Nghiên cứu trích ly màu hạt điều màu 2

Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ Do đặc điểm cấu trúc của màu annatto là có tính phân cực trung bình nên các loại dung môi phù hợp cho trích ly màu annatto cũng có độ phân cực

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mặc dầu đã được sử dụng rộng rãi do tính tiện dụng, màu bền và giá rẻ nhưng phẩm màu tổng hợp hiện nay được xem là không an toàn đối với người tiêu dùng Một số màu tổng hợp có nguy cơ gây ung thư, một số khác được cho là gây rối loạn thần kinh, rối loạn tiêu hoá hoặc ngộ độc Vì vậy màu tự nhiên ngày càng nhận được sự quan tâm nhiều hơn, trong đó có màu annatto chiết từ hạt điều màu Annatto là màu tự nhiên đã được sử dụng khá rộng rãi trong dân gian bằng phương thức chao dầu hạt điều màu để tạo màu cho các món ăn Trong công nghiệp thực phẩm, chúng được xếp hàng quan trọng thứ hai chỉ sau caramel và đã được CODEX đưa vào danh mục các loại màu tự nhiên sử dụng an toàn cho thực phẩm và dược phẩm Màu annatto gồm hai thành phần chính đó là bixin và norbixin Bixin chiếm

khoảng 80 % tổng số chất màu, đồng phân cis–bixin có màu cam, không tan trong dầu thực vật còn trans–bixin cho màu đỏ, tan trong dầu thực vật Norbixin tan trong

nước cho màu vàng đến cam Vì vậy chế phẩm màu annatto cũng phân làm 3 loại chính theo tính tan là tan trong dầu, tan trong nước và dạng nhũ ứng dụng cho thực phẩm chứa cả pha dầu và pha nước Tuy nhiên, cũng giống như các màu tự nhiên khác, một khó khăn đối với việc sử dụng annatto đó là tính kém bền hơn so với phẩm màu tổng hợp hóa học Ngoài ra bixin và norbixin còn dễ bị kết tủa ở điều kiện pH thấp, do vậy việc sử dụng chúng trở nên hạn chế đối với một số thực phẩm

Từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước, kỹ thuật ứng dụng sóng vi sóng (microwave)

để hỗ trợ trong việc tách chiết các hợp chất từ thực vật bắt đầu được nghiên cứu, ứng dụng và đã mang lại hiệu quả đáng ghi nhận Vì vậy việc nghiên cứu quy trình mới ứng dụng lợi thế của vi sóng để hỗ trợ tách chiết chất màu annatto từ hạt điều màu là hướng nghiên cứu triển vọng

Ở Việt Nam, cây điều màu được trồng nhiều ở Nam Bộ, Tây Nguyên và một

số tỉnh miền Trung để thu hoạch hạt phục vụ cho nhu cầu trong nước Sản phẩm thương mại từ cây điều màu chủ yếu là hạt khô và phối chúng với các thành phần

khác thành bột dùng cho món cà ri Đến nay đã có một số tác giả nghiên cứu về các chất màu từ hạt điều màu nhưng vẫn chưa có một quy trình công nghệ sản xuất ổn định và hiệu quả để có thể triển khai ở quy mô công nghiệp

Nhằm góp phần xây dựng quy trình sản xuất phẩm màu annatto đơn giản, hiệu quả và tạo ra chế phẩm tiện dụng cho nhiều đối tượng thực phẩm, chúng tôi

chọn đề tài “Nghiên cứu trích ly màu hạt điều màu (Bixa orellana L.) tạo chế phẩm

siêu nhũ annatto” với các mục tiêu sau:

1 khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly màu annatto bằng dung môi có hỗ trợ bởi vi sóng,

2 thử nghiệm tạo chế phẩm nhũ annatto ổn định ở pH thấp

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

– Ý nghĩa khoa học: kết quả của đề tài sẽ cung cấp thông tin về:

+ tính chất hòa tan của các hợp chất màu có trong hạt điều màu,

+ cơ chế hình thành nhũ, và

+ cơ chế ổn định màu annatto

– Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài là cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ

chế biến hạt điều màu đạt hiệu quả cao Chế phẩm sản xuất ra có tính tiện dụng vì

có khả năng phân tán và hòa tan tốt trong nước và trong dầu, không bị kết tủa ở pH thấp giúp gia tăng giá trị cho một loại cây công nghiệp chưa được quan tâm nhiều ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về hạt điều màu

1.1.1 Cây điều màu

1.1.1.1 Tên gọi và vị trí phân loại

Tên thường gọi: cây điều màu, cây điều nhuộm, cây màu cà ri

Những tên gọi khác: annatto, anatto,arnatto,achiote, aploppas,lipstick tree, (tiếng Anh),atole, roucou, roucouyer, annato, orelana (tiếng Pháp), kam tai (tiếng Thái), kesumba (tiếng Indonesia),urucum, acafroa–do–brasil hoặc anato (tiếng Bồ Đào Nha), Jarak belanda (tiếng Malaysia), Anotto (tiếng Ý)

Tên khoa học: Bixa orellana L

Vị trí trong hệ thống phân loại (Chengaiah et al., 2010):

Giới (Regnum): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp (Class): Hai lá mầm (Eudicots)

Họ (Familia): Điều màu (Bixaceae)

Loài (Species): Bixa orellana Linn

1.1.1.2 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng

Điều màu có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới của châu Mỹ, được trồng nhiều

ở Bolivia, Brazil, Colombia, Ecuador, Jamaica, Mexico, Peru, Puerto Rico và Dominica Cây điều màu du nhập vào Ấn Độ và khu vực Đông Nam Á do người

Tây Ban Nha đưa tới vào thế kỷ 17 để làm chất nhuộm màu thực phẩm Sau đó được du nhập vào Hoa Kỳ, Ấn Độ và Châu Phi Một số nước Châu Âu như Anh, Đan Mạch, Thụy Điển, Na Uy cũng đã thuần hóa loài cây này nhưng chúng phát triển kém hơn so với vùng nhiệt đới Cây này cũng được trồng ở Hawaii và các đảo

ở khu vực Thái Bình Dương

Ở Việt Nam cây điều màu được nhập nội để trồng vào thời kỳ Pháp thuộc, hiện nay loài cây nàymọc hoang dại hoặc được trồng rải rác ở vùng đồng bằng Nam

Bộ, Tây Nguyên và miền Trung để thu hoạch hạt, làm cảnh hoặc làm thuốc (Võ Văn Chi, 1969) Loại cây này có thể trồng vào bất kỳ thời điểm nào trong năm, sau hai năm cho thu hoạch hạt nếu được chăm sóc đúng cách Cây điều màu ra hoa vào đầu mùa mưa (khoảng tháng 4, tháng 5), cho thu hoạch vào khoảng tháng 10 và tháng 11 Cây từ 4 năm tuổi có thể cho thu hoạch 270 kg hạt / ha

Các nước đóng góp sản lượng nhiều nhất là Brazil, Peru, Kenya, và Dominican; các nước sản xuất ít hơn là Jamaica, Ấn Độ, Sri Lanka, Philippine,Thổ Nhĩ Kỳ, Angola, Colombia, Ecuador và Bolivia (ITC, 1993) Hiện nay sản lượng hạt điều màu trên toàn thế giới hàng năm khoảng 14 500 tấn hạt khô (số liệu năm 2010)

1.1.1.3 Đặc điểm sinh học

Điều màu là cây nhiệt đới, xanh quanh năm, có thể sống tới 50 năm Thân dạng gỗ nhỏ, nhiều cành, cao khoảng 4 – 5 m, có cây cao đến 10 m Lá đơn mềm, nhẵn, hình ba cạnh, đầu nhọn, hình tim ở gốc, nhọn ở chóp, dài khoảng 12 cm, rộng

7 cm hoặc hơn; cuống phình ở đỉnh, dài 3 – 4 cm Hoa tương đối lớn, có màu tía hoặc trắng, mọc thành chùy ngắn ở đầu ngọn Quả nang hình tim, bao bọc bởi gai cứng, mọc thành chùm, màu đỏ tím, mở bằng hai van, mỗi mảnh nang chứa nhiều hạt, khi chín có màu đỏ tươi đến nâu Trong mỗi quả có khoảng 50 hạt, hạt có dạng gần lập phương tập trung trên một cuống ngắn, cuống hạt nở ra thành một cái áo hạt ngắn màu đỏ, xung quanh hạt có lớp màu đỏ Vỏ quả non màu xanh thẫm, mềm, hạt

ở trong có màu đỏ tươi, ướt, mềm và trơn Khi già vỏ quả có màu xanh hơi vàng, hạt phía trong cứng, khô, khó bóp, hạt khô và có màu đỏ thẫm Khi quả chín mà

không thu hoạch kịp thời thì quả bị khô và nứt ra làm khô các hạt ở trong và hạt tự rơi xuống đất, rất dễ phát tán để phát triển thành cá thể khác (Đỗ Tất Lợi, 1999)

Hình 1.1 Cây, hoa và trái điều màu (Bixa orellana L.)

