Tiểu luận công nghệ sinh học

Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh

1/ Đặ t v ấ n đề :

Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sởcác kĩ thuật mới mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩthuật nuôi cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bị chomột cuộc cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kĩ thuật

Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhàchọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kìchọn lọc

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm

70 Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào.Phần lớn các phòng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là vinhân giống trong ống nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả năngđóng góp cho nnhững nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến

di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển

gen) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học Đề tài “Các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật” giúp cho người viết có được

những kiến thức cơ bản về nuôi cấy mô tế bào thực vật, về các hướng nghiên cứu và ứngdụng đã được tiến hành thành công tại các phòng thí nghiệm

2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :

Đối tượng nghiên cứu: là mô và tế bào thực vật, thành phần môi trường và các chấtkích thích sinh trưởng

Phạm vi nghiên cứu: chỉ đề cập đến các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấymô và tế bào thực vật

3/ Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từcác nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, sosánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài

Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rấtmong được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp Tác giả chân thànhbiết ơn

4/ Cấu trúc tiểu luận:

Phần 1: Vi nhân giống in vitro

Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn

Phần 3: Chọn dòng tế bào thực vật

Phần 4: Dung hợp protoplast và lai tế bào sôma

Phần 5: Chuyển gen ở thực vật

Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở Việt Nam

PHẦN MỞ ĐẦU

DUNG

MỤC LỤC

Trang

Phần mở đầu 1

Phần nội dung 3

Phần 1: Vi nhân giống in vitro……… 3

Phần 2: Tạo cây đơn bội và ứng dụng trong nghiên cứu và thực tiễn……… ……… 4

I Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo 4

1 Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy 4

2 Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro 4

II Tái sinh cây 5

III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn 5

Phần 3: Chọn dòng tế bào thưcï vật……… 6

I Cơ sở khoa học 6

II Vật liệu và phương pháp chọn dòng 7

III Chọn dòng chịu bệnh 8

IV Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường 11

V Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao 13

Phần 4: Dung hợp protoplast và lai tế bào sôma……… 15

I Dung hợp protoplast và lai nhân 15

II Lai tế bào chất 18

Phần 5: Chuyển gen ớ thực vật……….……….21

I Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật 21

II Các phương pháp chuyển gen 22

1 Chuyển gen bằng Agrobacterium 22

2 Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus 23

3 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 23

4 Phương pháp bắn gen 23

5 Phương pháp vi tiêm 24

Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thưc vật ở Việt Nam……… 25

KẾT LUẬN ….27

TÀI LIỆU THAM KHẢO………28

Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO.

Vi nhân giống in vitro gọi tắt là vi nhân giống là hệ thống sử dụng sự phát triểnnhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây

Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không nhữngquyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo Các công trình củaD.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về ditruyền Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làmsạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân

Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trênmôi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinhtrưởng Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các câyđịnh nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp Sự phát triểnnhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ Chồi được nhân lên sau 3đến 4 tuần Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trìnhcứ thế được lặp lại Trong một số trường hợp, rễ có thể tạo ngay trên môi trường nhân,trong một số trường hợp khác, chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin hoặckhông có auxin để tạo rễ Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phươngpháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặcđiểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền Hiện nay nhờ phát triểnnhững môi trường và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã được tăng lên nhiều (58 – 515

chồi/tháng) Đặc biệt là nhân chồi trong môi trường lỏng có lắc hoặc nhân trong cácreactor

Trong một số trường hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôihoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo Phương pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhưngthường kéo theo sự biến dị sôma nên trước khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cầnkiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền

Vi nhân giống có những ưu việt sau:

-Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất

-Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1 m2 nền có thểđể được tới 18.000 cây

-Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảmcác cây giống sạch bệnh

-Thuận tiện và là hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng15kg) Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4oC tronghàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đền 95%

Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều Mấy năm gần đây, hàng nămtrên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đápứng được yêu cầu thực tiễn

PHẦN NỘI DUNG

Moôt vaân ñeă hieôn nay laø giaù cađy troăng nhađn baỉng phöông phaùp vi nhađn coøn cao(2500 – 3000 ñ/cađy) vì vaôy caăn phại cại tieân caùc qui trình nhađn ñeơ laøm há giaù thaønh, ñaịcbieôt laø cô giôùi hoùa caùc khađu nhađn hoaịc chư nhađn nhöõng gioâng cađy thaôt qủ hieâm vaø coù giaùtrò kinh teâ cao Tređn thöïc teâ cađy nhađn baỉng phöông phaùp vi nhađn bao giôø cuõng ñaĩt hôn cađygioâng töø hát.

