ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Trương Nam Hải TS Đỗ Thị Huyền Hà Nội - Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa tác giả công bố công trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Thảo LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải TS Đỗ Thị Huyền phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thu nhận, hướng dẫn tận tình, quan tâm tạo điều kiện cho hoàn thành luận án Luận án thực phòng Kỹ thuật di truyền Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ đề tài Nghị định thư với Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam kỹ thuật Metagenomics” Trong thời gian học tập nghiên cứu phòng Kỹ thuật di truyền, nhận giúp đỡ bảo tận tình chuyên môn tập thể cán nghiên cứu phòng Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giảng dạy bảo cho kiến thức chuyên môn kỹ cần thiết Để hoàn thành luận án, nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình đồng nghiệp công tác khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu đó! Với tất lòng biết ơn, xin dành cho gia đình, bố mẹ, chồng con, người thân thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua! Nguyễn Thị Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU 14 Tính cấp thiết đề tài 18 Mục tiêu đề tài 20 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 20 Nội dung nghiên cứu 20 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 20 Đóng góp đề tài 20 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 21 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE 21 1.1.1 Cellulose 22 1.1.2 Hemicellulose 23 1.1.3 Lignin 24 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE 24 1.2.1 Cơ chế hoạt động cellulase thủy phân cellulose 24 1.2.2 Cấu trúc cellulase 26 1.2.2.1 Cấu trúc chung cellulase 26 1.2.2.2 Cellulosome thủy phân cellulose 27 1.3 CELLULASE CỦA VI KHUẨN 28 1.3.1 Sơ lược họ cellulase 28 1.3.2 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ 30 1.3.2.1 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ ưa ấm 30 1.3.2.2 Cellulase vi khuẩn vi khuẩn cổ ưa nhiệt 31 1.3.3 Ứng dụng cellulase 31 1.3.3.1 Ứng dụng cellulase công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế biến thực phẩm thức ăn 32 1.3.3.2 Ứng dụng cellulase dệt may 33 1.3.3.3 Ứng dụng cellulase chế biến bột giấy giấy 33 1.3.3.4 Ứng dụng cellulase sản xuất cồn sinh học 34 1.4 MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE 35 1.4.1 Sơ lược mối đa dạng mối Việt Nam 35 1.4.2 Hệ vi sinh vật ruột mối bậc thấp 36 1.4.3 Sự tiêu hóa lignocellulose mối 38 1.4.4 Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase sinh vật đường ruột mối bậc thấp 39 1.5 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS 41 1.5.1 Phương pháp tiếp cận tìm gen Metagenomics 42 1.5.2 Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen 43 1.5.3 Khai thác phân lập gen từ liệu trình tự DNA đa hệ gen 45 1.5.3.1 Phương pháp giải trình tự số hệ thống máy hệ 45 1.5.3.2 Tập hợp read thành contig 47 1.5.4 Ứng dụng Metagenomics 50 1.5.4.1 Ứng dụng Metagenomics khai thác gen đánh giá đa dạng vi sinh vật 50 1.5.4.2 Tiềm ứng dụng Metagenomics 53 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 2.1 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 55 2.1.1 Đối tượng vật liệu 55 2.1.2 Hóa chất thiết bị máy móc 56 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 58 2.2.1 Các phương pháp vi sinh 59 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 59 2.2.2.1 Tách chiết DNA hệ gen mối 59 2.2.2.2 Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối tách chiết DNA đa hệ gen chúng 59 2.2.2.3 Tinh DNA đa hệ gen phương pháp máng đơn (troughing) 60 2.2.2.4 Giải trình tự DNA đa hệ gen máy giải trình tự hệ HiSeq2000 Illumina 61 2.2.2.5 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E coli sốc nhiệt 62 2.2.2.6 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E coli 63 2.2.2.7 Phương pháp cắt ghép nối gen 63 2.2.2.8 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit 64 2.2.2.9 Kỹ thuật PCR 64 2.2.2.10 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen egc 66 2.2.2.11 Điện di DNA gel agarose 66 2.2.2.12 Phương pháp biểu gen 66 2.2.2.13 Điện di biến tính protein gel polyacrylamide-SDS 67 2.2.2.14 Điện di protein gel polyacrylamide không SDS 68 2.2.3 Các phương pháp hóa sinh protein 68 2.2.3.1 Phương pháp tinh chế protein sắc kí lực his-tag 68 2.2.3.2 Định lượng protein phương pháp Bradford 69 2.2.3.3 Định lượng đường khử phương pháp DNS 69 2.2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase 70 2.2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase β-xylosidase 71 2.2.3.6 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ, pH, ion kim loại số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase 72 2.2.3.7 Xác định độ bền enzyme 72 2.2.3.8 Xác định thông số động học enzyme 72 2.2.4 Các phương pháp tin sinh học xử lý số liệu phần mềm sinh học 73 2.2.4.1 Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối 73 2.2.4.2 So sánh trình tự ORF liệu DNA đa hệ gen với CSDL NCBI 74 2.2.4.3 Thiết kế mồi phần mềm FastPCR 75 2.2.4.4 Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gen quan tâm phần mềm trực tuyến RestrictionMapper 75 2.2.4.5 Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin chương trình dịch mã ExPASy 75 2.2.4.6 Xây dựng phát sinh loài loài mối nghiên cứu với loài mối khác phần mềm Genedoc MEGA5 75 2.2.4.7 Dự đoán cấu trúc EGC phần mềm Phyre2 76 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ 77 3.1.1 Tách chiết DNA hệ gen mối 79 3.1.2 PCR khuếch đại đoạn DNA gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối 79 3.1.3 Phân tích sản phẩm PCR 76 3.2 TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN RUỘT MỐI C gestroi 86 3.2.1 Tách chiết tinh DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 86 3.2.2 Đọc phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 87 3.2.2.1 Tập hợp trình tự xác định gen 87 3.2.2.2 Đa dạng vi sinh vật ruột mối C gestroi 90 3.3 GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT MỐI C gestroi 96 3.3.1 Dự đoán chức gen DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 96 3.3.2 Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose 98 3.3.3 Lựa chọn ORF cellulase để biểu 100 3.4 TÁCH DÕNG GEN egc 104 3.4.1 Trình tự ORF GL0130684 105 3.4.2 Khuếch đại gen egc 105 3.4.3 Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng pJET1.2/blunt 106 3.4.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E coli DH10b 107 3.4.5 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế 108 3.4.6 Phân tích trình tự gen wegc phân lập từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C gestroi 108 3.4.7 Khuếch đại gen egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc 111 3.4.8 Thiết kế vector biểu gen egc 111 3.4.8.1 Ghép nối gen egc vào vector biểu 111 3.4.8.2 Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc 113 3.5 BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E coli BL21(DE3) 114 3.5.1 Chọn dòng biểu gen egc tế bào E coli BL21(DE3) 114 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biểu gen egc tế bào E coli BL21(DE3) 116 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến hiệu cảm ứng 117 3.5.4 Điện di kiểm tra hoạt tính endoglucanase EGC 119 3.5.5 Tinh chế protein EGC cột sắc kí lực His-tag 120 3.5.6 Tính đặc hiệu chất EGC 124 3.5.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase EGC 126 3.5.8 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính EGC 127 3.5.9 Độ bền nhiệt EGC 128 3.5.10 Ảnh hưởng số ion kim loại hóa chất lên hoạt tính EGC 128 3.5.11 Đặc điểm động học EGC 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO 138 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt BglB BglF BglG Tên tiếng Anh Beta-glucosidase B Beta-glucosidase F Beta-glucosidase G BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp BSA Base pair Bovine serum albumin BWA Burrows-Wheeler Aligner CD Carbohydrate binding domain Catalytic domain cDNA Complementary DNA CBD Cel12A Cel45A (EGV) Cel48A Cel5A Cel6A (CBHII) Cel6B (EGVI) Cel7A (CBHI) Tên tiếng Việt Beta-glucosidase B Beta-glucosidase F Beta-glucosidase G Công cụ so sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide/axit amin trực tuyến NCBI Cặp base Albumin huyết bò Phần mềm kiểm tra sai lệch nhỏ trình giải trình tự đoạn DNA, trình tập hợp so với hệ gene tham khảo lớn Vùng liên kết với carbohydrate Vùng xúc tác DNA tổng hợp từ khuôn mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Endoglucanase glycoside hydrolase family 12 Endoglucanase glycoside hydrolase family 45 Exoglucanase glycoside hydrolase family Endoglucanase glycoside hydrolase family cellobiohydrolase cel6A (cellobiohydrolase II) Endoglucanase thuộc họ 12 Endoglucanase thuộc họ 45 Exoglucanase thuộc họ 48 Endoglucanase thuộc họ GH Cellobiohydrolase II (exoglucanase II) thuộc họ GH6 Endoglucanase EGVI Endoglucanase thuộc họ GH Cellobiohydrolase cel7A (Cellobiohydrolase I) Cellobiohydrolase I (exoglucanase II) thuộc họ GH7 10