BỘ GEN của NGƯỜI trong nghien cuu DNA

BỘ GEN CỦA NGƯỜI BỘ GEN LÀ GÌ? Ý NGHĨA CỦA VIỆC DỰNG BẢN ĐỒ GEN NGƯỜI Bộ gen (genome) toàn đơn vị di truyền chứa đơn bội (n) NST loài Mỗi giao tử bình thường chứa gen, tế bào soma chứa gen Bộ gen người phân bố vị trí xác định gen chuỗi ADN 24 NST người (22 NST thường NST X, Y) Ngày người ta quan tâm đến gen nhân, gen nằm ADN ty thể Trong tế bào sinh dưỡng bình thường, gen nhân có hai gen ty thể phải có hàng ngàn bản, tế bào có nhân có tới ngàn ty thể Bản đồ gen người kết mô tả định vị gen NST người Theo truyền thống đồ phân chia theo vùng tương ứng với băng 24 NST (22 NST thường + X + Y) Trước di truyền học phân tử đời, việc xây dựng đồ gen tiến hành chậm chạp Sự đời di truyền học phân tử gỡ mối bế tắc nghiên cứu xây dựng đồ gen người, vạch đường nét cho nghiên cứu Tháng 10 năm 1990, nước Mỹ lần thức công bố Dự án gen người (Human genome project) Một loạt quốc gia khác Anh, Pháp, Nhật, Canada Đức có đầu tư đáng kể cho Dự án gen người Ba mục tiêu dự án là: - Dựng đồ di truyền (Genetic map) - Dựng đồ hình thể (Physical map) - Xác định trình tự ba tỷ đôi base gen người Xây dựng gen người với việc hoàn thành ba mục tiêu nêu cung cấp kiến thức, sở khoa học để: - Giải thích rõ nguyên nhân, chế nhiều tính trạng bình thường bệnh lý từ có chẩn đoán, điều trị xác hơn, hiệu - Tách dòng gen để nghiên cứu, để sửa chữa gen phục vụ điều trị gen (Gene therapy) - Sản xuất sản phẩm gen (các loại protein) phục vụ đời sống, chẩn đoán, điều trị ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI Khoa học ước tính gen đơn bội người gồm ba tỷ đôi base ADN người ADN Eukaryota khác bao gồm trình tự mã hóa (các exon) xen kẽ với trình tự không mã hóa (intron) Tùy mức độ có mặt chúng nhân mà trình tự ADN chia làm ba loại: - ADN có trình tự nhất: gen mã hóa cho protein, chiếm khoảng 10% gen Thuật ngữ gen có gần kỷ (Johansen, 1909) khái niệm gen, thực thể thật bí ẩn, khám phá tiếp tục Theo nghĩa truyền thống, gen vật chất di truyền định tính trạng xác định, hay nói tương đối xác hơn, sau Mendel, gen đoạn ADN mã hóa protein xác định Nhưng sau người ta thấy không thiết gen định tính trạng mà có nhiều gen định tính trạng biểu gen phụ thuộc nhiều nhân tố nên hình thành loại tính trạng di truyền đa nhân tố Thế biểu gen qua tính trạng, qua kiểu hình, thân gen, chân dung nay, di truyền học phân tử phát triển cao độ khái niệm gen chưa thực hiểu biết hết Các gen dịch protein ARN polymerase II gen gọi gen nhóm II Các gen mã hóa loại protein Gen sinh vật bậc cao bị gián đoạn vùng không mã hóa Thường gen phía ’ vùng chứa yếu tố điều chỉnh, kế vùng khởi động, hai vùng gộp lại thành vùng điều chỉnh Tiếp theo vùng mã hóa Các vùng mã hóa gọi exon bị gián cách vùng không mã hóa gọi intron Exon có thêm vùng gọi vùng khởi đầu dịch mã, exon cuối có thêm phía sau vùng kết thúc dịch mã Hai vùng thuộc exon Số lượng exon gen khác không giống Ví dụ gen fetoprotein huyết chuột nhắt gồm 15 exon: exon ngắn gồm 53 đôi base, exon dài gồm 280 đôi base, tổng chiều dài exon 2229 đôi base Gen cấu trúc người (đoạn ADN) gồm đoạn exon xen kẽ intron Toàn đoạn intron exon phiên mã thành phân tử mARN tiền thân Phân tử mARN tiền thân cắt loại đoạn mRAN phiên mã từ intron nối đoạn mARN phiên mã từ exon để tạo thành phân tử mARN thục Số lượng intron gen giống số lượng exon nó, không giống gen Kích thước gen nói chung biến thiên, có gen lớn triệu đôi base (gen Dystrophin) Không có mối tương quan trực tiếp kích thước protein với chiều dài gen mã hóa nó, người ta thấy chuỗi peptid lớn tương ứng với gen lớn - ADN có trình tự lặp lại nhiều lần (ADN vệ tinh): chiếm khoảng 10 - 15% gen, trình tự không mã hóa Phần lớn ADN vệ tinh khu trú vùng tâm NST, tương ứng với băng C tức phần dị nhiễm sắc cấu trúc Các chuỗi Nu không phân tán NST mà khu trú tập trung, chức chưa rõ ADN lặp lại nhiều lần chia thành hai loại: loại thứ có chuỗi nucleotid ngắn (5 - 10 đôi base) xếp nối đuôi nhau, số lượng tới hàng trăm triệu Các chuỗi tăng