Hieôn nay nhađn gioâng ñaõ thaønh cođng tređn nhieău gioâng cađy nhö lan, hoa cuùc, hoahoăng, caơm chöôùng, döùa, mía, dađu tađy, chuoâi, cam, quyùt, thođng…

Vi nhađn gioâng ngoaøi vieôc öùng dúng ñeơ nhađn nhanh moôt soâ gioâng cađy coøn coù theơ ruùtngaĩn thôøi gian ñöa caùc cađy lai vaø caùc loaøi cađy nguyeđn chụng töï nhieđn coù caùc ñaịc ñieơm toâtvaøo sạn xuaât hoaịc nhađn nhanh boâ mé cụa caùc caịp lai trong sạnh xuaât hát lai

Phaăn 2: TÁO CAĐY ÑÔN BOÔI VAØ ÖÙNG DÚNG TRONG NGHIEĐN CÖÙU VAØ THÖÏC TIEÊN.

Coù nhieău phöông phaùp táo cađy ñôn boôi, nhöng töø nhöõng naím 60, vieôc táo cađy ñônboôi baỉng nuođi caây bao phaân vaø hát phaân ñöôïc phaùt trieơn Cađy ñôn boôi coù theơ nhaôn baỉngnuođi caây bao phaân hoaịc hát phaân tređn mođi tröôøng thách (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs,1977) hoaịc mođi tröôøng loûng (Wernicke & cs, 1976) Trong quaù trình nuođi caây, hát phaânphađn chia, táo mođ séo hoaịc phođi vaø tieâp theo coù theơ táo cađy

I.Caùc yeâu toâ ạnh höôûng leđn söï hình thaønh phođi vaø mođ séo.

1.Caùc yeâu toâ lieđn quan ñeân nguyeđn lieôu nuođi caây.

Tráng thaùi sinh lyù cụa cađy cho bao phaân hay hát phaân ạnh höôûng raât lôùn ñeân hátphaân nuođi caây in vitro Tuoơi cụa cađy, söï thay ñoơi chu kyø quang cuõng nhö nhieôt ñoô laønhöõng yeâu toâ ạnh höôûng ñaùng keơ ñeân nuođi caây táo cađy ñôn boôi Keât quạ nghieđn cöùu cụaDunwell (1976) cho thaẫy tư leô phođi cao nhaôn ñöôïc khi söû dúng nhöõng nú hoa hình thaønhsôùm vaø cađy phaùt trieơn ôû nhieôt ñoô thaâp hoaịc ngaĩn ngaøy vôùi cöôøng ñoô chieâu saùng cao cho tưleô táo phođi töø hát phaân cao hôn

ÔÛ moôt soâ loái cađy hát phaân ôû giai ñoán nhađn sôùm cho tư leô táo phođi vaø mođ cao, ôûmoôt soâ gioâng khaùc thì hát phaân ôû giai ñoán mitos ñaău cho hieôu quạ toât hôn Vaân ñeă kieơugen cuõng raât quan tróng, Jacobsen (1978) bao phaẫn cụa caùc cađy khoai tađy nhò boôi táo töøcađy ñôn boôi söû dúng ñeơ nuođi bao phaân coù hieôu quạ hôn so vôùi bao phaân töø cađy boâ mé.Ngoaøi ra xöû lí bao phaân ôû nhieôt ñoô thaâp (3 – 10oC) cuõng gia taíng tư leô táo mođ vaø phođi töøhát phaân (Wenzel & cs, 1977)

2.Caùc yeâu toâ lieđn quan ñeân ñieău kieôn nuođi caây in vitro.