Hình 1.2 Quả và hạt điều màu lúc mới thu hoạch 1.1.2 Thành phần hóa học của hạt điều màu

Kết quả phân tích cho thấy hạt annattochứa 40 % đến 45 % cellulose, 3,5 % đến 5,5 % sucrose, 0,3 % đến 0,9 % tinh dầu, 3 % dầu không bay hơi, và 13 % đến

16 % protein (The Raintree Group, 1997) Nhìn chung, hàm lượng sắc số annatto trong hạt điều màu khoảng 5 % đối với loài có quả hình bán cầu, 3 % – 3,58 % đối với quả hình nón, còn quả hình oval chỉ có 1,5 % – 2 % (ITC, 1993; Mantovani et

al., 2013) Sắc tố annatto gồm cis–bixin (ester monomethyl của acid dicarboxylic norbixin), một phần trans–bixin và cis–norbixin, chúng có bản chất là carotenoid;

trong đó bixin chiếm khoảng 70 – 82 % màu tổng số (McKeown và Mark, 1962; Aparnathi và Sharma, 1991) Ngoài bixin và norbixin, hạt điều màu còn chứa alpha–và beta–carotencùng một số thành phần khác như tannin, ethereal oil, saponin, hợp chất tương tự dầu mustard, mono– và sesquiterpene bixaghanene, bixein, bixol, crocetin, ellagic acid, ishwarane, isobixin, phenylalanine, salicylic acid, threonine, tomentosic acid và tryptophan (The Raintree Group, 1997)

Màu annatto chỉ nằm ở lớp áo hạt – aril of seed nên khi trích ly không cần thiết phải nghiền hạt (Smiths và Wallin, 2006; Amaral et al., 2009) Thực tế Nobre

et al (2006) và đã so sánh và thấy rằng hàm lượng annatto trích nguyên hạt và hạt nghiền nhỏ cho kết quả như nhau Lê Thị Hoa (2012) dùng dung môi KOH để so sánh hiệu suất trích ly màu của hạt điều màu nguyên hạt và bột hạt điều màu, kết quả cho thấy dạng nguyên hạt có hiệu suất trích ly màu cao hơn dạng bột

1.1.3 Màu annatto

1.1.3.1 Cấu tạo phân tử

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của norbixin (A) và bixin (B) (Magestea et al., 2012)

Màu annatto có bản chất là carotenoid, gồm 2 thành phần tạo màu chính là bixin và norbixin, công thức cấu tạo của bixin là C25H30O4 và norbixin là C24H28O4 Mạch carbon của bixin và norbixin có 9 nối đôi liên hợp xen kẽ đều đặn giữa các nối đơn Norbixin là một hợp chất dicarboxylic có hai gốc carboxyl tự do còn bixin

là methyl ester của acid norbixin, nên bixin chỉ còn có một nhóm carboxyl tự do

1.1.3.2 Tính chất lý hóa

Bixin có màu đỏ đến cam, phân tử phân cực yếu nên không tan trong nước,

có thể tan trong dầu, dung môi hữu cơ như chloroform, ethyl acetate, acetone, (Marco et al., 2013) Norbixin cho màu cam pha vàng, phân tử phân cực mạnh hơn, không tan trong nước pH thấp, tan tốt trong kiềm, tan không nhiều trong dung môi hữu cơ (Scotter, 2009)

Do có nhiều nối đôi trong mạch carbon nên cả bixin và norbixin đều dễ bị biến đổi khi tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng cường độ cao trong thời gian dài Norbixin bị kết tủa trong môi trường pH thấp (thường là dưới 5,5), khi norbixin kết tủa thường tạo phức bền với protein, tinh bột và một số thành phần khác và tạo ra sự đồng đều màu sắc trong sản phẩm, đồng thời ngăn cản được hiện tượng bị trôi màu Annatto rất bền trong môi trường kiềm (Lê Thị Anh Đào và ctv, 2000) Sự có mặt của nhiều nối đôi trong phân tử cũng khiến annatto dễ bị oxy hóa, đây là lý do annatto được coi là chất tạo màu, vừa là chất chống oxy hóa Nhiều tác giả như Kiokias và Gordon (2003), Cardarelli et al (2008), Vasu et al (2010), Santos et al (2011) và Garcia et al (2012) đã công bố nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của annatto

Trong nhóm carotenoid, annatto là nhóm màu gần như duy nhất vẫn giữ màu khi thay đổi các dạng cấu trúc hóa học Ở điều kiện nhiệt độ và pH nhất định, bixin

bị thủy phân thành norbixin hoặc xà phòng hóa thành muối K+ hoặc Na+ của norbixin (Hình 1.4) Ở nhiệt độ thấp hơn 50 0C, bixin và norbixin khá ổn định, nhưng từ 50 0C trở lên, cis–bixin dễ bị phân hủy thành một số sản phẩm, trong đó

có chất màu vàng C17 có tên là sắc tố McKeown và metaxilen (Preston và Rickard, 1980; Lê Thị Anh Đào và ctv, 2000) (Hình 1.5)

cis-bixin trans-bixin Hợp chất phân hủy

Muối Na +

hoặc K+

của cis-norbixin

cis-norbixin

Acid hóa (hoặc trung hòa)

Thủy phân (xà phòng hóa)

Hình 1.4 Chuyển đổi qua lại giữa các dạng annatto (Smiths và Wallin, 2006)

Hình 1.5 Phản ứng sinh sắc tố McKeown và metaxilen (Lê Thị Anh Đào và ctv,

Trên thị trường, chế phẩm annatto được cung cấp dưới nhiều dạng tùy theo mục đích sử dụng như: lỏng, bột, bột vi tinh thể, sệt, nhũ, huyền phù trong dầu (Bảng 1.1) Chế phẩm annatto dạng sệt (oleoresin) bảo quản được lâu hơn so với dạng bột (Balaswamy et al., 2006) Phẩm màu annatto chiếm tới 70 % tổng sản

lượng màu tự nhiên toàn cầu và riêng tại Brazil là 90 % (Veríssimo, 2003)

Bảng 1.1 Các loại chế phẩm annatto chủ yếu (Smith và Wallin, 2006)

rồi loại bỏ dung môi

20 % bixin Không có tài liệu mô tả

% bixin

Ngâm hạt với dung môi để hòa tan sắc tố Lọc dịch chiết để loại thành phần không tan Các công đoạn tiếp theo là loại chất béo và sáp, loại dung môi, kết tinh và sấy khô (Dung môi sử dụng đơn

lẻ hoặc kết hợp: hexane, acetone, ethanol, (alkaline) methanol, IPA, ethyl acetate)

Dư lượng dung môi: ≤ 50 ppm

Bột mịn với kích thước hạt nhỏ hơn 250 micron Annatto

C

Bixin tinh thể được

chiết, xà phòng hóa,

thủy phân, kết tủa

bằng acid, rửa rồi sấy

khô

Tối thiểu 70

% norbixin, mong muốn

≈ 80 %

Hạt được xử lý như quy trình sản xuất Annatto B Thêm kiềm loãng vào bột thu được, kế đến đun nóng để thủy phân sắc tố rồi làm nguội Lọc dịch rồi acid hóa để tủa norbixin Lọc tủa, rửa, sấy rồi nghiền, cuối cùng thu được bột norbixin

