TIEU LUÂN CÔNG NGHỆ SINH HOC

Tiểu luận – Công nghệ sinh học I Mở đầu Fire Mello nhận giải Nobel năm 2006 nhờ cơng trình nghiên cứu đột phá họ chế gây bất hoạt gen RNA ngắn, sợi kép đặt tên cho công nghệ RNA interference tạp chí Nature năm 1998 Bởi sợi có nghĩa sợi đối nghĩa RNA gây bất hoạt gen, nên nhóm tác giả cho chế gây bất hoạt gen không bắt cặp sợi đối nghĩa RNA mRNA (như vi khuẩn) họ đưa khái niệm RNA interference chưa biết đến [1] Trên sở nhà khoa học có nghiên cứu chế RNA interfernce để ứng dụng thức tiễn Công nghệ RNA interference có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác mang lại ý nghĩa to lớn khơng mặt kinh tế mà cịn mặt nâng cao sức khỏe cho người Vì để sâu tìm hiểu ứng dụng cơng nghệ RNA interference nên em chon đề tài:”MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CƠNG NGHỆ RNA INTERFERENCE” II Mục đích Làm sáng tỏ vấn đề mà đề tài nêu ra:”MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ RNA INTERFERENCE” III Phương pháp nghiên cứu Để thực đề tài, người thực tham khảo, tổng hợp tài liệu, phân tích, so sánh, đánh giá, chọc lọc, khái qt hóa thơng tin để giải vấn đề mà đề tài nêu SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học IV Nội dung Khái niệm công nghệ RNA interference (RNAi) Công nghệ RNAi công nghệ mẽ, cần vài phân tử dsRNA tế bào đủ để phân hũy mRNA gen đặc thù Kết thực nghiệm cho thấy cơng nghệ RNAi gây bất hoạt gen cách hiệu thể nhân thực Theo số báo cáo cơng nghệ có hiệu cơng nghệ gen đối nghĩa khoảng 1000 lần Dựa thành tựu chương trình genomics, trình tự hầu hết gen quan trọng xác định, từ người ta thiết kế dsRNA tương đồng để gây bất hoạt gen đích Cơng nghệ RNAi tạo cách mạng nghiên cứu y sinh chữa bệnh [1] Cơ chế hoạt động RNAi RNAi chế ức chế biểu vật chất di truyền giai đoạn sau phiên mã Ở thực vật có ba đường ức chế RNA đường ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua trung gian RNA nhỏ có vai trị ức chế siRNA (short interfering RNA, dsRNA ngắn) sử dụng phổ biến nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus Quá trình xảy tế bào chất đường quan trọng tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà dsRNA cấu trúc thứ cấp RNA virus sợi đơn chép gián tiếp Trong trường hợp virus DNA, dsRNA tạo nhờ trình phiên mã bổ sung liên tiếp Cơ chế cũng xảy tương tự động vật Khi có xâm nhập dsRNA, Dicer chất Rnase III đặc hiệu dsRNA để cắt chuỗi kép RNA thành đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide, gọi siRNA Sau đó, siRNA kép hình thành tách làm hai chuỗi đơn chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ tiếp tục liên kết với Argonaute phức hệ RISC Tiếp đó, phức hệ RISC gắn đoạn siRNA nhận biết mRNA tế bào có trình tự tương đồng với trình tự đoạn chuỗi đơn siRNA Sau nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp base tương đồng với trình tự chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt khoảng chuỗi kép siRNA-mRNA thành đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’ Sau bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ RNA nuclease SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học dsRNA dài Tách thành mạch đơn mRNA đích Hình 1: Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi [3] A: Khi vào tế bào, dsRNA dài hoạt động khởi đầu trình RNAi B: Sau dsRNA dài enzyme RNase III Dicer bám vào C: dsRNA dài bị cắt thành siRNA siRNA tổng hợp bên ngồi tế bào sau đưa vào tế bào thơng qua q trình thâm chuyển electroporation D: Các siRNA nạp vào phức hợp RISC Sợi kép ngắn lại mở xoắn để tạo thành sợi đơn ngắn hai sợi sợi sợi đối nghĩa E F: Sợi đối nghĩa RNA phức hợp RISC bắt cặp với mRNA liên kết tương đồng base Cuối RISC phân hũy mRNA [3] Nghiên cứu RNAi