methyl hóa tế bào soma giảm methyl hóa tế bào tạo giao tử, NST Y Loại thứ hai có chuỗi Nu dài hơn, từ 100 đến 200 đôi base, xếp nối đuôi Ngoài hai loại có tính khu trú trên, có loại có tính phân tán gọi vệ tinh nhỏ (minisatellite) không nằm vùng dị nhiễm sắc cấu trúc, loại có ích cho việc lập đồ gen - ADN có trình tự lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% gen người, chúng có cấu trúc gồm đoạn chuỗi Nu lặp lại đoạn chuỗi dài hơn, từ 100 đến 1000 đôi base, đồng nhiều so với loại lặp lại nhiều lần Loại ADN phân tán toàn gen, phần lớn chúng không thấy hoạt động phiên mã Chúng không mã hóa có chức phiên mã: chúng gen rARN, tARN số gen khác Ngoài ba loại trình tự kể trên, gen người có gen nhẩy (transposon), đoạn ADN có khả tích hợp vào đâu gen Như vậy, dựng đồ gen bao gồm xác định vị trí gen mã hóa protein (coding genes) đồng thời xác định vị trí đoạn ADN không mã hóa, có tính đa hình Hình 4.2 giới thiệu số lượng gen mã hóa phát theo thời gian Với tiêu chuẩn lập đồ gen người, người ta lập hai loại đồ: đồ di truyền đồ hình thể Bản đồ di truyền dựa vào kết phân tích tổ hợp lại phương pháp thống kê gián tiếp Bản đồ hình thể dựa vào đo đạc trực tiếp chiều dài ADN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH BẢN ĐỒ DI TRUYỀN VÀ BẢN ĐỒ HÌNH THỂ 3.1 Bản đồ di truyền Phương pháp phân tích gen liên kết Phương pháp phân tích gen liên kết phương pháp phân tích cốt yếu để lập đồ di truyền Các gen NST tạo thành nhóm liên kết Các gen liên kết thường phân ly với Mức độ liên kết gen xác định qua phân tích gia hệ Khoảng cách di truyền biểu thị centimorgan (cM) Centimorgan gọi đơn vị tổ hợp lại, khoảng cách hai locus đơn vị tổ hợp lại tần số tổ hợp lại hai locus 1% qua phân bào giảm nhiễm Locus gen quy định tính trạng bệnh xác định (nhóm máu, dạng protein, ADN -RFLP ) coi cột tiêu Khi phân tích gia hệ, tính trạng cột tiêu gen bệnh cần xác định vị trí (gen đích) phân ly độc lập, kết luận gen NST khác NST xa (liên kết không hoàn toàn) Nếu di truyền hai tính trạng cho hai locus gần NST Sự trao đổi chéo xẩy giảm phân sở tái tổ hợp lại Ở người trung bình có khoảng từ 30 - 35 trao đổi chéo qua lần phân bào nam giới, số nữ giới gần gấp đôi Khi dùng enzym giới hạn để cắt ADN, người ta phát thấy tính đa hình chiều dài đoạn ADN cắt enzym (Restriction Fragment Length Polymorphism = RFLP) cá thể khác đa hình di truyền theo Mendel Việc phát đa hình ADN khác (vệ tinh nhỏ, minisatellite) vệ tinh siêu nhỏ (microsatellite) đóng vai trò cột tiêu gen Bằng sử dụng enzym giới hạn ADN dò (DNA probe) thích hợp thúc đẩy nhanh việc xây dựng đồ gen liên kết Hình 4.3 minh họa di truyền nhóm máu ABO MN gia đình bị dị tật giảm sản xương bánh chè, loạn sản móng viêm thận người trưởng thành (Nail - Patella syndrome) Qua phân tích gia hệ thấy bệnh kèm với nhóm máu A (thuộc ABO) mà không kèm với nhóm máu MN Các phân tích gần xác định locus nhóm máu ABO nằm NST số vị trí 9q34, locus bệnh nêu trên NST số gần vị trí 9q34, cách 10 cM Gia hệ cho biết liên kết locus bệnh nêu với locus chi phối nhóm máu MN Điều chứng minh locus nhóm máu MN nằm NST số 3.2 Bản đồ hình thể 3.2.1 Phương pháp lai chỗ (In Situ Hybridization) Phương pháp lai chỗ phương pháp vừa di truyền tế bào vừa di truyền phân tử Phương pháp thường dùng lai NST kỳ NST nhân tế bào gian kỳ với ADN dò đánh dấu đồng vị phóng xạ phẩm nhuộm huỳnh quang Quan sát có mặt đoạn ADN đích đoạn ADN lai tự chụp hình phóng xạ kính hiển vi huỳnh quang Bằng phương pháp chuỗi nhẹ kappa globulin miễn dịch xác định có locus nhánh ngắn NST số 3.2.2 Phương pháp lập đồ đoạn Phương pháp dựa vào có vắng mặt vùng đặc biệt locus ADN lấy từ bệnh nhân có bất thường NST hay từ mẫu lai tế bào soma người gặm nhấm, mẫu có chứa đoạn ADN biết trước NST người Lập đồ đoạn đặc biệt có ích cho lập đồ NST X số lượng lớn bất thường NST X xác định 3.2.3 Thông tin khoảng cách hình thể Vẫn phải nhờ phương pháp lập đồ giới hạn với enzym giới hạn loại cắt đoạn ADN có độ dài lớn (từ 100 Kb đến Mb) Các đoạn ADN