≈15%

Cọ xát hạt điều màu trong dầu thực vật nóng để tách sắc tố từ bề mặt của hạt Rây sơ bộ để loại bỏ hạt

Annatto

E

Tách bixin bằng dung

dịch kiềm nguội, sấy

khô rồi nghiền thành

dạng bột

Tối thiểu 25

% bixin, mong muốn

≈ 30 %

Cọ xát hạt điều màu trong dung dịch kiềm nguội (KOH hoặc NaOH) để tách sắc tố Acid hóa huyền phù thu được (H 2 SO 4 ) để tủa bixin Lọc, rửa, sấy khô rồi nghiền tủa thành dạng bột Annatto

F

Dùng kiềm để thu rồi

acid hóa để tủa

≈ 40 %

Cọ xát hạt điều màu trong dung dịch kiềm nguội (KOH hoặc NaOH) để tách sắc tố Thêm kiềm vào huyền phù thu được rồi đun nóng để hòa tan sắc

tố, sau đó làm nguội, loại chất béo và sáp Lọc dịch, acid hóa để kết tủa norbixin Lọc, rửa tủa, sấy khô rồi nghiền thành bột

Annatto

G

Thu norbixin bằng

kiềm loãng, sấy khô

(không qua công

đoạn acid hóa)

Tối thiểu 15

% norbixin, mong muốn

≈ 20 %

Cọ xát hạt điều màu trong dung dịch kiềm nguội (KOH hoặc NaOH) để tách sắc tố Thêm kiềm vào huyền phù thu được, sau đó đun nóng để hòa tan sắc tố rồi làm nguội, loại chất béo và sáp Lọc dịch, sau đó sấy phun hoặc sấy khay Có thể thêm

K 2 CO 3

1.1.3.4 Ứng dụng của phẩm màu annatto trong ngành thực phẩm

Hình 1.7 Màu annatto trong đồ uống có pH thấp (American Color Research

Center, Inc., 2009)

Ở Bắc Mỹ và châu Âu, người ta dùng màu annatto để nhuộm màu bơ, phomat (màu cam của phomat cứng, màu đỏ của phomat Edam Hà Lan,…) Chúng được dùng để tạomàu cho nước xốt, thịt lợn quay ở Trung Quốc Còn ở Việt Nam, màu này được dùng trong món cà ri, bột bánh, gà quay mật ong và các loại mì, bún nước, Ở Mexico, annatto được trộn với một số gia vị khác tạo thành một loại gia

vị màu đỏ gạch gọi là achiote paste và adobo, rất được người dân Mexico ưa chuộng Họ thường dùng achiote chung với giấm để ướp thịt hoặc phối chế nước xốt Do có nguồn gốc thực vật nên annatto thích hợp để chế biến các món ăn chay

Phẩm màu annatto được ký hiệu quốc tế là E160b và được dùng để tạo màu thức ăn và đồ uống thành màu đỏ hoặc vàng tới vàng cam đậm (Hình 1.7) Các nhóm sản phẩm thực phẩm công nghiệp thường sử dụng annatto làmargarine, snack, dầu salad, đồ uống, kẹo thạch, kẹo cứng và ngũ cốc nảy mầm Tùy thuộc vào phương pháp sản xuất, E160b chia làm hai loại dựa trên tính tan: loại tan trong dầu

và loại hòa tan trong nước Chế phẩm annatto tan trong dầu thường được dùng để tạo màu cho thực phẩm nhiều dầu như phô mai, margarine/shortening và bánh ngọt, bánh quy, bỏng ngô và snack, nước xốt, và đồ tráng miệng dạng kem Annatto dạng nhũ có ưu điểm hơn khi sử dụngcho phô mai, kem, món soup, kẹo và sản phẩm từ

sữa Màu annatto tan trong pH acid có thể dùng cho nước ép, rượi mùi, thạch trong suốt và món tráng miệng dạng sệt Trước kia chế phẩm annatto tan trong nước chỉ được ứng dụng sản xuất phô mai nhưng nay đã mở rộng ra nhiều sản phẩm khác

Do annatto tan trong nước dạng truyền thống không chịu được pH acid, nên không thể dùng cho thực phẩm dạng lỏng trong suốt có tính acid như đồ uống không có thịt quả, nhưng lại rất thích hợp cho thực phẩm dạng rắn và bán rắn (matrix): vỏ xúc xích, xúc xích, pudding, tương cà, tương ớt, ngũ cốc ăn sáng, món tráng miệng bơ sữa, độn chocolate, cá xông khói và thức ăn cho vật nuôi Bột annatto tan trong nước còn được mở rộng ứng dụng đối với thực phẩm dạng bột như món tráng miệng ăn liền, bột thực phẩm chức năng hay viên sủi Những thực phẩm sau khi hoàn nguyên có màu vàng hoặc vàng cam (Smiths và Wallin, 2006)

Hầu hết các nhà sản xuất đều lưu ý rằng khi sửdụng annatto cần phải quan tâm đến độ bền của nó Annatto thích hợp để chế biến thực phẩm có sử dụng nhiệt nhưng ở nhiệt độ quá cao trong thời gian dài sẽ làm phân hủy chất màu do đó nên

bổ sung annatto vào cuối quy trình sản xuất Khả năng hòa tan và độ pH cũng ảnh hưởng đến sắc màu của annatto Trong thực phẩm nhiều dầu như đồ ăn nhẹ hoặc phomat, annatto cho màu vàng hơn so với thực phẩm nhiều nước Nếu annatto kết tủa trong thực phẩm, độ hòa tan giảm hoặc pH giảm thì màu sắc sẽ đỏ hơn

Ngoài lĩnh vực thực phẩm, annatto còn được sử dụng làm chất nhuộm dược phẩm, nhuộm quần áo, làm thuốc chữa bệnh và công nghiệp sơn,

1.1.3.5 Độc tính và liều lượng khuyên dùng

Theo cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration – FDA), hồ sơ độc tính của hạt annatto và dịch chiết đã được khảo sát đầy đủ để sử dụng làm phụ gia thực phẩm Annatto được ghi rõ trong hệ thống Food Chemical Codex (No 73.30, 73.1030 & 73.2030) và được xác định làan toàn (Generally Recognized as Safe – GRAS) đối với người khi sử dụng qua nguồn thực phẩm có chứa annatto Chế phẩm màu annatto được Cộng đồng Châu Âu cũng như

hệ thống INS (International Numbering System for Food Additives) đánh số trong

hệ thống E number là E160b (Scotter, 2009)

Theo khuyến cáo của JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) năm 2006, lượng annatto sử dụng hàng ngày (Acceptable Daily Intake) như sau: 0 – 12 mg/kg thể trọng đối với bixin; 0 – 0,6 mg/kg thể trọng đối với norbixin và muối K+ hoặc Na+ của nó

Theo Lê Thị Anh Đào và ctv (2002), lượng sử dụng màu annatto trong thực phẩm chỉ khoảng 1 – 10 ppm; còn theo tác giả Emerton và Choi (2008), hàm lượng

10 – 50 ppm là phổ biến đối với bơ, phô mai, cá xông khói, snack và đồ tráng miệng Cơ quan quản lý tiêu chuẩn và an toàn thực phẩm Ấn Độ cho phép giới hạn hàm lượng annatto tối đa trong sản phẩm thực phẩm là 200 ppm (Balaswamy et al., 2012)

1.1.3.6 Tiêu chuẩn quy định về chế phẩm phụ gia annatto

Ngày 20 tháng 5 năm 2010, Bộ Y tế ra thông tư số 27/2010/TT–BYT về việc ban hành QCVN 4–10: 2010/BYTcó tên đầy đủ là Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – phẩm màu Trong quy chuẩn này, Phụ lục 24 trình bày cụ thể

về Quy định kỹ thuật và phương pháp thử đối với cao annatto Quy chuẩn quy định

về hàm lượng màu tổng số tối thiểu trong chế phẩm là 35% khối lượng Về độ tinh khiết, quy chuẩn ghi rõ hàm lượng kim loại nặng cho phép như trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Yêu cầu về độ tinh khiết đối với chế phẩm phụ gia annatto