ruồi giấm cho thấy dsRNA phân cắt thành đoạn dsRNA ngắn gồm 21- 23 nucleotide Họ cho phân tử siRNA đóng vai trị phân hũy mRNA Sau nhóm Fire Millo xác minh dsRNA dài cắt thành đoạn RNA ngắn (khoảng 25 nucleotide) đoạn dsRNA gây phân hũy mRNA thông qua việc bắt cặp với mRNA [1] RNA kép SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Dicer + ATP SiRNA(21-23bp) RISC SiRNA sợi đơn Bám vào cắt mRNA đích Hình 2: Cơ chế hoạt động RNAi [1] Chúng ta tóm tắt chế hoạt động RNAi sơ đồ RNA sợi kép dài cắt thành mảnh nhỏ siRNA enzyme Dicer thông qua phản ứng ATP SiRNA kép bị tách thành siRNA sợi đơn.Trong mạch đối nghĩa nạp vào phức hợp RISC liên kết phức hợp với mạch RNA bắt cặp base Phức hợp RISC cắt mạch RNA sau mRNA suy thối Một số enzyme quan trọng tham gia vào trình gây bất hoạt gen: + Dicer: Ribonuclease III cắt dsRNA thành đoạn ngắn RNA + RICS (RNA induced silencing complex): Là tổ hợp phức tạp chứa protein họ argonaute • • • Hoạt hóa endonuclease có vai trị cắt mRNA Tương tác với DNA, methyl hóa DNA, biến đổi histone, ngăn cản khởi động phiên mã Tương tác với mRNA tạo tín hiệu để RNAse phân hủy mRNA + RNA dependent RNA polymerase- RdRp: Enzyme tổng hợp RNA khuôn RNA tạo nên dsRNA, nhân sợi siRNA (cây trồng, nấm, giun tròn) + Enzyme tham gia biến đổi nhóm chức protein (histon) nằm lõi nucleosom Ví dụ gắn thêm nhóm methyl khử nhóm acetyl số amino acid đặc biệt protein histone làm thay đổi cấu trúc không gian sợi nhiễm sắc, làm sợi nhiễm sắc cuộn chặt, ngăn cản phiên mã [1] SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Tắt trình phiên mã nhân Tế bào chất mRNA Ngăn cản tịnh tiến Phân tách mRNA Phân hũy mRNA Hình 3: Cơ chế can thiệp RNA tế bào động vật có vú [5] Trong tế bào chất phía bên trái, dsRNA xử lý phức hợp bao gồm Dicer, TAR RNA-dính với protein (TRBP) activator protein protein kinase PKR (PACT) với siRNAs nạp vào Argonaute (AGO2) phức hợp RISC siRNA điều khiển mạch nhận nơi để cắt RNA mục tiêu Được thực hiến xúc tác AGO2 siRNA bổ sung cho vùng khởi động làm tắt trình phiên mã gen nhân thơng qua thay đổi liên quan đến nhiễm sắc methyl hóa histone (trên bên trái); chi tiết phân tử cách xác phương pháp tế bào động vật có vú khơng rõ ràng Ở phía bên phải, nội sinh mã hóa mRNA (pri-miRNA) phiên mã RNA polymerase II (Pol II) bước đầu xử lý Drosha-DGCR8 (DiGeorge hội chứng quan trọng gen khu vực 8) để tạo tiền miRNA (pre -miRNAs) Những tiền chất chuyển sang tế bào chất exportin sau liên kết với phức hợp Dicer-TRBP-PACT, mà trình pre-miRNA nạp vào AGO2 RISC Các miRNA trưởng thành nhận diện nơi đặt mục tiêu ' khu vực chưa dịch (3' UTR) mRNA điều khiển ức chế dịch mã mRNA bị phân hủy q trình (P) -body có chứa enzym SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học DCP1 DCP2 Trong đó: H3K9 histone lysine 9; H3K27 histone lysine 27; m7G 7-methylguanylate; ORF khung đọc mở [5] Một số đặc tính cơng nghệ RNAi RNA sợi kép tác nhân gây tượng làm bất hoạt gen mạnh RNA đối nghĩa sợi đơn Có tính đặc hiệu cao, làm bất hoạt mRNA có trình tự tương đồng với mRNA trưởng thành Có hiệu cao mạnh, cần vài phân tử RNA sợi kép đủ để gây bất hoạt gen tế bào virus Có thể làm câm gen giai đoạn phát triển khác cá thể bước khác trình sinh hóa phân hóa tế bào mơ cách liên kết với q trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, bao gồm methyl hóa histone DNA Đặc biệt cơng nghệ RNAi làm bất hoạt nhóm gen [1] Một số vai trị RNAi 4.1 RNAi kìm hãm tổng hợp protein điều hòa phát triển thể sinh vật Ngay sau khám phá RNA ngắn hiệu ứng gây nhiễu RNA, người ta nhận thấy có lớp RNA hệ gen có phận sinh dục, sâu bọ cánh cứng, chuột người, RNA ngắn miRNA Thực vật chứa đựng lớp phân tử RNA hệ gen MiRNA mở đầu cho nghiên