giới hạn (là đoạn ADN sau cắt enzym giới hạn) lai với mẫu đánh dấu tế bào phương pháp Southern blotting, bao gồm giai đoạn cắt ADN, tách ADN điện di, thấm ADN từ gel agarose điện di lên màng nitrocellulose nylon sau lai ADN đọc chụp hình phóng xạ đánh dấu đồng vị phóng xạ đọc theo phương pháp huỳnh quang đánh dấu nhuộm huỳnh quang 3.2.4 Phương pháp dùng nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC) để tạo gen đơn dòng Phương pháp phương pháp đặc biệt hữu hiệu để lập đồ hình thể YAC NST nhân tạo cực nhỏ gồm đủ tín hiệu đặc hiệu NST nấm men (các yếu tố phiên mã, phần tâm đầu mút) để làm vector đưa gen lạ vào dòng gen tế bào Eukaryota nấm men YAC bảo đảm nhân lên trung thành bền đoạn ADN lạ tế bào Eukaryota Ưu điểm YAC tiếp nhận đoạn dài hàng vài trăm Kb (100 - 1000 Kb) tức khả lớn gấp từ đến 40 lần khả cosmid (cosmid vector dùng để tạo gen đơn dòng có nguồn gốc từ phage À) Với phương pháp nhân ADN có chiều dài lớn YAC, tốc độ lập đồ hình thể gia tăng gấp bội dự án đồ hình thể gen người có nhiều hy vọng sớm hoàn thành sở phân tích phân tử gen người có thêm nhiều thuận lợi 3.2.5 Phương pháp lai tế bào sinh dưỡng khác loài Lai tế bào sinh dưỡng người chuột nhắt thường dùng Tế bào lai ban đầu chứa NST người (46 NST) chuột (40 NST) nuôi cấy số NST người bị cách ngẫu nhiên NST chuột giữ nguyên Bộ NST người lại cấy truyền để trì Bộ NST người chuột phân biệt hình thái NST nhuộm giemsa Sau ví dụ: tế bào người lai với dòng tế bào chuột nhắt chủng tính chất khiếm khuyết thymidin kinase Enzym cần cho sống sót tế bào Các tế bào chuột sống sót có mang gen người mã hóa thymidin kinase Quan sát cho thấy tế bào lai sống sót NST số 17 người Điều chứng tỏ gen mã hóa thymidin kinase nằm NST số 17 người 3.2.6 Phương pháp xác định liều gen (Gene - dosage methods) Phương pháp xác định liều gen phương pháp xác định số lượng gen, cụ thể xác định số lượng gen hay trình tự Nu chưa rõ loại mẫu dò đặc hiệu so sánh mật độ tín hiệu gen đích lai với mật độ tín hiệu dùng làm đối chứng Mật độ tín hiệu đo phương pháp tự chụp hình phóng xạ Các NST thường tồn cặp tế bào sinh dưỡng Trong điều kiện bình thường hai alen gen hoạt động, gen mã hóa enzym đó, hoạt độ enzym đạt 100% Nếu alen bị đột biến (mất đi) hoạt độ enzym 50%; hoạt độ enzym đạt 150% người thể ba nhiễm Phương pháp xác định liều gen sử dụng dựng đồ gen, chủ yếu qua quan sát, xét nghiệm lâm sàng Bằng phương pháp người ta xác định số locus, ví dụ xác định gen mã hóa enzym phosphatase nằm nhánh ngắn NST số 3.2.7 Phương pháp tạo gen đơn dòng định vị (Positional cloning) Phương pháp tạo gen đơn dòng định vị tạo gen đơn dòng gen chưa biết phương pháp lập đồ di truyền, đồ hình thể từ định vị xác vị trí gen phần đồ liên quan, thủ thuật hay dùng di truyền học ngược Khái niệm di truyền học ngược (Reverse Genetics) Theo kinh điển, muốn phân lập gen người ta bắt buộc phải xác định trước sản phẩm đặc trưng protein Từ protein suy mARN, cấu tạo kháng thể, cấu trúc mẫu dò có số lượng Nu ngắn nhờ chuỗi polypeptid Và bệnh Hb, bệnh máu khó đông nhờ biết trước protein khuyết tật mà người ta tìm gen khuyết tật Quy trình nghiên cứu gọi quy trình di truyền học kinh điển Khi phát RFLP (các đa hình độ dài đoạn ADN giới hạn) người ta xây dựng quy trình phân lập gen RFLP giúp cho người ta xây dựng đồ gen người mà giúp khám phá gen tiềm ẩn Đầu tiên người ta phân lập trình tự Nu tạo dòng ADN gen có bệnh phẩm di truyền (locus bệnh), chức nghiên cứu (hình thái học phát sinh, biệt hóa chu kỳ tế bào) hay kiểu hình (phenotyp) tế bào (kiểu hình chuyển dạng tế bào ung thư) Khi đoạn ADN nói phân lập, người ta tìm hiểu thông tin dạng trình tự Nu mã hóa từ suy trình tự acid amin protein Trong trình nghiên cứu không loại trừ phân lập chuỗi trình tự Nu vô nghĩa Quy trình nghiên cứu gen đến protein nên người ta gọi “Di truyền học ngược” (Reverse genetic) sau gọi phương pháp tạo gen đơn dòng định vị (Positional cloning) Ví dụ xác định đồ gen bệnh mucoviscidose: Về bệnh mucoviscidose, người ta biết rõ biểu lâm sàng protein liên quan đến bệnh người ta Các nhà nghiên cứu biết, nhờ phân tích liên kết gen nội gia đình có trẻ bị bệnh mucoviscidose thấy gen bệnh nằm NST số 7, vị trí Met locus D758, hai chuỗi trình tự Nu cách xa tới 1600 Kb Họ phải dùng phương pháp tiến dần theo chiều dọc NST Kỹ thuật gồm: cắt ADN thành nhiều đoạn nhờ enzym cắt Họ để ý thấy đoạn ADN cắt nằm phía 5’ nhận diện mẫu dò Rồi họ dùng đầu mút ’ đoạn mẫu dò để tiếp tục định vị cho đoạn ADN gối đoạn cũ, đoạn kéo dài theo hướng tiếp đầu 3’ (và gần gen cần phân lập hơn) tiếp tục Tất đoạn ADN cắt enzym giới hạn định hướng Và gen tiềm tàng phải định vị Cuối phải xác định vùng khu vực mã hóa tương ứng với gen bệnh mucoviscidose Họ thận trọng làm việc so sánh mARN phân lập tế bào khác bệnh nhân mucoviscidose Kết gen gồm 280 Kb xác định gen bệnh mucoviscidose Nó chứa 27 exon mã hóa protein dài 1480 aa Protein gọi tên “CFTR” (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) protein phụ trách vận chuyển ion clo qua màng (từ tế bào) Nó gồm có từ đầu mút N đến đầu mút C phân tử protein: vùng gồm sáu đoạn xuyên màng, vùng NBF (Nucleotid Binding Fold) nối gắn ATP, vùng điều chỉnh R gồm vị trí phosphoryl hóa, vùng khác gồm sáu đoạn xuyên màng, vùng NBF khác liên kết với ATP Các vùng xuyên màng tạo nên kênh vận chuyển clo Khi phosphoryl hóa vùng R xẩy ATP liên kết với hai vùng NBF kênh clo mở ra, ion Cl" rời khỏi tế bào Ngày nay, 400 bất thường phân tử gen bệnh mucoviscidose mô tả Đột biến hay gặp loại đoạn Nu exon 10 dẫn tới sinh protein acid amin thứ 508 phenylalanin - Đột biến nằm vùng NBF Do thiếu phenylalanin, ATP không gắn được, điều gây nhiễu cho chức kênh Cl, ion Cl- tích tụ lại tế bào với chúng ion Na+, mà nước lại tế bào Chất nhầy tiết tế bào chứa không đủ lượng nước bình thường trở nên nhớt Thêm nữa, protein CFTR mang đột biến F508 màng tế bào Khuyết tật độ thục nguyên nhân để tồn tế bào chất thay đến định cư màng tế bào Hình 4.5 sơ đồ phương pháp tạo gen đơn dòng định vị 3.2.8 Phương pháp phân tích hình thái nhiễm sắc thể Phân tích hình thái NST giúp cho xác định vị trí gen - Bằng phân tích đa hình NST, Donahue xác định nhóm máu Duffy có locus NST số Phương pháp quan sát đoạn NST dùng để xác định gen đột biến bệnh retinoblastoma, bệnh Prader - Willi - Hiện tượng trao đổi đoạn dùng để xác định locus, ví dụ điển hình chuyển đoạn NST X NST thường nữ bị bệnh loạn dưỡng Duchenne (một bệnh gặp nữ) Qua phương pháp người ta xác định gen chi phối bệnh loạn dưỡng Duchenne Xp21 3.3 Bản đồ gen bệnh (khi chưa có mARN tay) Nhiều bệnh di truyền triệu chứng hình thái (có thể có không thấy) biểu mức độ phân tử protein tức sản sinh protein không bình thường chất lượng số lượng Nếu bất thường chất lượng protein nguyên liệu khởi đầu để tìm gen mã hóa Một phương pháp gọi phiên mã ngược cho phép thông qua mARN cấu trúc nhân tạo theo trình tự acid amin phân tử protein bất thường ấy, từ mARN nhân tạo nhờ enzym phiên mã ngược tổng hợp cADN (ADN bổ sung) cADN đánh dấu người ta có mẫu dò đánh dấu dùng cho kỹ thuật lai chỗ Southern blotting để định vị gen gây bệnh NST mang Đây phương pháp dùng để lập đồ gen bệnh CÁCH GHI TRONG BẢN ĐỒ GEN Có đồ chung cho gen thể, có đồ riêng cho gen liên quan với bệnh tật (Morbid gene - map) Có nhiều cách ghi đồ gen: ghi sơ đồ NST, ghi bảng thống kê Dù ghi theo cách thông tin sau cần có: Tên bệnh hay tính trạng; tên gen chi phối bệnh hay tính trạng; ký hiệu gen; mã số bệnh hay tính trạng theo Mc Kusick (Mck); vị trí gen XÁC ĐỊNH TRÌNH Tự NUCLEOTID CỦA ADN TRONG LẬP BẢN ĐỒ GEN NGƯỜI Công việc lĩnh vực độc lập tương đối độc lập gen học hay Bản đồ gen mà xẩy hầu hết nghiên cứu gen, nói đến gen nói đến ADN, nói đến ADN nói đến Nu, mà “giải trình tự Nu ADN” công việc quen thuộc lĩnh vực nghiên cứu gen Điếm khác là: - “Giải trình tự Nu” nhằm gọi tên theo trình tự tất tỷ Nu 22 NST thường NST giới X, Y người - Cố gắng xác định chức đoạn trình tự, phần gen, phần gen, phần đóng vai trò phụ điều chỉnh biếu hiện, phần hoàn toàn chưa rõ chức Những tiến sinh học phân tử đặc biệt mặt kỹ thuật tạo cho Dự án đồ gen người hoàn thành phần việc quan trọng nhất: xác định trình tự ba tỷ đôi base gen người Việc phát loại enzym kỹ thuật di truyền, đặc biệt enzym giới hạn, enzym nối, việc phát liên tục cải tiến phương pháp xác định trình tự gen, gần phương pháp thăm dò trình tự màu huỳnh quang (Four - colour fluorescence - base - sequence detection), xác định trình tự vòng, phương pháp điện di mao quản cung cấp công cụ cần thiết hữu hiệu cho xác định trình tự gen người Các kỹ thuật có nhiều tóm tắt bước sau: - Phân lập ADN - Tạo gen đơn dòng ADN - Cắt đặc hiệu ADN - Nhân đoạn ADN invitro (PCR) - Biến tính ADN - Đánh dấu ADN - Nối xác ADN - Đọc trình tự Nu, cần đọc tự động máy, kết đọc lưu giữ đĩa nhờ máy tính Sau nguyên lý phương pháp xác định trình tự Nu ADN lập đồ gen người: ADN dù dài ngắn có chức có loại Nu Người ta dùng chất đánh dấu huỳnh quang loại khác đặc trưng riêng cho loại Nu Biến tính mẫu ADN cần xác định Chuẩn bị lượng Nu loại đánh dấu đủ cho lai bổ sung Lai bổ sung mẫu ADN sợi đơn cần nghiên cứu với Nu đánh dấu Cho vào máy đọc trình tự Nu tự động (sequenceur) Nguyên lý đọc máy có khả nhận diện màu huỳnh quang khác tự động ghi Nu qua máy lưu trữ số liệu vào máy Ngày 26 tháng năm 2000 Dự án gen người công ty tư nhân Celera Genomics công bố phác thảo gen người Ngày 12 tháng năm 2001 Dự án gen người Celera genomics công bố trình tự đầy đủ gen người tạp chí Nature Science Theo công bố, loài người có 31780 gen mã hóa protein, số lượng nhiều theo dự đoán trước Sau đồ gen người hoàn thành việc nghiên cứu sản phẩm phiên mã hệ protein đẩy mạnh DỰ ÁN BỘ GEN NGƯỜI Dự án gen người công trình to lớn nhiệm vụ đầy tham vọng lịch sử nghiên cứu y sinh học Khởi đầu năm 1990, dự án dự kiến thực 15 năm gồm mục tiêu: Xây dựng đồ di truyền; Xây dựng đồ hình thể; Xác định trình tự tỷ đôi base gen người Khi Dự án gen người hoàn thành thu tiến vượt bậc Bản đồ marker hoàn thành vài năm trước với gần 20000 cấu trúc đa hình phát phân bố toàn bộ gen người Đó cấu trúc đa hình RFLPs, VNTRs vệ tinh siêu nhỏ (microsatellite) Trung bình, với tác dụng tính đa hình phát cấu trúc khoảng cM Hơn nữa, bệnh phát nhờ có marker liên kết Dự án thu thập 300000 tính đa hình nu đơn lẻ SNPs (single nuleotide polymorphism) phân bố toàn bộ gen SNPs nu đơn lẻ khác đa hình cấu trúc vệ tinh siêu nhỏ VNTR Tuy vậy, chúng lại đột biến loại đa hình Vì chúng có tác dụng đẩy mạnh việc xây dựng đồ di truyền người Mục tiêu thứ hai xây dựng đồ hình thể để xác định phân bố STSs (sequence tagged sites) với chiều dài 100 kb phân bố toàn bộ gen hoàn thành với 68000 STSs vào khoảng đầu năm 2000 Các vị trí cột tiêu đồ hình thể có giá trị to lớn thí nghiệm nhân dòng gen vị trí, nơi gắn hàng loạt đoạn chuỗi (ví dụ gắn đoạn chuỗi ADN vào YACs, BACs, PACs cosmids) trật tự định Mục tiêu cuối xác định vị trí nu gen người với nhiều phương pháp nhiệm vụ khó khăn Bắt đầu từ thư viện NST đặc hiệu thu hàng nghìn đoạn chuỗi xen kẽ đoạn dài 1000 bp nhỏ Tiếp xếp chuỗi trật tự chuỗi nu NST, nhiệm vụ to lớn tồn khoảng trống gây trở ngại đoạn lặp lại hay cấu trúc tương tự Cần phải nhiều cố gắng phát triển phương pháp muốn rút ngắn thời gian kinh phí Để tiến tới đạt xác cao, phải chấp nhận tỷ lệ sai số 1/10.000 nu Xác định trình tự nu gen số loài có cấu trúc gen nhỏ đơn giản (ví dụ vi khuẩn (E.coli), nấm men (S.cerevisiae) ruồi dấm (Drosophil melanogaster)) giúp cho việc tối ưu phương pháp thực gen lớn người Hơn nữa, tương đồng sinh vật người giúp cho hiểu rõ chất bệnh gen người Các bước trình xác định trình tự chuỗi nu gen người đẩy mạnh nhanh chóng Chuỗi nu NST hoàn chỉnh NST số 22 công bố năm 1999 (toàn chuỗi nu thực chất chưa thực hoàn chỉnh có khoảng trống nhỏ, vùng dị nhiễm sắc nơi không chứa gen chưa xác định cấu trúc) Dự thảo gen người có 90% ADN biết cấu trúc dự kiến hoàn thành vào khoảng năm 2000 có tác dụng tốt chứa hầu hết gen gen người Dự kiến hoàn thành xác dự án gen người không sau năm 2003, xác hoàn thành 50 năm sau Watson Crick tìm cấu trúc ADN Khi Dự án gen người hoàn thành có nhiều lợi ích Trước hết, dự án đồ gen hoàn chỉnh nhờ ứng dụng to lớn đồ marker Sự nhân dòng gen vị trí thủ thuật hay dùng khả thi có hiệu đồ hình thể Số thời gian cần thiết để xác định vị trí gen nhờ nhân dòng gen vị trí giảm nhiều số gen bệnh tìm cách tăng lên hàng năm Sự nhân dòng gen bệnh có nhiều lợi ích quan trọng: cải thiện chẩn đoán bệnh tật di truyền, sản xuất sản phẩm gen nhờ kỹ thuật tái tổ hợp ADN, cải thiện phương pháp điều trị nhờ thuốc đặc hiệu liệu pháp gen Khi hoàn thành, Dự án gen người làm sáng tỏ trường hợp khó khăn trước Khi có tay cấu trúc nu gen người đưa “bản thiết kế di truyền” cuối người Với số lượng khổng lồ cấu trúc ADN không mã hóa làm ngạc nhiên chứng mà trước chưa biết rõ sinh học nguồn gốc Thật thiếu sót nghĩ rằng, hoàn thành cấu trúc nu gen người kết thúc nghiên cứu kỷ nguyên Cấu trúc nu chuỗi ADN với giá trị vô to lớn lớn chiều dài cấu trúc chuỗi ADN Nhiệm vụ to lớn tiếp tục xác định cấu trúc, điều hòa biểu gen tương tác phức tạp gen yếu tố môi trường để cuối biểu tính trạng Cấu trúc chuỗi nu gen người khởi đầu, tiếp tục sau khám phá kỷ nguyên lĩnh vực nghiên cứu sinh học vô to lớn đầy lý thú Tìm hiểu kỹ thuật giải trình tự ADN ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử virus Giải trình tự gì? Thông tin di truyền thể sinh vật chứa đựng phân tử có tên ADN (acid deoxynucleic), chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine) T (thymine) Các nucleotide nối trình tự xác định, khác loài, chí thể Giải trình tự ADN kỹ thuật giúp xác định xếp bốn loại nucleotide A, T, C, G phân tử ADN, nhờ nghiên cứu đặc điểm di truyền mức độ sinh học phân tử Các phương pháp giải trình tự ADN Phương pháp Maxam Gilber Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam Walter Gilbert phát minh phương pháp hóa học xác định trình tự nucleotide chuỗi ADN Theo phương pháp để giải trình tự ADN trước hết phân tử ADN đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P đầu 5’ Sau chúng chia thành nhóm, nhóm xử lý hóa chất khác nhằm làm biến đổi đặc trưng loại nucleotide cắt phân tử ADN nucleotide Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, C Kết tạo thành đoạn oligonucleotide có chiều dài khác Các đoạn phân tách gel polyacrylamide hiển thị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ kết phóng xạ tự ghi bốn nhóm xác định vị trí bốn loại nucleotide chuỗi ADN Bảng đọc kết trình tự theo phương pháp Maxam Gilber Phương pháp hóa học xác định trình tự ADN Maxam Gilbert thực tế dễ thực cần phải xác định nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, khó phải xác định nồng độ giới hạn chất hóa học cho xử lý mẫu ADN đoạn ADN có base bị biến đổi Chính phức tạp này, phương pháp Maxam-Gilber sử dụng, mà thay vào nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp Sanger Phương pháp Enzyme Sanger cộng phát minh vào năm 1977, ngày hôm phương pháp ngày hoàn thiện thực dễ dàng phòng thí nghiệm Để thực phương pháp này, trước hết, đoạn ADN cần xác định trình tự phải tạo dòng vào vector để nhân thành nhiều tế bào vi khuẩn, sau tách chiết tinh khiết vector từ vi khuẩn để thành vector tự Lượng ADN sau tách chiết phân vào bốn ống nghiệm khác để thực phản ứng giải trình tự Mỗi phản ứng bao gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí đoạn chèn ADN, enzyme ADN polymerase, bốn loại dNTP 1% loại ddNTP ddNTP dideoxynucleotide triphosphate có cấu trúc hóa học gốc OH vị trí carbon thứ đường deoxyribose làm cho dNTP gắn vào Do kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi Kết tạo mạch ADN có chiều dài khác tương ứng với vị trí trình tự nucleotide đoạn ADN gốc Các ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P hay 35S Sau điện di gel polyacrylamide giống phương pháp Maxam-Gilbert, vạch điện di hiển thị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ vạch xác định trình tự ADN Bảng đọc kết trình tự theo phương pháp