Tên kim loại Giới hạn tối đa

1.2 Vi sóng và thiết bị liên quan

1.2.1 Bản chất của vi sóng

Vi sóng (microwave) là một dạng bức xạ điện từ, đó là sóng của năng lượng điện và năng lượng từchuyển động cùng nhau qua không gian Bức xạ điện từ bao quát từ tia gamma, tia X năng lượng cao cho đếnsóng radio năng lượng thấp dùng trong công nghệ phát thanh truyền hình Vi sóng có tần số trong khoảng từ 300 MHz đến 300 GHz, nằm giữa tia X và tia hồng ngoại Khi chiếu vi sóng lên đối tượng mô động – thực vật, một phần năng lượng điện từ được chuyển hóa thành nhiệt năng Không giống như phương pháp truyền nhiệt truyền thống vốn dựa trên hiện tượng dẫn truyền và đối lưu gây thất thoát nhiều nhiệt năng ra môi trường xung quanh Vi sóng truyền nhiệt có chọn lọc và đúng mục tiêu cần làm nóng nên năng lượng thất thoát thực tế bằng 0 đối với hệ thống kín Nguyên lý làm nóng vật liệu bằng vi sóng dựa trên tác động trực tiếp của sóng lên vật liệu phân cực hoặc dung môi, cụ thể là hai hiện tượng: dẫn truyền ion và quay phân tử phân cực Tần số sử dụng trong các thiết bị vi sóng dân dụng và thí nghiệm thường là 2450 MHz, còn thiết bị công nghiệp là 915 MHz Bởi vì chỉ ở những tần số này hiệu ứng sinh nhiệt trong vật liệu mới xảy ra Do đó chỉ có vật liệu có tính điện môi hoặc dung môi

phân cực ổn định mới bị gia nhiệt dưới tác động của vi sóng (Mandal et al., 2007)

Hình 1.8 Phân tử phân cực sắp xếp lại vị trí trong trường điện từ (Al–Harahsheh,

2004)

Vi sóng có ba đặc tính khiến chúng có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm: phản xạ bởi kim loại; xuyên qua thủy tinh, giấy, nhựa và vật liệu tương tự; và bị hấp thu bởi thực phẩm (mô động – thực vật) (FDA, 2011)

1.2.2 Cơ chế hỗ trợ trích ly của vi sóng

Theo Mandal et al (2007) cho dù đa số vật liệu thực vật dùng để trích ly đều

ở dạng khô nhưng vẫn còn lượng nước nhỏ trong tế bào, đó là đối tượng hướng tới khi vi sóng tác dụng vào Khi lượng nước ít ỏi đó nóng lên do vi sóng, chúng sẽ bay hơi và sinh ra áp suất lớn lên vách tế bào, khiến tế bào bị phồng lên, cuối cùng sẽ vỡ

ra giúp giải phóng các thành phần bên trong tế bào ra dung môi xung quanh Hiện tượng này còn có thể được tăng cường nhờ sử dụng dung môi có hiệu suất hấp thu nhiệt cao (giá trị tan δ lớn) Nhiệt do vi sóng tác động còn có thể thủy phân cellulose là thành phần chính cấu tạo nên vách tế bào, biến cellulose thành những tiểu phần nhỏ có thể hòa tan chỉ trong vòng 1 – 2 phút Nhiệt do vi sóng gây nên còn giúp loại nước liên kết với cellulose, giảm sức bền cơ học của chúng, tạo điều kiện cho dung môi xâm nhập dễ dàng hơn vào trong tế bào Ảnh hưởng của vi sóng phụ thuộc nhiều vào độ nhạy điện môi của cả dung môi và thành phần vật liệu cần trích ly Dung môi sử dụng có thể riêng lẻ hoặc phối hợp nhiều dung môi khác nhau theo tỷ lệ nào đó Đối với những thành phần nhạy cảm với nhiệt độ, phương án hợp

lý là sử dụng dung môi không hấp thu vi sóng (hexane, chloroform), khi đó một số thành phần trong vật liệu sẽ nóng lên rồi giải phóng hợp chất mong muốn vào dung

môi mà không bị tổn hao do nhiệt quá cao

Hình 1.9 Cơ chế vi sóng tác động lên mô động – thực vật (Huma, 2010)

Năm 2005, Rao et al đã khảo sát ảnh hưởng của vi sóng đối với sự ổn định của bixin, kết quả cho thấy vi sóng gần như không ảnh hưởng đến hàm lượng bixin trong mẫu chế phẩm cũng như mẫu thực phẩm chứa bixin Vasu et al (2010) cũng

sử dụng vi sóng để hỗ trợ trích ly bixin bằng hỗn hợp dung môi ethyl acetate + nước (7,5/1) Tác giả kết luận vi sóng không ảnh hưởng đến bản chất hóa học và hoạt tính sinh học của bixin trích ly được

1.2.3 Thiết bị vi sóng

Hình 1.10 Cấu tạo lò vi sóng dân dụng

Hình 1.11 Thiết bị MASE dạng mẻ và liên tục quy mô công nghiệp (Huma, 2010)

Thiết bị vi sóng dân dụng, chuyên dùng nghiên cứu cũng như quy mô công nghiệp nhìn chung gồm 4 thành phần cơ bản (Hình 1.10):

(a) Magnetron: bộ phận phát vi sóng (microwave generator),

(b) Lối dẫn sóng (wave guide): có nhiệm vụ truyền dẫn vi sóng từ nguồn phát magnetron tới khoang làm việc (khoang nấu),

(c) Khoang làm việc (the applicator): là nơi đặt mẫu,

(d) Cánh khuấy (circulator): hướng và phân tán sóng chỉ tiến về phía trước,

không quay ngược trở lại nguồn phát

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu dùng trong trích ly các hợp chất tự nhiên 1.3.1 Phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ

Do đặc điểm cấu trúc của màu annatto là có tính phân cực trung bình nên các loại dung môi phù hợp cho trích ly màu annatto cũng có độ phân cực trung bình Trích ly hạt điều màu bằng dung môi hữu cơ rồi sau đó loại dung môi sẽ thu được tinh thể bixin, sau đó có thể chế biến tiếp để thu được chế phẩm theo mục đích sử dụng Đã có nhiều đăng ký bản quyền và công trình nghiên cứu liên quan đến các loại dung môi hữu cơ thích hợp đối với annatto như hydrocarbon chlorine hóa, hỗn hợp ethanol và chloroform, acetone, ethanol, ethyl acetate, hexane, methanol và alcoholic sodium hydroxide Chloroform hiện được biết là dung môi hiệu quả nhất

để trích ly annatto (Smiths và Wallin, 2006; Leonardo, 2007)

1.3.2 Phương pháp trích ly bằng dung môi có sự hỗ trợ của vi sóng (MASE)

Phương pháp trích ly bằng dung môi có hỗ trợ của vi sóng (microwave–assisted solvent extraction – MASE) được mô tả lần đầu giữa những năm 1980 Phương pháp này có ưu điểm là dễ tự động hóa, tiết kiệm thời gian trích ly, giảm lượng dung môi hữu cơ cần sử dụng do đó góp phần bảo vệ môi trường và giảm chi phí chuẩn bị mẫu MASE vượt trội so với phương pháp trích ly siêu tới hạn do dễ vận hành và ít chi phí Lợi thế hơn so với phương pháp trích ly hỗ trợ bởi siêu âm

và Soxhlet là tiết kiệm thời gian MASE thường dùng để trích mùi thơm, chất chống

oxy hóa, chất màu, phenol sinh học cùng một số hợp chất sơ cấp và thứ cấp khác từ nguyên liệu thực vật (Afoakwah et al., 2012)

Bảng 1.3 Vài dung môi sử dụng cùng phương pháp MASE (Mandal et al., 2007)

Dung môi Hằng số điện môi Tổn thất điện môi

Quy trình thực hiện khá đơn giản, trước tiên nguyên liệu được ngâm trong dung môi thích hợp, sau đó xử lý trực tiếp vi sóng lên hỗn hợp nguyên liệu + dung môi với công suất và thời gian phù hợp Năng lượng vi sóng sẽ phá vỡ tế bào thực vật giúp giải phóng hợp chất mong muốn nhanh hơn các phương pháp trích ly truyền thống như phương pháp Soxhlet (Ganzler et al., 1986)

Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn về hỗ trợ vi sóng

để trích ly, đặc biệt là lĩnh vực sản xuất dược phẩm và thực phẩm (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Nghiên cứu sử dụng lò vi sóng dân dụng (Mandal et al., 2007)

HCl 0,1 M pha trong nước

Rễ khô cây

Salvia miltiorrhiza

diterpenes như tanshinone

Vỏ khô cây

Eucommia ulmodies

acid geniposidic và acid chlorogenic

hỗn hợp methanol+nước

Trung Quốc

Quả khô cây

Embelia ribes

Curcuma rhizomes curcumol, curdione

Artemisia annua L artemisnin dầu trích ly #6 12 phút Trung Quốc

1.3.3 Phương quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis

Bixin và đồng phân iso của nó có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng khoảng

500 nm và 470 nm trong chloroform, trong khi đó sắc tố thoái hóa màu vàng lại hấp thụ cực đại tại 404 nm, 428 nm trong chloroform, và không hấp thụ ở bước sóng

500 nm (McKeown và Mark, 1962) Phương pháp phân tích dựa trên độ hấp thụ tại

500 nm và 404 nm thu được hai kết quả là hàm lượng màu annatto tổng số và hàm

lượng bixin (McKeown và Mark, 1962; Parimalan et al., 2011)

Hình 1.12 Phổ hấp thụ của bixin và norbixin trong chloroform (Silva, 2007)

Phương pháp quang phổ đủ để xác định hàm lượng annatto tổng số và có độ tương đồng cao với các phương pháp khác như HPLC Hơn nữa các chất màu khác

và các chất nhũ hóa không ảnh hưởng đến kết quả phép đo quang (Scotter et al., 1998; Bareth et al., 2002; Silva, 2007) Một chú ý quan trọng và thú vị liên quan đến phép đo độ hấp thụ của bixin trong dung môi chloroform đó là bixin thoái hóa nhanh chóng khi đựng trong cuvet thạch anh (Levy và Rivadeneira, 2000) Hơn nữa bước sóng cần đo đối với annatto lớn hơn 300 nm cho nên trong quá trình thí nghiệm chúng tôi chỉ sử dụng cuvet thủy tinh (Hellma 6030 OG)

Phương pháp định lượng tổng số annatto của McKeown và Mark (1962) đến nay đã được nhiều tác giả sử dụng trong công trình của mình như Scotter et al (1998), Parimalan et al (2011) và Mahendranath et al (2011)

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Nghiên cứu trong nước

Tác giả nghiên cứu về hạt điều màu nhiều nhất là Đào Hùng Cường và cộng

sự Năm 2008, tác giả chủ trì đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần và phản

ứng chuyển hóa hợp chất hóa học của hạt điều nhuộm miền Trung, Tây Nguyên” Kết quả mà nhóm tác giả đạt được như sau:

– Thời điểm thu hoạch hạt điều để tách chất màu norbixin trong hạt lớn nhất 2,4 % là vào đầu tháng thứ 3 kể từ khi cây ra quả (tháng 11 hàng năm) Tỷ lệ hạt điều màu / nước trích ly tốt nhất là 5/80; thời gian ngâm cho hiệu quả tối ưu là 24 giờ ở 100 0C

– Thời điểm thu hoạch hạt điều để tách chất bixin trong hạt lớn nhất là vào đầu tháng thứ 6 kể từ khi cây ra quả (tháng 2 hàng năm) Chiết tách bixin tốt nhất 19,8 % từ hạt điều nhuộm bằng ethyl acetate ở nhiệt độ 80 0C; tỷ lệ hạt điều / dung môi là 1/18 và trong thời gian 10 giờ

Các công bố của nhóm tác giả có một số đặc điểm chung như sau:

– Hiệu suất trích ly dựa trên tổng khối lượng chất khô trích ly được chứ không phải hàm lượng màu nguyên chất

– Dùng độ hấp thụ cực đại để so sánh hiệu suất trích ly trực tiếp, không tính

ra hiệu suất cuối cùng

– Sử dụng nồng độ dung môi kiềm cao (1 M)

– Phương pháp trích ly kinh điển (Soxhlet, chưng ninh, ngâm chiết, ) tốn nhiều thời gian và năng lượng

– Thường không xử lý số liệu

Tác giả Lê Thị Anh Đào và ctv (2000) đã đạt được kết quả về thông số trích

ly bằng dung môi ethanol (dung môi cồn thực phẩm 960, nhiệt độ trích 30 0C, tỷ lệ dung môi / hạt là 5/1 (v/w), chia làm 4 lần trích, mỗi lần 30 phút) Còn đối với dung môi kiềm, nồng độ tối ưu là KOH 0,1 M với tỷ lệ dung môi / hạt là 12/1 (v/w)

Ngoài ra năm 2005, Lưu Đàm Cư cùng cộng sự có đề cập đến hạt điều màu trong đề tài “Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số” Tuy nhiên do phạm vi đề tài quá rộng

và mang tính điều tra là chính nên chưa có nhiều kết quả sâu về annatto

Tác giả Ngô Thị Thuận và cộng sự (1995) hoàn thành đề tài cấp nhà nước

“Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết, tổng hợp các chất màu thực phẩm”

Nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu chất màu trên nhiều đối tượng thực vật trong đó

có hạt điều màu

1.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Có rất nhiều công trình ngoài nước về phẩm màu annatto, đặc biệt là nở những nước trồng và sử dụng nhiều annatto như Brazil, Ấn Độ, Mỹ, Nhật Bản,

Có thể tạm chia làm các hướng nghiên cứu như sau: trích ly, nghiên cứu tính chất của bixin và norbixin, biến đổi hoặc vi gói annatto, ứng dụng trong thực phẩm, phương pháp phân tích hàm lượng, Riêng hướng nghiên cứu trích ly hỗ trợ bởi vi sóng cũng đạt được nhiều thành tựu đáng kể

Vasu et al (2010) dùng vi sóng hỗ trợ trích ly bixin với dung môi sử dụng là ethyl acetate / nước (7,5/1) Nhóm tác giả chứng minh hiệu quả vượt trội của phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ có hỗ trợ bởi vi sóng (210 W) khi đạt được hiệu suất gấp đôi phương pháp gia nhiệt truyền thống mà thời gian giảm 5 lần Tác giả sử dụng phương pháp quang phổ, sắc ký lớp mỏng và thử hoạt tính chống oxy hóa bằng 5 phương pháp khac nhau (DPPH, ABTS, nitric oxide, ức chế oxy hóa lipid và phương pháp alkaline DMSO) Sau khi so sánh hai mẫu bixin trích được bằng hai phương pháp, kết quả cho thấy chúng không có sự khác biệt về hoạt tính chống oxy hóa Có thể kết luận phương pháp trích ly bằng dung môi hữu cơ có

hỗ trợ vi sóng phù hợp để trích ly bixin hiệu quả hơn phương pháp truyền thống mà không làm thay đổi hoạt tính sinh học vốn có của bixin

Sinha et al (2013) nghiên cứu trích ly màu annatto bằng dung môi nước với

sự hỗ trợ của lò vi sóng dân dụng (Samsung, Model PG–3200, Hàn Quốc) Phương pháp thống kê nhóm tác giả sử dụng là bề mặt đáp ứng (Respose Surface Methodology – RSM) và mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network – ANN) Mục đích chính của tác giả là so sánh hiệu quả của hai phương pháp thống

kê chứ không phải hiệu suất trích bởi lẽ dung môi nước tuy cần ít chi phí nhưng cũng kém hiệu quả đối với đối tượng trích ly là annatto Kết luận của công trình này

là phương pháp ANN hiệu quả hơn RSM về hiệu năng dự đoán trong trường hợp trích ly chất màu từ hạt annatto bằng dung môi nước có hỗ trợ vi sóng

Riêng hướng nghiên cứu tạo siêu nhũ annatto chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu liên quan mà chủ yếu là các nghiên cứu về tạo siêu nhũ các hợp chất cùng nhóm carotenoid là beta–carotene và astaxanthin (Tan và Nakajima, 2005; Affandi et al., 2011; Silva et al., 2011; Hou et al., 2012; Anarjana và Tan, 2013a; Anarjana và Tan, 2013b; Yuana et al., 2013 và Xua et al., 2013)

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

1 Khảo sát loại dung môi và nồng độ thích hợp để trích ly màu annatto

2 Khảo sát chế độ hỗ trợ vi sóng và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu

3 Khảo sát thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng

4 Khảo sát tỷ lệ acid acetic đậm đặc / dịch trích ly để thu hồi bột annatto từ dịch trích ly

5 Thử nghiệm định tính khả năng tạo chế phẩm nhũ annatto ổn định trong dung môi nước có pH thấp

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 2/2014 tại Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm – ĐH Công nghiệp TP Hồ Chí Minh

2.3 Vật liệu, hoá chất và trang thiết bị

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Quả điều màu loại hình tim đến kỳ thu hoạch (Bùi Thị Mỹ Lệ, 2012) được thu mua tại các nông hộ huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai Sau khi tách vỏ, loại tạp chất

và hạt non cũng như hạt lép, mẫu được sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 40 0C đến khi

độ ẩm đạt khoảng 10 % (Mantovani et al., 2013) Hạt khô thu được đem trộn thật đều để đồng nhất rồi chia ra thành nhiều phần, mỗi phần gồm 200 g sau đó lưu trữ ở

4 0C trong các túi PE hàn kín miệng, trong điều kiện không ánh sáng

Lượng mẫu thu thập một lần là 20 kg hạt khô, đủ dùng cho toàn bộ quá trình thí nghiệm

Hình 2.1 Hạt điều màu khô đóng gói trong bao PE kín miệng

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

– Máy quang phổ Thermo Scientific UV – Vis Genesis 20; USA

– Cuvet thủy tinh Hellma 6030 OG; Germany

– Máy cô quay chân không Büchi Rotavapor R 210; Sweden

– Máy khuấy từ gia nhiệt Barnstead / Thermolyne SP131320–33; USA

– Cân điện tử Sartorius TE612; Germany

– Tủ sấy Memmert 100 – 800; Germany

– Máy sấy ẩm hồng ngoại Sartorius MA 150; Germany

– Máy khuấy IKA T–25 ULTRA–TURRAX Digital Homogenizer; Germany – Lò vi sóng Sharp R–G278VN–S; Japan

– Micropipet eppendorf 10 – 100 μL và 100 – 1000 μL; Germany

2.3.3 Hóa chất

– Acetic glacial 99,5 %, Xiu Long; China

– Acetone 99,7 %, Chemsol; Việt Nam

– Ammonia 25 ~ 28 %, Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– Chloroform 99 %, Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– Ethanol 960; Việt Nam

– Ethyl acetate 99,5 %, Xiu Long; China

– HCl 36 ~ 38 %; Xilong Chemical; China

– H2SO4 96 ~ 98 %; Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– Lecithin, HLB 3,8, Xiu Long; China

– Polysorbate 80 (Tween 80), HLB 15, Xiu Long; China

– Polyethylene glycol 400 monostearate, HLB 11,6, Xiu Long; China

– Sodium stearoyl lactate (SSL) 99 %, HLB 19; China

2.4 Bố trí và phương pháp tiến hành thí nghiệm

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

2.4.1.1 Phân tích tính chất nguyên liệu hạt điều màu

Mục đích: Xác định tính chất vật liệu ban đầu, kiểm tra độ đồng nhất của mẫu nghiên cứu nhằm chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào cho việc xây dựng quy trình chiết xuất annatto Các tính chất khảo sát gồm có: độ ẩm, hàm lượng tro và hàm lượng màu annatto tổng số

a Xác định độ ẩm của hạt nguyên liệu

+ nghiền mịn hạt, rây lọt hoàn toàn qua rây 1400

b Xác định hàm lượng tro tổng số của hạt điều màu

Mục đích: xác định hàm lượng tro tổng số của hạt

Thông số thí nghiệm: khối lượng hạt (2g)

Phương pháp tiến hành theo Mục 2.4.2.1

c Xác định hàm lượng màu annatto tổng số

Mục đích: làm cơ sở đánh giá chất lượng hạt nguyên liệu và tính hiệu suất thu hồi

Phương pháp thực hiện theo Mục 2.4.2.1

Kết quả hàm lượng màu annatto tổng số được dùng làm cơ sở cho việc đánh

giá hiệu suất trích ly

2.4.1.2 Thí nghiệm 1: Lựa chọn dung môi phù hợp cho quá trình trích ly có hỗ trợ bởi vi sóng

Mục đích: Tìm dung môi phù hợp nhất cho quá trình trích ly có sự hỗ trợ vi song nhằm đạt hiệu suất cao

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g),

+ thời gian và tốc độ khuấy trước khi xử lý vi sóng (100 v/p trong 15 phút), + công suất vi sóng (240 W),

+ tổng thời gian hỗ trợ vi sóng (60 s), và

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (10/1) (Mahendranath et al., 2011)

Yếu tố khảo sát: Các loại dung môi với độ phân cực khác nhau, có hoặc không có mặt của ammonia (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các loại dung môi khảo sát

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Loại dung môi cho hiệu suất trích ly annatto cao nhất sẽ được chọn để làm các thí nghiệm tiếp theo

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình trích ly để chọn dung môi

2.4.1.3 Thí nghiệm 2: Tối ưu nồng độ dung môi trích ly màu annatto

Mục đích: Xác định nồng độ dung môi tối ưu trong hệ để đạt được hiệu suất trích ly annatto cao nhất

a Thí nghiệm 2a: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hiệu suất trích ly màu annatto

Mục đích: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ đến hiệu suất trích ly màu annatto

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố khảo sát: nồng độ dung môi khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Khoảng nồng độ dung môi cho hiệu suất cao sẽ được chọn để thiết kế thí

nghiệm tối ưu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

b Thí nghiệm 2b: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ ammonia đến hiệu suất trích ly màu annatto

Mục đích: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ ammonia đến hiệu suất trích ly màu annatto

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

+ nồng độ dung môi (theo kết quả Thí nghiệm 1a)

Yếu tố khảo sát: nồng độ ammonia khác nhau từ 0,1; 0,3; 0,5; 0,6; 0,7 và 0,8

M

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Khoảng nồng độ ammonia cho hiệu suất cao sẽ được chọn để thiết kế thí nghiệm tối ưu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

c Thí nghiệm 2c: Tối ưu nồng độ dung môi và nồng độ chất hỗ trợ ammonia bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

Phương pháp: bề mặt đáp ứng 2 yếu tố kiểu thiết kế có tâm, mỗi nghiệm thức thực hiện 1 lần

Nội dung: thí nghiệm hai yếu tố được bố trí và xử lý theo phần mềm JMP 9.0.2, thí nghiệm được bố trí theo hướng xây dựng bề mặt đáp ứng (Response Surface Design) trong đó mối quan hệ giữa các yếu tố khảo sát (factor) và các chỉ tiêu theo dõi (response) được thể hiện dưới dạng mặt cong (bề mặt đáp ứng – response surface) Nhằm có thể xác định được quan hệ giữa các yếu tố khảo sát với chỉ tiêu theo dõi, từ đó xác định giá trị của yếu tố khảo sát mà tại đó chỉ tiêu theo dõi đạt giá trị tốt nhất (tối thiểu hoặc tối đa)

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

2.4.1.4 Thí nghiệm 3: Tối ưu chế độ hỗ trợ vi sóng và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu

Mục đích: Chọn chế độ hỗ trợ vi sóng và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu phù hợp

a Thí nghiệm 3a: Thăm dò ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến hiệu suất trích ly

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g),

+ nồng độ dung môi (theo kết quả Thí nghiệm 2c),

+ công suất hỗ trợ vi sóng (240 W), và

+ thời gian hỗ trợ vi sóng (60 s)

Yếu tố khảo sát: Tỷ lệ dung môi / hạt là 4/1, 6/1, 8/1, 10/1, và 12/1

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Khoảng giá trị tỷ lệ dung môi / nguyên liệu cho hiệu suất cao sẽ được chọn

để tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa

b Thí nghiệm 3b: Thăm dò ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của công suất vi sóng đến hiệu suất trích ly Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g),

+ nồng độ dung môi và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (kết quả Thí nghiệm 2c

c Thí nghiệm 3c: Thăm dò ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của thời gian hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích

ly màu annatto

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g),

+ nồng độ dung môi và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (kết quả Thí nghiệm 2c

và 3a), và

+ công suất hỗ trợ vi sóng (kết quả Thí nghiệm 3b)

Yếu tố khảo sát: Thời gian hỗ trợ vi sóng 15, 30, 45, 60, 90, 120 và 150 s (Zhang et al., 2013)

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Khoảng thời gian hỗ trợ vi sóng cho hiệu suất cao sẽ được chọn để thiết kế

thí nghiệm tối ưubằng phương pháp bề mặt đáp ứng

d Thí nghiệm 3d: Tối ưu chế độ hỗ trợ vi sóng và tỷ lệ dung môi / nguyên liệu bằng phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu Box-Behnken

Phương pháp: bề mặt đáp ứng 3 yếu tố kiểuBox-Behnken, mỗi nghiệm thức thực hiện 1 lần

Nội dung: thí nghiệm 3 yếu tố được bố trí và xử lý theo phần mềm JMP 9.0.2, thí nghiệm được bố trí theo hướng xây dựng bề mặt đáp ứng (Response Surface Design) kiểu Box-Behnken trong đó mối quan hệ giữa các yếu tố khảo sát (factor) và các chỉ tiêu theo dõi (response) được thể hiện dưới dạng mặt cong (bề mặt đáp ứng – response surface) Nhằm có thể xác định được quan hệ giữa các yếu

tố khảo sát với chỉ tiêu theo dõi, từ đó xác định giá trị của yếu tố khảo sát mà tại đó chỉ tiêu theo dõi đạt giá trị tốt nhất (tối thiểu hoặc tối đa)

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g), và

+ nồng độ dung môi (theo kết quả Thí nghiệm 2c)

Yếu tố khảo sát: 3 yếu tố gồm tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, công suất (W) và thời gian hỗ trợ vi sóng (s) với mức khảo sát theo kết quả Thí nghiệm 3a, 3b và 3c

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

2.4.1.5 Thí nhiệm 4: Khảo sát thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng

Mục đích: Xác định thời gian thích hợp của công đoạn trích ly phụ sau khi

hỗ trợ vi sóng

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt annatto (5 g),

+ nồng độ dung môi (kết quả Thí nghiệm 2c), và

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, công suất và thời gian hỗ trợ vi sóng (theo kết quả Thí nghiệm 3d)

Yếu tố khảo sát: Thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng 15; 22,5; 30; 37,5; 45, và 60 phút

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly annatto (%)

Thời gian trích ly phụ sau khi hỗ trợ vi sóng cho hiệu suất cao sẽ được chọn

để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

2.4.1.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát thể tích acid acetic đậm đặc để kết tủa annatto

+ nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và chế độ hỗ trợ vi sóng tối

ưu để thu được dịch trích (kết quả thí nghiệm 2c và 3d), và

+ thể tích dịch trích dùng cho một đơn vị thí nghiệm (10 mL)

Yếu tố khảo sát: thể tích acid acetic 99,5 % là 0,5; 1; 1,3; 1,5; 1,7; 2; và 2,5

mL

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi annatto tự do (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.3 Acid đặc được nhiễu từ từ theo thành ống ly tâm (Haque, 2011)

Tỷ lệ thể tích acid acetic đậm đặc cho hiệu suất thu hồi annatto tự do cao nhất sẽ được chọn làm công thức kết tủa annatto

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thí nghiệm kết tủa annatto bằng acid acetic

2.4.1.7 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm sơ bộ khả năng tạo chế phẩm nhũ annatto

ổn định trong dung môi nước pH thấp

a Thí nghiệm 6a: Chọn chất nhũ hóa thích hợp để tạo nhũ annatto

Mục đích: chọn chất nhũ hóa thích hợp để tạo nhũ annatto

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng bột annatto (1 g),

+ khối lượng hỗn hợp propylene glycol kiềm (5 g), và

+ khối lượng chất nhũ hóa mỗi loại (1 g)

Yếu tố khảo sát: các loại chất nhũ hóa có giá trị HLB khác nhau gồm:

+ lecithin (LC),

+ polyethylene glycol 400 monostearate (PEG 400 MS),

+ tween 80 (TW80), và

+ sodium stearoyl lactate (SSL)

Chỉ tiêu theo dõi: cường độ màu sau thời gian bảo quản trong ống nghiệm thủy tinh kín, trong tối ở nhiệt độ 55 0C (Mao et al., 2009)

Chất nhũ hóa thích hợp sẽ được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Cách tiến hành: Trước tiên hòa tan bột annatto bằng hỗn hợp propylene glycol kiềm pH 10 (Kocher, 1958; Satyanarayana et al., 2010) bằng máy khuấy từ ở tốc độ 100 v/p trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó bổ sung chất nhũ hóa, tiếp

tục khuấy trộn thêm 5 phút nữa rồi pha loãng vào nước cất để theo dõi

b Thí nghiệm 6b: Lựa chọn tỷ lệ chất nhũ hóa

Mục đích: chọn tỷ lệ chất nhũ hóa thích hợp để tạo nhũ annatto

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng bột annatto (1 g), và

+ khối lượng hỗn hợp propylene glycol kiềm (5 g)

Yếu tố khảo sát: khối lượng chất nhũ hóa từ kết quả Thí nghiệm 6a thay đổi

Cách tiến hành: phối trộn các thành phần bằng máy khuấy từ ở tốc độ 100 v/p trong 15 phút ở nhiệt độ phòng rồi pha loãng trong nước cất ở pH 7 và pH 4,

theo dõi cường độ màu còn lại sau thời gian bảo quản

c Thí nghiệm 6c: Khảo sát độ ổn định của chế phẩm nhũ annatto trong dung môi nước có pH khác nhau

Mục đích: thử nghiệm khả năng hòa tan và độ bền trong nước của nhũ annatto ở pH khác nhau

Phương pháp tiến hành: Theo phương pháp sử dụng trong công trình của Zhang và Zhong (2013) cộng với Yang et al (2013) chúng tôi dùng dãy ống nghiệm chứa nước cất có pH khác nhau (điều chỉnh bằng HCl 1 M hoặc NaOH 1 M) Một dãy có 9 ống nghiệm với giá trị pH tăng dần từ 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và 10 Pha loãng chế phẩm annatto vào mỗi ống nghiệm với lượng chế phẩm bằng nhau (0,01 g) Đánh giá độ ổn định màu bằng phương pháp đo quang phổ, quan sát mắt thường và chụp hình ghi nhận trong suốt quá trình bảo quản ở điều kiện nhiệt độ tăng cường (55 0C trong tối) (Lee et al., 2003)

Yếu tố cố định:

+ chất nhũ hóa sử dụng (kết quả Thí nghiệm 6a), và

+ thể tích dung dịch pha loãng (10 mL)

Yếu tố khảo sát: dung môi nước cất có pH từ thay đổi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và

10

Chỉ tiêu theo dõi: cường độ màu trong quá trình bảo quản trong tối ở 55 0C (Mao et al., 2009)

d Thí nghiệm 6d: Ứng dụng chế phẩm nhũ annatto để phối màu nước cam ép

Mục đích: Thử nghiệm khả năng ứng dụng trong chế biến thực phẩm cụ thể

là nước cam ép

Phương pháp tiến hành: Nước cam được chế biến theo quy trình mô tả trong tài liệu của Taylor (2005) Trái cam sành được lựa chọn, rửa sạch, bổ đôi rồi ép lấy nước, lọc bỏ bã Bổ sung chế phẩm annatto vào nước cam với khối lượng tăng dần