cứu sôi tự nhiên lớp phân tử RNA MiRNA điều hịa biểu gen cách bắt cặp base với mRNA, kết dẫn đến suy thoái mRNA hay tăng cường dịch mã Hiện nay, ước có khoảng 500 miRNAs tế bào động vật có vú, khoảng 30% điều hịa miRNAs Điều cho biết miRNAs đóng vai trị quan trọng suốt trình phát triển thực vật động vật có vú Vì thế, miRNAs phụ thuộc biểu biện gen đặc trưng cho nguyên tắc điều hòa gen Tuy nhiên, ý nghĩa đầy đủ điều hòa RNAi ngắn chưa rõ ràng [1] 4.2 RNAi chế bảo vệ thể chống lại xâm nhiễm virus Người ta sớm nhận tế bào thực vật có chế bảo vệ chống lại xâm nhập virus dựa tượng PTGS Khi bắt đầu lộ PTGS chất lưỡng trị thay cho SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học tượng nhiễu RNA, công việc thực vật ủng hộ đề xuất nhiễu RNA liên quan tới bảo vệ tế bào chống lại xâm nhập virus [1] Ở trồng phương pháp phòng chống bệnh virus sau nghiên cứu: • Phòng chống vector truyền bệnh virus, phương pháp phải sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật tốn kém, gây ô nhiễm môi trường thông qua sử dụng gen kháng vector truyền bệnh sẵn có trồng (ví dụ nguồn gen kháng rầy, truyền gen lùn lúa cỏ ) Tuy dịch bệnh bùng phát khó • kiểm sốt Tạo giống kháng bệnh từ gen kháng bệnh có sẵn trồng Tuy nhiên chiến lược gặp nhiều khó khăn thiếu nguồn gen kháng virus có sẵn trồng Vì cơng nghệ tạo giống truyền thống bó tay việc tạo giống kháng bệnh cà chua, đu đủ … Các công trình nghiên cứu cơng bố năm 1997 cho thấy trồng có hàng rào bảo vệ hiệu chống lại xâm nhiễm virus dựa chế PTCS Bộ máy dsRNA nhận biết RNA virus xâm nhập (hoặc RNA sợi kép virus) ngăn chặn xâm nhập virus cách phá hủy RNA virus Hệ thống RNAi giữ vị trí quan trọng tương tự hệ thống miễn dịch động vật có xương sống Nó nhận biết xâm nhập sinh vật kí sinh, tạo phản ứng gây bất hoạt gen ban đầu sau khuếch đại phản ứng để loại bỏ hoàn toàn nhân tố bên xâm nhập [1] 4.3 RNAi đảm bảo bền vững gen thông qua việc làm bất hoạt gen nhảy Các gen nhảy gây đột biến bất lợi thể Nhóm nghiên cứu Milo Fire cho vùng chứa gen nhảy gen, hai sợi DNA chép, dsRNA tạo thành dẫn đến trình RNAi loại bỏ sản phẩm không mong muốn từ gen nhảy Những phân tử dsRNA ngắn tác động trực tiếp lên sợi nhiễm sắc ngăn chặn dịch mã, phương thức khác để làm bất hoạt gen nhảy Plasterk (2002) cho rằng, chế gây bất hoạt gen RNAi tạo nên hệ thống miễn dịch gen [1] 4.4 RNAi làm tăng độ xoắn (độ đông đặc) nhiễm sắc thể ngăn chặn trình phiên mã SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Các gen nằm vùng heterocromatin (dị nhiễm sắc) nhiễm sắc thể thường nằm trạng thái cuộn chặt, phình với mật độ đậm đặc bị liên kết bị phong tỏa nhóm protein thuộc nhóm histon, nucleohiston Trong trạng thái gen thường im lặng, khơng biểu (khơng có khả phiên mã) biểu yếu Gen biểu thoát khỏi trạng thái Nghiên cứu thực vật cho thấy tượng bất hoạt gen giai đoạn phiên mã Sau phát RNAi, người ta thấy bất hoạt gen giai đoạn phiên mã xảy theo chế tương tự RNAi Sau biết nấm Schizosaccharomyoces pomb, ruồi giấm động vật có xương sống có chế tương tự RNAi với sựu tham gia RNA sợi kép ngắn để giữ cho vùng dị nhiễm sắc thể đông đặc ngăn chặn trình dịch mã Hiện chế phân tử trình ức chế gen mức dịch mã chưa hồn tồn làm rõ Nhưng vai trị biến đổi histon, vai trò protein đặc thù bám dính nhiễm sắc thể HP1 methyl hóa DNA đóng vai trị quan trọng điều khiển gen [1] Một số ứng dụng công nghệ RNAi Trên sở tìm hiểu lý thuyết RNAi công nghệ RNAi nhà khoa học nghiên cứu để có ứng dụng công nghệ RNAi nhiều lĩnh vực mà đặc biệt y học nông nghiêp 5.1 Ứng dụng lĩnh vực y học RNAi gây bất hoạt gen đặc thù (gen đích) nhiều cách khác nhau: (1) Bằng tiêm dsRNA vào động vật (2) Qua đường ruột cách cho tuyến trùng ăn chủng E coli chuyển gen có khả sản sinh dsRNA (3) Bằng gây sốc giun tròn dung dịch có chứa dsRNA (4) Bằng chuyển gen RNAi có khả sản sinh dsRNA vào tế bào động vật, từ dsRNA sản sinh thể để gây bất hoạt gen đích Từ kết nhà khoa học cho sử dụng RNAi phương pháp trị liệu (như dược chất đưa từ bên vào thể liệu pháp di truyền – phương pháp chuyển gen vào thể) Ngay sau công bố trên, xảy bùng nổ nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi y học Nhờ vậy, xác định RNAi trình đặc biệt kiểm chứng để làm ngừng biểu gen tế bào tất thể đa bào Công nghệ có nhiều triển vọng ứng dụng quan trọng, đặc biệt chống lại nhiều bệnh nan y cách hiệu bệnh ung thư bệnh SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học lây nhiễm virus suy giảm nhiễm dịch HIV…[1] Sau số ứng dụng cụ thể công nghệ RNAi y học 5.1.1 Ứng dụng công nghệ RNAi sàng lọc thông lượng cao sinh học ung thư virus 5.1.1.1 Ứng dụng công nghệ RNAi sàng lọc thông lượng cao sinh học ung thư Phương pháp can thiệp RNA HTS (sàng lọc thông lượng cao) giai đoạn sớm so với nhiều phương pháp di truyền cổ điển, sử dụng với số lượng lớn nghiên cứu cho thấy tác động đáng kể phương pháp loạt lĩnh vực, đặc biệt sinh học ung thư Tế bào ung thư chứa tập hợp gen bị đột biến gây ung thư số lượng lớn thông tin gen đột biến tích lũy từ loại trình tự exome trình tự hệ Tuy nhiên, điều khơng có nghĩa tất gen đột biến ung thư phát triển gen đột biến giới hạn gây ung thư Điều quan trọng để biết đột biến gen động lực cho sống cịn phát triển tế bào ung thư Hơn nữa, phát triển mạnh chất ức chế cụ thể nhắm vào gen đột biến đại diện cho lĩnh vực nóng điều trị ung thư mục tiêu, trở thành phần quan trọng nhiều phương pháp điều trị ung thư độ xác việc tiêu diệt tế bào ung thư đặc biệt tương đối tác dụng phụ so với phương pháp hóa trị liệu truyền thống Tuy nhiên, độ xác thường có số tế bào đó, nhược điểm nội điều trị ung thư mục tiêu Như vậy, chất ức chế thường biểu hoạt động hiệu hạn chế tiêu diệt tế bào ung thư cho phép tế bào ung thư phát triển kháng thuốc, lý thất bại phương pháp việc điều trị Thách thức lớn chủ yếu để điều trị ung thư xác định mục tiêu, điều cần thiết cho tồn phát triển tế bào ung thư, dấu hiệu sinh học dự đốn loại ung thư nhạy cảm kháng với chất ức chế cụ thể Vì vậy, RNAi HTS hữu ích việc lựa chọn mục tiêu ung thư có chọn lọc để điều trị cho bệnh nhân Hơn nữa, xét nghiệm kiểu hình để phát số lượng tế bào khả tồn thực Vì vậy, khơng phải đáng ngạc nhiên RNAi HTS áp dụng để phát đột biến chức gen xác định mục tiêu điều trị ung thư kiểu hình nghiên cứu sớm Sàng lọc shRNA gây chết toàn gen trọng thành lập để xác định phụ thuộc chức hai tế bào vú dòng mà biến đổi gen gây ung thư cách sử SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học dụng với kiểu hình khác Gen Proteasome làm phong phú số 154 gen xác định cho thấy phụ thuộc cao vào tế bào chuyển hóa giống myoepi-thelial giống tế bào biến đổi Một thư viện siRNA mở rộng gen định dạng gộp áp dụng để xác định gen điều tiết nhạy cảm với RAS tế bào ung thư đột biến đại trực tràng DLD, tế bào có khơng có dạng đột biến gen gây ung thư KRAS Một tập hợp điều hòa phân bào, bao gồm phân hủy suy thoái proteasome yếu tố phân bào PLK1, tăng phụ thuộc vào tế bào KRAS- đột biến vào trạm kiểm sốt phân bào phát triển Những dịng tế bào KRAS- đột biến nhạy cảm với phương pháp điều trị chất ức chế PLK1 in vivo xenograft mơ hình Các chất ức chế PLK1 siRNAs thử nghiệm lâm sàng thú vị để xác định RAS khối u biểu tăng độ nhạy cảm việc chuẩn đoán lâm sàng MED12 xác định yếu tố định kháng thuốc sử dụng 24.000 shRNAs nhắm mục tiêu 8000 gen người dòng ung thư phổi chứa chuyển EML4 ALK kinase, nhạy cảm với ALK chất ức chế PF-02341066 (crizotinib) NVP-TAE684 Hơn thermore MED12 tắt gây kháng thuốc khác ức chế thụ thể tyrosine cách điều tiết tiêu cực TGF-βR2 thông qua tương tác với TGF-βR2 Mặc dù số nhóm đạt tiến đáng kể việc xác định tác nhân quan trọng gây ung thư ung thư mục tiêu trị liệu cách sử dụng kỹ thuật RNAi HTS, gần tất số phương pháp thực ống nghiệm Như ống nghiệm dẫn số kết quan trọng lạ nghiên cứu tế bào ung thư có khả gom lại tương tác phức tạp gồm khối u vi môi trường họ, bước quan trọng hướng tới tăng trưởng tế bào ung thư hiểu biết bối cảnh sinh lý hơn, khơng phải thiết kế nhiều phương pháp điều trị hợp lý cho bệnh ung thư dựa phương pháp sàng lọc in vitro Beronja đồng nghiệp thực thí nghiệm gen thể lentivirus shRNA mơ biểu bì bình thường phơi thai siêu sinh sản HrasG12V gây khối u chuột Một số lượng gen mong đợi bất ngờ điều chỉnh tăng trưởng biểu bì phơi thai xác định phân tích shRNA tương đối phong phú Sau loại bỏ gen cần thiết điều kiện coi gen bảo vệ / khả tồn tại, khoảng 250 gen khác xác định gen gây ung thư cụ thể oncogene- điều hịa sinh trưởng Chúng đại diện cho gen nhắm đến mục tiêu ung thư mà không gây ảnh hưởng xấu đến mô bình thường Trong số hits hàng SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Phương pháp chữa bệnh qua đường mũi siRNAs chứng minh có hiệu cao phương pháp để ức chế nhiễm RSV chuột lời hứa phương pháp chứng minh thử nghiệm lâm sàng RSV diễn người Trong nghiên cứu ban đầu, siRNAs tiêm vào thể cách sử dụng hạt nano polymer dựa nanochitosan thâm chuyển thuốc thử dùng mình, gợi cách hiệu can thiệp RNA mà không gây phản ứng ngăn chặn protein tế bào tiết bị virus công Một phương pháp thứ hai siRNA nghiên cứu đề tài cho virus parainfluenza RSV đồng thời thể cạnh tranh siRNAs hiệu chống lại hai mục tiêu khác virus Cho dù cạnh tranh dẫn từ độ bão hòa RISC phức effector hay cách khác thành phần thượng nguồn đường can thiệp RNA không rõ ràng, siRNA tải nên tránh chiến lược điều trị chống lại nhiều mục tiêu Hình 6: Vận chuyển RNA gây nhiễu [5] A Phương pháp tiếp cận khơng chọn lọc Nhóm cholesterol liên kết với biến đổi hóa học siRNAs để vận chuyển hệ thống (Aa) siRNAs chuyển giao cách hệ thống hạt bền acid nucleic-lipid (SNALPs) (Ab) B Phương pháp tiếp cận có chọn lọc Aptamer-siRNA chimaeras cho phép siRNAs SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học vận chuyển cho loại tế bào cụ thể mà hiển thị thụ thể công nhận aptamer (Ba Bb) Một phương pháp tiếp cận bao gồm tất - RNA sử dụng để vài aptamer siRNAs (Ba), phương pháp tiếp cận biotinstreptavidin sử dụng để đạt khớp nối (Bb) Mảnh nặng chuỗi kháng thể (Fabs) siRNAs liên kết với protamine để cung cấp siRNAs vào thụ thể bề mặt tế bào cụ thể (Bc) Các hạt nano mà hiển thị ligand cụ thể bề mặt chúng sử dụng để nhắm mục tiêu siRNAs với loại tế bào đặc biệt (Bd) (PEG, polyethylene glycol) [5] Các nghiên cứu truyền qua âm đạo virus herpes simplex (HSV-2) chuột cho thấy nhiễm trùng bị chặn sử dụng chất diệt vi sinh vật siRNA Các ứng dụng âm đạo lipid-đóng gói, siRNAs chưa sửa đổi nhắm mục tiêu gen HSV-2 thử nghiệm chuột điều trị hiệu lực siRNAs dùng trước sau tiếp xúc virus đánh giá khoảng thời gian 15 ngày Sáu ngày sau nhiễm bệnh, 70% số chuột điều trị với loại siRNA trước phơi nhiễm với virus cho thấy khơng có dấu hiệu nhiễm HSV-2 Tuy nhiên, sau thách thức virus, kết hợp hai siRNAs với mục tiêu virus riêng biệt yêu cầu bảo vệ chống lại nhiễm HSV-2 Những kết siRNAs lipid-đóng gói sử dụng effec kịp thời diệt vi sinh vật bề mặt niêm mạc, khơng có độc tính rõ ràng thể Gộp chung lại với nghiên cứu phương pháp chữa bệnh qua đường mũi, màng niêm mạc dường nơi đặt có hiệu kịp thời cho siRNA Cách tiếp cận chứng minh tảng hữu ích cho việc phân phối điều trị siRNAs bệnh virus khả tiếp cận, chi phí hiệu [5] SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Phiên mã ngược phức hợp Tích hợp phức hợp Hình 7: Virus vận chuyển RNA kẹp tóc ngắn [5] Vector lentivirus sử dụng để cung cấp cho việc điều trị điều trị, shRNA – biểu gen chuyển tích hợp vào hệ gen biểu shRNA ổn định Vector Adenovirus adeno-associated virus (AAV) khơng tích hợp gen chúng vào hệ gen thay biểu shRNAs episomally cho mức độ vừa phải ổn định biểu shRNA [5] 5.1.3 Các chiến lược sử dụng RNAi điều trị cho bệnh nhân Kể từ mô tả can thiệp RNAi động vật so với thập kỷ trước, có tiến nhanh chóng việc sử dụng phương thức điều trị chống lại bệnh tật người Những tiến hiểu biết chế can thiệp RNA nghiên cứu RNAi thể phương pháp điều trị dựa công nghệ RNAi sớm cung cấp mạnh mẽ kho vũ khí chống lại tác nhân gây bệnh bệnh mà việc điều trị khó khăn Phát gần nhấn mạnh hứa hẹn việc sử dụng ứng dụng kỹ thuật RNAi cho điều trị Thiết kế cung cấp chiến lược cho phân tử RNAi effector phải xem xét cách cẩn thận để SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học giải cách an toàn đảm bảo hiệu quả, thành công điều trị bệnh cho người Như thấy cơng nghệ RNAi ứng dụng nhiều việc chữa trị cho bệnh nhân Cụ thể bệnh ung thư, bệnh virus… RNAi xem “thần dược” chiến lược chữa bệnh cho người Sau số bệnh khác có liên quan đến việc sử dụngcông nghệ RNAi việc chữa trị Như bệnh mắt Trong hai thử nghiệm lâm sàng RNAi liên tục, tiêm trực tiếp siRNAs nhắm đến mục tiêu yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) hay thụ thể (VEGFR1) có thực để kiểm tra an toàn hiệu mắt SiRNAs Ocularly nhắm mục tiêu VEGF (Acuity Dược phẩm) VEGFR1 (siRNA liệu pháp) giai đoạn đầu thử nghiệm lâm sàng để điều trị AMD khơng có tác dụng phụ, điều kiểm chứng bệnh nhân Phương pháp tiêm trực tiếp mang lại hiệu bệnh mắt khác Các bệnh thối hóa thần kinh: Đưa RNAi vào não chuột sử dụng cách hiệu để điều trị bệnh thối hóa não điều hịa loại (SCA1), bệnh di truyền trội phần nhóm rối loạn thối hóa thần kinh bao gồm bệnh Huntington SCA1 mở rộng lặp CAG ba nucleotide dạng đột biến gen SCA1 (Sca1; gọi Atxn1), tạo polyglutamine (polyQ) mở rộng Sự tích lũy sản phẩm gen polyQ khiếm khuyết có hại cho tế bào thần kinh, làm cho mục tiêu lý tưởng RNAi-knockdown qua trung gian Knockdown sản phẩm polyQ chuột đạt kết cách sử dụng AAV shRNA vector tiêm vào não chuột SCA1 dẫn đến tiến triển bệnh lý tế bào thần kinh, điều kiện có hiệu dẫn truyền thấp Các nghiên cứu khác tập trung vào mơ hình chuột có bệnh thối hóa thần kinh, teo lat-Eral sclerosis (ALS) Lentivirus vector RNAi chống lại đột biến gen superoxide dismutase (Sod1) dẫn đến lâu dài, không biểu gen ổn định, với việc cải thiện sống tế bào thần kinh vận động trì hỗn thời điểm biểu bệnh chuột Chiến lược điều trị dựa vào công nghệ can thiệp RNA để chống lại SCA1 ALS cho thấy hiệu phương pháp phân phối virus thể mà không gây độc, khơng có tác dụng phụ vector liên quan [5] SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Cơng nghệ sinh học Nội bào Hình 8: Tác dụng kích thích miễn dịch cơng nghệ RNAi [5] dsRNA dài 30 cặp base kích hoạt protein kinase R (PKR) kích hoạt phản ứng interferon (IFN), làm cùn-kết thúc, siRNAs phát RIG-I siRNAs tích hợp vào endosomes kích hoạt thụ thể Toll-like (TLRs), tùy thuộc vào diện họa tiết miễn dịch, gây loại I interferon phản ứng cách kích hoạt yếu tố phiên mã factor-kappaB hạt nhân (NFkappaB), gây phản ứng loại I interferon cách kích hoạt yếu tố phiên mã factorkappaB hạch nhân (NFkappaB), kích hoạt yếu tố phiên mã (ATF2) interferon yếu tố định (IRF) (MyD88: myeloid phân biệt gen phản ứng ban đầu 88; TRIF: TLR-protein tín hiệu adapter) [5] 5.2 Ứng dụng lĩnh vực nông nghiệp Như nêu cơng nghệ RNAi có nhiều ứng dụng trung y học Khơng cơng nghệ cón có ứng dụng vô quan trọng lĩnh vực nông nghiệp RNAi phương pháp can thiệt gen đầy hứa hẹn có tác dụng đáng SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học kể cải tiến trồng Điều cho phép điều chỉnh giảm lại biểu gen với cách xác mà khơng ảnh hưởng đến biểu gen khác Cơ chế can thiệp RNA nhanh phân tử nhỏ can thiệp RNA để ngăn chặn gen mà ta quan tâm cách hiệu RNAi khai thác thực vật việc chống lại tác nhân gây bệnh, côn trùng / sâu bệnh, tuyến trùng, virus gây thiệt hại cho trồng từ ảnh hưởng đến kinh tế đáng kể Bên cạnh ý nghĩa việc trì tính tồn vẹn gen tăng trưởng phát triển, tổng hợp gen RNAi cịn có vai trị quan trọng quản lý stress thực vật Sau ứng dụng cụ thể công nghệ RNAi nông nghiệp Sửa đổi gen can thiệp RNA nhỏ cách mà qua thực vật phản ứng với tác động môi trường Do đó, nghiên cứu vai trị RNAi việc điều hòa biểu gen giúp nhà nghiên cứu khám phá tiềm RNAi quản lý stress phi sinh học sinh học việc cải tiến giống trồng [8] 5.2.1 RNAi chức gen tuyến trùng kí sinh thực vật Vai trị cơng nghệ RNAi gần chứng minh tuyến trùng ký sinh thực vật Nó cơng cụ điều tra có khả mạnh mẽ cho gen- khám phá mở rộng chức gen giúp cải thiện hiểu biết tuyến trùng ký sinh thực vật RNAi giúp xác định gen tiêu protein cho chiến lược kiểm soát tuyến trùng Triển vọng lạ sức chống cự phụ thuộc vào tạo hình thức hiệu RNA vắng mặt gen mục tiêu nội sinh không gây hại đến thân Sau phân tử RNA trở thành có sẵn cho tuyến trùng có khả tiêu hóa thơng qua ống dẫn thức ăn Nếu yêu cầu đáp ứng, việc kháng tuyến trùng kí sinh đạt cung cấp RNA mạch kép nhằm vào gen giun tròn tạo tác dụng RNAi gây chết thiệt hại lớn ký sinh trùng [6] RNAi chứng minh làm giảm biểu loạt gen giun tròn ký sinh thực vật công cụ mạnh mẽ để phân tích chức gen giun trịn RNAi qua trung gian ức chế gen cần thiết cho phát triển tuyến trùng, tồn ký sinh giúp tiết lộ mục tiêu để kiểm sốt tuyến trùng Giun kí sinh thực vật thời đại gen phải đối mặt với thách thức để phát triển RNAi điều chỉnh âm cho phân tích chức thơng lượng cao SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học Mặc dù có số hạn chế, cơng nghệ RNAi cho phép giảm tổn thất chức kiểu hình phân tích đại diện cho bước đột phá lớn gen chức cho tuyến trùng ký sinh thực vật, đặc biệt cho biến đổi di truyền sinh vật không khả thi RNAi cho phép phân tử ký sinh điều tra cung cấp khả xác định mục tiêu cụ thể cần thiết cho sống tuyến trùng phát triển phương pháp kiểm sốt Tuy nhiên cơng nghệ RNAi có hiệu khác tùy lồi Ứng dụng cơng nghệ RNAi chuyển gen tạo phương pháp để chống lại mục tiêu tuyến trùng thành cơng Hiểu biết máy móc kỹ thuật RNAi tuyến trùng ký sinh thực vật giúp nhà nghiên cứu đạt hiệu tối ưu gen si- ức chế nên cho phép mở rộng quy mơ RNAi xét nghiêm kiểu hình Việc phối hợp phương pháp khác để xác định chức gen, tắt gen, hệ thống biểu gen, protein hoạt động xác định đoạn protein nối cho giun tiết quan tác động, làm tăng lợi ích thiết thực biểu từ gen giun trịn [7] ống ni RNAi khơng tác dụng Nhân thực vât ống ni Tắt biểu mục tiêu Hình 9: RNAi việc làm giảm biểu gen [6] (a) Khi có tác động cơng nghệ RNAi (Nhân thực vật bình thường).(b) Khi khơng có tác động công nghệ RNAi (kết mục tiêu không biểu hiện) SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học 5.2.2 Công nghệ RNA kẹp tóc thực vật Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO), Úc trung tâm nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi số giới 10 năm qua đăng kí phát minh lĩnh vực CSIRO đăng kí quyền cơng nghệ kẹp tóc Úc, Trung Quốc, New Zealand CSIRO phát minh RNA kẹp tóc thực vật – cơng nghệ đầy sức mạnh cho tạo giống trồng Đặc biệt, họ phát phần lớn sợi đơn (khơng có cặp đơi) cấu trúc RNA kẹp tóc có nguồn gốc intron hiệu gây bất hoạt gen cao nhiều Cơng nghệ RNA kẹp tóc CSIRO công nghệ hiệu để gây bất hoạt gen thưc vật ứng dụng động vật CSIRO thiết kế hàng loạt vector chuyển gen gọi RNA vector có khả gây bất hoạt nhiều gen khác Công nghệ RNA kẹp tóc sử dụng để tạo giống trồng chuyển gen với tính trạng mong muốn mà công nghệ khác làm Họ ứng dụng cơng nghệ RNA kẹp tóc để tạo hạt có dầu với thành phần chất béo có dầu tốt cho người cải thiện tính chất tinh bột lúa mì Họ tạo giống trồng có hạt chứa hàm lượng dầu béo olleic cao làm acid béo giàu cholesterol Một giống có hàm lượng dầu béo stearate cao giúp tạo dầu béo margarine với chất lượng tốt Việc cải tiến chất lượng tinh bột Hòa Thảo mang lại lợi ích cho sức khỏe thơng qua việc làm giảm bệnh đái đường type [1] 5.2.3 Ứng dụng công nghệ RNAi cải tiến giống trồng Trong năm gần đây, kỹ thuật di truyền xem công cụ quan trọng, lựa chọn công chọn tạo giống trồng mang tính trạng mong muốn như: màu sắc mới, chất lượng tốt hơn, đặc biệt kháng lại tác nhân gây bệnh virus côn trùng Một số virus kiểm sốt thông qua biện pháp tạo trồng chuyển gen mang gen đoạn gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh sử dụng chuyển vào trồng để tạo tính kháng loại khác như: cấu trúc virus theo chiều xuôi hay chiều ngược, cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) miRNA nhân tạo có đích trình tự gen virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi , quan tâm nhiều ứng dụng rộng rãi Trên trồng, công nghệ RNAi sử dụng để cải thiện tính trạng mong muốn nâng cao tính chống chịu, cải thiện hàm lượng dinh dưỡng, can thiệp SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học chế sinh sản cây, tạo sản phẩm thứ cấp… Jagtap cộng thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Shivaji, Ấn Độ có viết tổng quan lĩnh vực Nghiên cứu cải tiến trồng nhằm nâng cao hiệu chúng dựa kỹ thuật đại tiến hành nhiều loại thực vật Kết đạt trồng chuyển gen tác động đến việc cải tiến trồng theo cách chưa có Những tiến bật thực kỹ thuật di truyền hai thập kỷ qua với việc tìm kiếm gen từ nguồn khác đưa chúng vào trồng tạo tính trạng mong muốn RNAi xác định chế tự nhiên điều khiển biểu gen sinh vật bậc cao từ thực vật đến người Sự biểu gen bị bất hoạt công nghệ RNAi Nghiên cứu công nghệ RNAi tập trung thêm vào phạm vi microRNAs, hairpin RNA promoter methyl hóa Thao tác RNAi theo đường tạo phân tử RNA nhỏ để tăng biểu gen cây, đường tạo tính trạng chất lượng có tiềm bảo vệ trồng trước tác nhân gây stress sinh học phi sinh học Ngồi ra, cơng nghệ RNAi cịn ứng dụng cải thiện dinh dưỡng, thay đổi hình thái tăng cường tổng hợp hợp chất thứ cấp Ngoài vai trò điều hòa biểu gen, RNAi sử dụng chế bảo vệ tự nhiên chống lại ký sinh phân tử gen nhảy, yếu tố di truyền virus có ảnh hưởng đến tính ổn định hệ gen Mặc dù năm qua có nhiều tiến đưa lĩnh vực RNAi, tiềm RNAi để cải thiện trồng cần nghiên cứu đầy đủ Sự phức tạp đường RNAi, máy phân tử liên kết trình phát triển cần giải thích [10] SVTH : Nguyễn Thị An Nhiên ... Công nghệ sinh học IV Nội dung Khái niệm công nghệ RNA interference (RNAi) Công nghệ RNAi công nghệ mẽ, cần vài phân tử dsRNA tế bào đủ để phân hũy mRNA gen đặc thù Kết thực nghiệm cho thấy công. .. Nhiên Tiểu luận – Công nghệ sinh học lây nhiễm virus suy giảm nhiễm dịch HIV…[1] Sau số ứng dụng cụ thể công nghệ RNAi y học 5.1.1 Ứng dụng công nghệ RNAi sàng lọc thông lượng cao sinh học ung thư... RNAi quản lý stress phi sinh học sinh học việc cải tiến giống trồng [8] 5.2.1 RNAi chức gen tuyến trùng kí sinh thực vật Vai trị công nghệ RNAi gần chứng minh tuyến trùng ký sinh thực vật Nó cơng