Sanger Giải trình tự máy giải tự động Ngày nay, việc giải trình tự thực dễ dàng nhờ có hỗ trợ máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý phương pháp Sanger có cải biến Trong ddNTP không đánh dấu phóng xạ mà đánh dấu chất huỳnh quang khác cho loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm thành phần như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận xử lý tín hiệu Các vạch điện di mao quản phát sáng qua chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu ghi lại mã hóa thành nucleotide A, T, C, G Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động Ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử virus Virus nhóm vi sinh vật nhỏ chưa có cấu tạo tế bào Vật liệu di truyền virus đa dạng bao gồm ADN sợi đôi, ADN sợi đơn, ARN sợi đơn, ARN sợi đôi, v.v Trong virus có vật liệu di truyền ARN chiếm đa số Và dù ADN hay ARN, tất thông tin di truyền đọc dạng A, T, G, C theo trình tự ADN Do giải trình tự ADN áp dụng nhóm virus ARN Theo đó, để gải trình tự ARN virus ARN virus tách chiết từ mẫu bệnh phẩm, sau chuyển đổi ngược thành cDNA, nhân lên kỹ thuật PCR Thông tin di truyền giải mã máy giảitự động Các bước giải trình tự gen virus: - Tách chiết vật liệu di truyền ADN hay ARN virus từ mẫu, - Thực phản ứng PCR hay RT-PCR để tăng lượng giới hạn vùng gen cần giải virus với mồi chuyên biệt, - Tinh sản phẩm PCR, - Thực phản ứng PCR giải trình tự với mồi chất ddNTP để tạo đoạn ADN có kích thước khác với đầu tận ddNTP có đánh dấu chất phát huỳnh quang, - Tinh sản phẩm PCR giải tình tự để loại ddNTP thừa mồi dư, - Thực giải trình tự máy giải tự động Những ứng dụng nghiên cứu: - Định danh virus: Trong trường hợp xét nghiệm virus kỹ thuật PCR cho kết vạch không đặc hiệu khó xác định hay nghi ngờ kỹ thuật giải trình tự giúp định danh xác loại virus có trình tự riêng biệt, không trùng lẫn với loài khác - Xác định kiểu gen: Kiểu gen (genotype) kiểu gen khác loài virus Việc phân biệt kiểu gen khác dựa khác số nucleotide gen Xác định kiểu gen giúp nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus gây bệnh truyền nhiễm Chẳng hạn virus sởi có 23 kiểu gen khác ký hiệu theo chữ chữ số ví dụ kiểu A, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, D3, D4, D5, H1, H2, Ở Việt Nam, kiểu gen sởi lưu hành chủ yếu H1, H2, D5 - Nghiên cứu đột biến Giải trình tự gen virus giúp nghiên cứu đột biến trình tự nucleotide mà không kỹ thuật xác định Ví dụ đột biến kháng thuốc virus cúm Đột biến xảy gen N virus cúm N gen mã hóa enzyme neuraminidase giúp virus hòa màng chui vào tế bào chủ Thuốc tamiflu (oseltamivir) chất giả dạng với cơchất neuraminidase, gắn vào neuraminidase làm virus xâm nhiễm vào tế bào chủ Đột biến gen N khiến tamiflu không gắn vào neuraminidase không ức chế hoạt động virus Đột biến kháng thuốc khác đột biến vùng DNA Polymerase virus viêm gan B Đột biến ngày quan tâm, đích tác động thuốc Lamivudine Đột biến kháng Lamivudine hay gọi tên YMDD Khi kết có đột biến bác sĩ biết bệnh nhân có kháng với thuốc cần phải thay đổi chế độ thuốc cho bệnh nhân để từ đạt kết điều trị tốt Tóm lại giải trình tự bước tiến kỹ thuật, công cụ hỗ trợ đắc lực cho xét nghiệm nghiên cứu sinh học phân tử virus, giúp người ngày hiểu rõ kiểm soát bùng phát virus gây bệnh [...]... hiệu của gen; mã số của bệnh hay tính trạng theo Mc Kusick (Mck); vị trí của gen 5 XÁC ĐỊNH TRÌNH Tự NUCLEOTID CỦA ADN TRONG LẬP BẢN ĐỒ GEN NGƯỜI Công việc này không phải chỉ là một lĩnh vực độc lập hoặc tương đối độc lập của bộ gen học hay của Bản đồ gen mà nó xẩy ra trong hầu hết các nghiên cứu về bộ gen, vì đã nói đến bộ gen là nói đến ADN, và nói đến ADN là nói đến Nu, mà “giải trình tự Nu của ADN”... Ngày 26 tháng 6 năm 2000 Dự án bộ gen người và công ty tư nhân Celera Genomics đã công bố phác thảo bộ gen người Ngày 12 tháng 2 năm 2001 Dự án bộ gen người và Celera genomics đã công bố trình tự đầy đủ bộ gen người ở tạp chí Nature và Science Theo công bố, loài người có 31780 gen mã hóa protein, số lượng này