

Hoàn thiện mRNA

Gắn thêm đuôi poly A

  mRNA bị cắt một đoạn oligonucleotid nhờ

enzym riboendonuclease bộc lộ đầu 3’OH

  Polyadenylate polymerase xúc tác gắn các

mẩu adenylat vào đầu 3’OH (20-250 nu)

Hoàn thiện tRNA

Để hoàn thiện tRNA cần hơn 100 enzym xúc tác cho các quá trình:

Hoàn thiện rRNA

  Tế bào có nhân: rRNA chưa hoàn thiện

là RNA 45S, sau đó được biến đổi thành rRNA 18S; 5,8S; 28S

  Tế bào không nhân: rRNA chưa hoàn

thiện là RNA 30S, được biến đổi thành

rRNA 16S, 23S, 5S và 1 số tRNA

Sao chép ngược RNA của virus

HIV Replication