Thaønh phaăn cacbonhydrat trong mođi tröôøng heât söùc quan tróng, ñaịc bieôt laø ñöôøngsucrose khi nuođi caây bao phaân thuoâc laù caăn töø 2% ñeân 4% Ñoâi vôùi khoai tađy vaø luùa caănñeân 6%, thaôm chí 12%

Trong caùc chaât höõu cô, caùc axit nhö glutamic coù taùc dúng kích thích phaùt trieơn phođi

ôû moôt soâ gioâng cại vaø thuoâc laù, serin ñaịc bieôt caăn cho phaùt trieơn phođi töø hát phaân thuoâclaù Caùc dòch chieât töï nhieđn nhö dòch chieât khoai tađy, dòch chieât naâm vaø moôt soâ chaât khaùcnhö vitamin C, nöôùc döøa coù taùc dúng tích cöïc cho táo phođi, mođ séo vaø taùi sinh cađy trongnuođi caây bao phaân

Auxin ñaịc bieôt quan tróng cho táo mođ séo nhöng lái öùc cheâ táo phođi Vì theâ trongtröôøng hôïp táo phođi caăn traùnh söû dúng auxin Noùi chung auxin thöôøng coù taùc dúng ôû giai

đoạn nuôi cấy ban đầu Cytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy.Trong một số ít trường hợp ethylen kích thích tạo mô sẹo Wilson & cs (1978) cho biếtnuôi cấy bao phấn trong môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.

Bổ sung vào môi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làmtăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy Đốivới thuốc lá mật độ tối ưu là 105 hạt/ml môi trường Đối với các cây khác mật độ daođộng từ 104 đến 105

Aùnh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần300-500 lux Nhiệt độ bình thường từ 25-28oC là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn vàhạt phấn của hầu hết các giống cây

II.Tái sinh cây.

Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ,thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi Đối với mộtsố loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy banđầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phảichuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng Một số trường hợp phảidùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây

Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trênmôi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môitrường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin Các cytokinin thường hay dùng làBAP và kinetin Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừathường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc

Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉlệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốcthường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%) Wang và cs (1977)thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao.Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978)

Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả câynhị bội và đa bội Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhịbội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sựphân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy

III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn.

Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệuđể tạo các dòng thuần Muốn tạo dòng thuần phải lương bội hóa các cây đơn bội bằng xử

lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây Như đã nóitrên, ở một số lòai cây có thể nhận được cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy baophấn hoặc hạt phấn, nhưng trong trường hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹlưỡng

Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng Chúng được sử dụngtạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) và

rút ngắn thời gian tạo hạt lai Các dòng đơn bội kép đã tạo được ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa… Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và chất lượng tuyệt hảo đã được tạo ra bằng phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978) Nhiều giống lúa mới như Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin

& cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã được tạo bằng phương pháp nuôi cấy hạt phán Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn được sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử

Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính trạng lặn Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch Cây đơn bội cũng được dùng trong lai khác lòai để rút ngắn thời gian ổn định về NST Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến

Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn

Bao phấn hoặc Giống mới

hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn

Cây đơn bội

Lưỡng bội hóa

Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng

Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV).

I.Cơ sở khoa học.

Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng Mỗi loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau

Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trưởng Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa Cũng như cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình Một

loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loạikhông liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen Những thay đổi ngoàigen không di truyền được.

Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượngphổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bàocó thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào.Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từtế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây táisinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980) Larkin va Scowcroft (1981)đưa ra một định nghĩa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cảnhững thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào

II.Vật liệu và phương pháp chọn dòng.

Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng Các vật liệu có thểlà tế bào cho đến các mô phân hóa Mỗi loại vật liệu có những ưu điểm và nhược điểmriêng Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của cácphương pháp nuôi cấy đối với từng loại cây

Vật liệu thường dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus) Mô sẹo được dùngđể chọn các dòng chống chịu như chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối(McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấpcao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986)

Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phương pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trênmôi trường chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào độtbiến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phươngpháp chọn lọc từng bước tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất địnhcủa tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn Ngoài ra cũng có thể sử dụngkết hợp cả hai phương pháp Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bìnhthường liên tục trên môi trường chọn lọc hoặc khi chuyển môi trường chọn lọc và sau mộtthời gian dài cấy trên môi trường không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã được chọn lọc

Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm là đơn giản nhưng nguyênliệu này có một số nhược điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn cónhiều tế bào bình thường nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những câymang đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trongmột cây có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bìnhthường Để khắc phục nhược điểm này có thể giảm kích thước của mô: mô càng nhỏ càngtốt Trọng lượng mô thường dùng là 100-150 mg, nhưng có thể giảm xuống đến 10-20 mg(Wakaha & Widholin, 1987)

Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã được nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV(Kishinami & Widholin, 1986; Watad và cs, 1985) Đối với loại tế bào này các phươngpháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bước cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đốitượng Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tếbào được tiếp xúc đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhưng một nhược điểm quan trọng làsau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trường hợp có thể

mất hẳn Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhậnđuợc cây (Dix, 1990) Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòngcó khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn Trong trường hợp nàythì tế bào dịch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt làviệc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.

Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặttrong CDTBTV Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất Từng tế bào được pháttriển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và môsẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh đượchiện tượng khảm Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs,1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs,1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast

Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhấtlà tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệthống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế Hiện nay hệ thống nuôi cấyprotoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng nhưkhoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố Vì vậy protoplast sẽ trở thành vậtliệu lý tưởng cho CDTBTV Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quantrọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt làdung hợp tế bào và chuyển gen

Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏngvà protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyênliệu CDTBTV Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh &Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984) Fluhr &

cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh McCabe & cs(1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá

Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo , tế bàodịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến đểlàm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khitách bằng tia cực tím (UV) hoặc N-methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG).Phương pháp tương tự cũng được một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng.N-ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981).Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trước khi đưa vào nuôi cấy vàchọn lọc

III.Chọn dòng chịu bệnh:

Mặc dù phương pháp truyền thống có thể tạo được các dòng hoặc giống chịu bệnhnhưng trong một vài trường hợp không thể chọn được các dòng chịu bệnh bằng nhữngphương pháp này hoặc chọn được nhưng tốn nhiều công sức và thời gian Việc gây nhiễmbệnh nhân tạo cho một số lượng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề,ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công Không những thếbằng phương pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùngmột loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai

ngược mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển được các gen lặn hoặc nhiều genmột lúc Đặc biệt đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thựchiện được bằng lai tạo.

Đột biến thực nghiệâm có thể tạo được giống cây chịu bệnh nhưng tần số xuất hiệncác đột biến đơn gen rất thấp (10-4 – 10-6), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tươngđối cao

Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắcphục được nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh như: qui mô thí nghiệm, thời gianchọn lọc, khống chế được điều kiện gây nhiễm Ngoài ra có thể nhận được các đột biếnđơn gen và đột biến lặn Nếu tần số đột biến đơn gen trong trường hợp đột biến thựcnghiệm là 10-4 – 10-6 thì ở quần thể cây tái sinh (Ro) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5%(Larkin & Scowcroft, 1981) Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy

in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981)

Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cầnnghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượnglây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tácnhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh)

Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độctố gây bệnh (ĐTGB)

Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễmlà protoplast Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều vàphân biệt được tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năngphát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard(1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sauđó nuôi vấy và chọn lọc Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum)có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phùhợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus Các tác giả thấy rằng môtừ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinhtrưởng chậm hơn và có màu vàng

Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae

(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,

1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977),

Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.

Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằngphương pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo

từ phôi lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn được các dòng

kháng bệnh Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trongđiều kiện in vitro và nhận được những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986;Joung & cs, 1987) Ngoài ra có thể đưa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất

bị nhiễm nấm, nhưng hướng này chưa được tiến hành nhiều

Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã được dùng nhiều trongchọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có ưu điểm là các tế bào có thể bịnhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thểsử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng Ngoài ra còn có sự tương quan thuận giữakháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo Chọn các dòng kháng ĐTGB đã đượctiến hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng(Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey,1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985) Sử dụng ĐTGBđối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn được các đột biến kháng bệnh hiếm(Carlson, 1973).

Bên cạnh những ưu điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý một sốvấn đề như xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiềutrường hợp cây bị bệnh nhưng không phát hiện có độc tố hoặc xác định được trong cây cóđộc tố gây bệnh nhưng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983).Một vấn đề nữa là trong nhiều trường hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không cókhả năng kháng bệnh Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù cónhững đặc điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhưng nếu ta tái sinh được số lượngcây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mongđợi Điều này đã được khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983) Các tác

giả đã nhận được 10-20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.

ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết ĐTGBthô dưới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn được sử dụng nhiều để chọn dòng chịubệnh Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai

tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng

F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984) Brettel & cs (1980), Rines và Luke

(1985) đã nhận được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae

khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên

Ngoài phương pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tếbào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặcĐTGB, ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thểchọn được dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh Nhiều tác giả (Bretter

& cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòngchịu bệnh theo phương pháp này Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka,1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn vàđưa vào sản xuất Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàngđối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thựctế đã có các giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất nhưng có một số mặt hạn chế củaphương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều

kiện tự nhiên; thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiềukhi chọn được dòng chị bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney &Shepard, 1981).

Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấymô và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấnđề cần giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gâybệnh, liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro.Một vấn đề quan trọng nữa là xác định được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọnlọc in vitro Một số vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rútngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một sốđặc điểm khác Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vàochọn dòng chịu bệnh cũng rất quan trọng Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tếbào có thể áp dụng để chọn dòng chịu bệnh ở các loài cây sinh sản vô tính thì phù hợp vàcó kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990) Ngoài ra nuôi cấy mô và tế bào có thể ápdụng để chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990).Việc sử dụng các ĐTGB không đặc hiệu để chọn các dòng chịu bệnh đặc biệt mà bằngcác phương pháp thông thường không chọn được cũng đã được đề cập (Jones, 1990)

IV.Chọn dòng chống chịu các stress của môi trường

Các stress môi trường bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trường như phèn,chua, mặn, khô, hạn, nóng, lạnh Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu đượccác stress môi trường là rất cần thiết Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đấttrồng bị mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm) 40-60% đất khô hạn.Ngoài ra do việc cải tạo môi trường như tưới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọvà diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với cáctác nhân trên

Như đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp mộtphần trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trường Trước khi giới thiệumột số thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơsở cũng như phương pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trường Ngoài một số vấnđề chung được đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chấtthứ cấp cao, chọn dòng chống chịu stress môi trường còn có một số vấn đề liên quan đến

cơ sở của tính chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh.Đặc biệt là cơ sở di truyềncủa tính chống chịu stress môi trường còn chưa được biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thểcó nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trường, ngoài ra các alen nàythường là lặn nên không thể hiện trong trường hợp dị hợp tử Đây là những vấn đề làmcho việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường chưa có được những thành tựu mongmuốn Ngoài ra một số vấn đề quan trọng nữa là tương quan giữa khả năng chống chịucác stress môi trường ở cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn dòngbằng nuôi cấy mô có thể không tạo được cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên

đồng ruộng Mặc dù có một số vấn đề hết sức quan trọng được nêu ở trên, thực tế vẫn cónhững cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào đểchọn các dòng chống chịu với các stress môi trường: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đagen có thể biến đổi bởi đột biến xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này.Những kết quả nghiên cứu của Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã chothấy tính chống chịu với một số stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyềnqua thế hệ sau Ngoài ra đã có những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các đặcđiểm được chọn lọc (Comner & Meredits, 1985).

Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trường đềuchọn theo phương pháp chọn lọc trực tiếp Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiếnhành khi mô sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển Các stress có thể

ở mức độ thấp hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khitế bào chịu được một nồng độ nào đó lại đưa lên nồng độ cao hơn Việc tiến hành xử lýcó thể liên tục hoặc gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài Cho đến nay chưa cónhững nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng trường hợp trên Tốt nhất tùy từng đốitượng cụ thể mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay cách khác Đây là một vấn đềnghiên cứu về mặt phương pháp nhưng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thànhcông trong việc chọn các dòng chống chịu stress môi trường Muốn nhận những đột biếnmới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc

ở mô đơn bội từ hạt phấn lai F1 có thể nhận được các đột biến đơn gen và các tái tổ hợpcủa các alen sẵn có

Trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể trong việc chọn dòngchống chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã được chọn lọc

từ mô nuôi cấy của các loài Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium,