ít hơn nhiều theo dự đoán trước đó Sau khi bản đồ gen của người được hoàn thành về cơ bản... 6 DỰ ÁN BỘ GEN NGƯỜI Dự án bộ gen người là một trong những công trình to lớn nhất và là nhiệm vụ đầy tham vọng trong lịch sử nghiên cứu y sinh học Khởi đầu năm 1990, dự án dự kiến thực hiện trong 15 năm gồm 3 mục tiêu: 1 Xây dựng bản đồ di truyền; 2 Xây dựng bản đồ hình thể; 3 Xác định trình tự của hơn 3 tỷ đôi base trong bộ gen người Khi Dự án bộ gen người hoàn thành sẽ thu được những tiến bộ vượt... định trình tự nu trong bộ gen của một số loài có cấu trúc bộ gen nhỏ và đơn giản hơn (ví dụ như ở vi khuẩn (E.coli), nấm men (S.cerevisiae) và ở ruồi dấm (Drosophil melanogaster)) đã giúp cho việc tối ưu hơn các phương pháp thực hiện ở bộ gen lớn hơn của người Hơn nữa, sự tương đồng giữa các sinh vật đó và người giúp cho chúng ta hiểu rõ hơn bản chất của các bệnh gen ở người Các bước của quá trình xác... tác dụng rất tốt vì chứa hầu hết các gen của bộ gen người Dự kiến hoàn thành chính xác dự án bộ gen người không sau năm 2003, chính xác là hoàn thành 50 năm sau khi Watson và Crick tìm ra cấu trúc của ADN Khi Dự án bộ gen người hoàn thành sẽ có rất nhiều lợi ích Trước hết, dự án bản đồ gen sẽ được hoàn chỉnh nhờ các ứng dụng to lớn của bản đồ các marker Sự nhân dòng gen bằng vị trí là một thủ thuật hay... một trong những phương pháp được dùng để lập bản đồ gen bệnh 4 CÁCH GHI TRONG BẢN ĐỒ GEN Có bản đồ chung cho mọi gen của cơ thể, nhưng cũng có bản đồ riêng cho các gen liên quan với bệnh tật (Morbid gene - map) Có nhiều cách ghi trong bản đồ gen: có thể ghi trong sơ đồ NST, nhưng cũng có thể ghi trong bảng thống kê Dù ghi theo cách nào các thông tin sau đây cần có: Tên bệnh hay tính trạng; tên gen. .. bố trong toàn bộ bộ gen người Đó là các cấu trúc đa hình của RFLPs, VNTRs và vệ tinh siêu nhỏ (microsatellite) Trung bình, với tác dụng của tính đa hình có thể phát hiện được cấu trúc trong khoảng 1 cM Hơn nữa, các bệnh sẽ được phát hiện nhờ có các marker liên kết Dự án có thể thu thập được trên 300000 tính đa hình của các nu đơn lẻ SNPs (single nuleotide polymorphism) phân bố trong toàn bộ bộ gen. .. hơn và liệu pháp gen Khi hoàn thành, Dự án bộ gen người sẽ làm sáng tỏ những trường hợp khó khăn trước đây Khi có trong tay cấu trúc của các nu trong bộ gen người và đưa ra “bản thiết kế di truyền” cuối cùng của con người Với số lượng khổng lồ các cấu trúc ADN không mã hóa sẽ làm chúng ta ngạc nhiên về những bằng chứng mà trước đây chúng ta chưa được biết rõ về sinh học và nguồn gốc của chúng ta Thật... trúc các nu trong bộ gen người là kết thúc nghiên cứu của kỷ nguyên Cấu trúc các nu trong chuỗi ADN với giá trị vô cùng to lớn của nó vẫn không thể lớn hơn được chiều dài cấu trúc của chuỗi ADN Nhiệm vụ to lớn của chúng ta là tiếp tục xác định cấu trúc, sự điều hòa và sự biểu hiện của gen cũng như sự tương tác phức tạp giữa gen và yếu tố môi trường để cuối cùng biểu hiện ra tính trạng Cấu trúc của các... bước của quá trình xác định trình tự chuỗi nu trong bộ gen người đã đẩy mạnh nhanh chóng Chuỗi nu của NST đầu tiên được hoàn chỉnh là NST số 22 đã được công bố đầu tiên năm 1999 (toàn bộ chuỗi nu thực chất chưa thực sự hoàn chỉnh vì còn có những khoảng trống nhỏ, những vùng dị nhiễm sắc nơi không chứa gen vẫn chưa xác định cấu trúc) Dự thảo của bộ gen người trong đó có trên 90% ADN được biết cấu trúc ... tháng năm 2000 Dự án gen người công ty tư nhân Celera Genomics công bố phác thảo gen người Ngày 12 tháng năm 2001 Dự án gen người Celera genomics công bố trình tự đầy đủ gen người tạp chí Nature... Tách dòng gen để nghiên cứu, để sửa chữa gen phục vụ điều trị gen (Gene therapy) - Sản xuất sản phẩm gen (các loại protein) phục vụ đời sống, chẩn đoán, điều trị ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI Khoa... loài người có 31780 gen mã hóa protein, số lượng nhiều theo dự đoán trước Sau đồ gen người hoàn thành việc nghiên cứu sản phẩm phiên mã hệ protein đẩy mạnh DỰ ÁN BỘ GEN NGƯỜI Dự án gen người