(0; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 g), sau đó cho vào ống nghiệm và khử trùng Pastuer

ở 63 0C trong 30 phút (Ray, 2005) Kiểm tra mẫu nước cam trong suốt quá trình bảo quản ở nhiệt độ 55 0C trong tối bằng phương pháp quang phổ, quan sát và chụp hình ghi nhận để đánh giá độ ổn định màu

Yếu tố cố định:

+ độ pH nước cam (3,2), và

+ thể tích mẫu nước cam (10 mL)

Chỉ tiêu theo dõi: cường độ màu còn lại sau thời gian bảo quản ở 55 0C trong tối (Mao et al., 2009)

2.4.2 Phương pháp phân tích

2.4.2.1 Phương pháp xác định các thành phần

Phương pháp xác định độ ẩm bằng máy sấy hồng ngoại

Chọn nhiệt độ sấy 105 0C, thời gian sấy để ở chế độ tự động, máy sẽ sấy cho đến khi hết lượng ẩm cần xác định trong mẫu

Cho khoảng 2 – 3 g hạt trải đều trên bề mặt đĩa sấy

Đậy nắp máy, kết quả % ẩm sẽ tự động hiển thị trên màn hình

Ghi nhận kết quả sau khi máy báo kết thúc

Tiến hành 3 lần lấy kết quả trung bình (TCVN 3700 – 90)

Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số

Cân chính xác khoảng 2 g mẫu đã nghiền mịn và trộn đều vào chén nung Đặt chén nung lên bếp điện trong tủ hút để than hoá mẫu

Cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 600 0C trong 2 giờ 30 phút (đến khi tro trắng)

Lấy chén ra khỏi lò, để nguội 40 phút trong bình hút ẩm và cân khối lượng Tiếp tục nung và cân cho đến khi chén có khối lượng không đổi

Tính kết quả (X %):

X =

) (

100 ) (

2

2 1

W W

W W







%

Trong đó:

W1: khối lượng chén tro (g),

W2: khối lượng chén (g), và W: khối lượng chén và mẫu (g)

Sai lệch cho phép giữa 3 lần thí nghiệm không được quá 0,2 % Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm được làm tròn đến 0,01 % (TCVN

7038 : 2002)

Phương pháp xác định hàm lượng màu annatto tổng số và hàm lượng bixin

Cân 5 g hạt điều màu nguyên hạt được trích kiệt 2 lần bằng dung môi chloroform với tỷ lệ mỗi lần là 1/10 (w/v), đậy kín beaker và khuấy hỗn hợp trích ly

100 vòng / phút trong 3 giờ (Mahendranath et al., 2010) Hỗn hợp trích ly sau đó được ly tâm thu dịch, chất rắn còn lại được đem trích ly tiếp lần 2 Trộn lẫn hỗn hợp

2 lần trích, đem lọc qua vải mịn Đuổi dung môi trong dịch lọc thu được trong bóng tối ở nhiệt độ 45 0C Lượng sệt thu được đem hòa tan lại bằng 10 mL chloroform, cân khối lượng dung dịch này

Cân khoảng 0,1 g dịch mẫu pha loãng trong 100 mL chloroform Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 và 404 nm bằng cuvet thủy tinh dày 1 cm, mẫu đối chứng là chloroform nguyên chất Tổng số annatto (%) trong mẫu được tính theo công thức của McKeown và Mark (1962):

Trong đó:

A500: độ hấp thụ tại bước sóng 500 nm

A404: độ hấp thụ tại bước sóng 404 nm V: thể tích pha loãng cuối cùng (100 mL) W: khối lượng dịch mẫu (0,1 g)

Tương tự, hàm lượng bixin cũng tính được theo công thức (Parimalan et al., 2011):

Phương pháp xác định hàm lượng màu annatto tổng số trích ly được bằng các loại dung môi khác nhau

Chúng tôi dựa theo phương pháp định lượng annatto tổng số của McKeown

và Mark (1962) để định lượng annatto trích ly được bởi các loại dung môi khác nhau Sau khi tiến hành trích ly màu annatto bằng các loại dung môi khảo sát sẽ thu được hỗn hợp dịch trích ly Hỗn hợp sau khi lọc thì thu được dịch lọc, đem cô đặc dịch lọc rồi hòa tan lại bằng 10 mL chloroform Cân khoảng 0,1 g dịch mẫu pha loãng trong 100mL chloroform Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 và 404 nm bằng cuvet thủy tinh 1 cm, với mẫu đối chứng là chloroform nguyên chất Tổng số annatto (%) trong mẫu được tính theo công thức:

Trong đó:

A500: độ hấp thụ tại bước sóng 500 nm

A404: độ hấp thụ tại bước sóng 404 nm V: thể tích pha loãng cuối cùng (100 mL) W: khối lượng dịch mẫu (0,1 g)

2.4.2.2 Phương pháp tính hiệu suất trích ly và hiệu suất thu hồi annatto

– Hiệu suất trích ly annatto:

HStrích ly (%) = (m1 × 100) / m0

Trong đó: + m1: khối lượng annatto trích ly được,

+ m0: khối lượng chất khô của nguyên liệu ban đầu – Hiệu suất thu hồi:

HSthu hồi (%) = (m1 × 100) / m Trong đó: + m1: khối lượng annatto trích ly được,

+ m: khối lượng annatto tổng số trong nguyên liệu

2.4.2.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Phương pháp trích ly màu annatto bằng dung môi có hỗ trợ vi sóng

Vì đối tượng trích ly là bixin và norbixin là hai chất phân cực yếu nên chúng tôi sử dụng dung môi có tính phân cực vừa phải để tăng hiệu suất trích ly Tuy nhiên những dung môi này hấp thu năng lượng vi sóng nên sẽ nóng lên nhanh chóng Hơn nữa đa số trong chúng có nhiệt độ sôi thấp và giới hạn nhiệt độ để bixin

và norbixin không bị biến đổi là dưới 700C, vì vậy việc kiểm soát nhiệt độ của dịch trích ly là việc cần thiết bởi thiết bị tạo vi sóng là lò dân dụng không có khả năng điều chỉnh nhiệt độ

Theo phương pháp của các tác giả Pan et al (2000, 2002) và Phạm Thành Quân cùng ctv (2006), hỗn hợp trích ly sẽ được chiếu vi sóng gián đoạn nhằm mục đích kiểm soát nhiệt độ Với phạm vi đồ án này với các dung môi cụ thể, sau khi khảo sát mức độ tăng nhiệt độ của mỗi loại dung môi trong môi trường vi sóng, chúng tôi chọn chế độ chiếu 15 giây rồi ngưng 15 giây cho hỗn hợp nguội, sau đó mới chiếu tiếp, cứ như vậy cho đến hết thời gian đã định Beaker chứa hỗn hợp trích

ly được đậy kín bằng màng PE để hạn chế dung môi bay hơi và đặt chính giữa đĩa xoay, mỗi lần chỉ xử lý một mẫu

Phương pháp đánh giá độ ổn định của dung dịch màu pha loãng

Dung dịch màu pha loãng trong quá trình bảo quản ở điều kiện tăng cường ở

55 0C được kiểm tra định kỳ bằng phương pháp đo quang phổ, quan sát bằng mắt thường và chụp hình để so sánh (Qian et al., 2012)

2.5 Thiết kế và xử lý số liệu

2.5.1 Phương pháp thống kê

– Phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố (ANOVA),

– So sánh trung bình Tukey’s HSD (Honestly Significant Difference),

– Trắc nghiệm Student’s t-test,

– Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology)

2.5.2 Phần mềm xử lý số liệu

Thiết kế thí nghiệm, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ bằng bằng phần mềm chuyên

dụng JMP 9.0.2 (SAS Institute Inc., 2011; USA)