Ipomoea babatas L (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and

Swartz, 1984) Tính chống chịu trong một vài trường hợp được thông báo là ổn định ởmức độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991) Về cơ chế của tính chịu muối cũngđã có những kết quả đáng ghi nhận Ở Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc láđịa phương chịu muối cũng được tiến hành và đã thu được những kết quả tiến bộ (NguyễnHoàng Lộc & cs, 1990) Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy abscisic axit(ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein vớiphân tử lượng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987) Mối tương quan giữaABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lýthú trong những năm tới Các dòng chịu hạn đã được thông báo (Bressan & cs, 1981,Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đưa vàomôi trường để chọn Vấn đề tạo dòng kháng nhôm được Couner và cs nghiên cứu khá tỉ

mỉ (Conner & Meredith, 1985) Các tác giả đã chọn được các dòng thuốc lá kháng nhômổn định, tính kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau Việc chọn cácdòng chống chịu với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs (1983) đãnhận được các cây cúc chịu được nhiệt độ thấp Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ

trước đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng Những kết

quả của Chen và Gusta (198) nhận được trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và

Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể Các tác giả

cho rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh Orr và cs cũng nhận được nhữngkết quả tương tự về tác dụng của ABA Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quanđến việc tổng hợp hàng loạt các protein mới nhưng vai trò cụ thể của từng loại proteinmới này như thế nào? Chúng có vai trò gì trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao?Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ

Chọn dòng chống chịu stress môi trường là yêu cầu chiến lược trong công tácgiống cây trồng nhưng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm cácphương pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này Những kết quả nhậnđược mới chỉ là những cơ sở hết sức ban đầu Để có được những thành công trong tươnglai và có được những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hướng trên vẫn làđiều quan tâm hàng đầu

V Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao.

Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhưng khôngcó vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trongcây Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quátrình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chấtcó tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hương vị đặc biệt Sự phát triển củakỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹthuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp Hiện nay có nhiềuphòng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thựcvật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp Một trong những yêu cầu của quá trình côngnghiệp hoá tế bào nuôi cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năngsuất cao và ổn định

Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là môhoặc tế bào nuôi cấy dịch lỏng

Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt Đối với các chất thứ cấpkhông có màu trước khi cấy chuyển cần được phân tích Đây là việc làm tốn khá nhiềucông sức và thời gian Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đưa ra phương pháp ép tếbào Theo phương pháp này, các cụm tế bào hoặc mô được ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựatế bào sẽ ngấm vào giấy lọc sau đó dùng phương pháp nhuộm để xác định Đối với mộtsố chất được tế bào tiết ra môi trường thì có thể xác định theo phương pháp dùng màngphủ than hoạt tính để hấp thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoopand Beiderback, 198) Ngoài ra có thể sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chấtkìm hãm sự phát triển của vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra như berberine chẳnghạn (Suzuki & cs, 1987) Các phương pháp khác như phóng xạ hoặc phân biệt tế bào

Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp caothành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôicấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ.Tuy nhiênvai trò của các chất điều hoà sinh trưởng và nồng độ đường đã được ghi nhận Hàm lượngcác chất thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trưởng về sinh khối, tốc độ tổng hợpvà tiết ra môi trường của các chất này.

Thường thường tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chukỳ sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh vàkhông kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp Những tế bào nuôi cấy cótốc độ phân chia chậm thì có ưu thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp

Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề

được nhiều tác giả quan tâm Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có

năng suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suấtthấp Cũng trên đối tượng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năngsuất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao Kết quả này cũng đượccông bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979) Cho đếnnay vẫn chưa có chứng minh chắc chắn về tương quan giữa năng suất của cây làmnguyên liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy Theo Wilson (1990) nên sử dụng nhữngcây đa dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu

Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòngtế bào không ảnh hưởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964) Nhiều tácgiả khác lại nhận được các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhaucủa cây, thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau(Zenk & cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982) Hall và Yeoman (1987) còncho biết trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối vớicác chất màu) cũng khác nhau giữa các tế bào Những sự biến động về tích lũy các chấtthứ cấp này là những cơ sở để tìm các phương pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòngcho năng suất cao

Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tếbào nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhưng cáctế bào riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽkhông ổn định

Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứhai và thứ ba tạo ra các dòng ổn định và không ổn định

Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn chưa sáng tỏ là cơ sở của nhữngthay đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôicấy in vitro Để có được những phương pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chấtthứ cấp cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng