Thiết kế vector biểu hiện con đường sinh tổng hợp provitamin a trong e coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LA VĂN BẢO THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LA VĂN BẢO THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP PROVITAMIN A TRONG E coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 – 2015 Giảng viên : ThS Lƣơng Thị Thu Hƣờng Khoa CNSH-CNTP –Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với cố gắng cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo: Ths Lương Thị Thu Hường, Thầy giáo TS Dương Văn Cường, KS Ma Thị Trang người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài trình hoàn chỉnh luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm chân thành tới gia đình, người, thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tâp, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân trọng cảm ơn! Thái nguyên, tháng năm 2015 Sinh viên La Văn Bảo ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Danh mục thiết bị 19 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI HindIII 24 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt với EcoRI XbaI 24 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng gắn nối 26 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo provitamin A Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa provitamin A thành vitaminA Hình 2.3: Tổng hợp carotenoid phương pháp ngưng tụ Wittig 10 Hình 2.4: Tổng hợp carotenoid bất đối 10 Hình 2.5 Hình thái E coli 13 Hình 3.1 Cấu trúc vector pLUG-crtY 15 Hình 3.2: Cấu trúc vector pR-iEIB 16 Hình 3.3 Cấu tạo vector pET28 16 Hình 3.4 Sơ đồ thiết kế vector biểu đường sinh tổng hợp rovitamin A tảng vevtor pET28 21 Hình 3.5 Cơ chế tượng biến nạp 27 Hình 4.1: Kết cắt plasmid pLUG-crtY mở vòng vector pET28 với EcoRI HindIII 29 Hình 4.2 Kết sàng lọc dòng mang vector pET-Y 30 Hình 4.3 Kết cắt dòng plasmid đồng thời hai Ezyme EcoRI HindIII 31 Hình 4.4: Kết kiểm tra chiều gắn gene crtY vector pET-Y 32 Hình 4.5: Hình minh họa cở sở kiểm tra chiều gắn gene crtY pET-Y 33 Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pET-iEIBY 34 Hình 4.7: Kết điện di kiểm cắt dong plasmid pET-iEIBY XbaI EcoRI 35 Hình 4.8: Kết điện di kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB pET-iEIBY 36 Hình 4.9: Cụm iEIB gắn xuôi chiều 37 Hình 4.10: Biểu pET- iEIBY E coli BL21 38 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ DNA : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acid IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth TAE : Tris-acetate-EDTA X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside cs : cộng v MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.1.1 Provitamin A vai trò provitamin A thực tiễn 2.1.2 Các đường tổng hợp provitamin A 2.2 Tổng quan nghiên cứu nước 14 2.2.1 Tình hình nghiên cứu provitamin A nước 14 2.2.2 Tình hình nghiên cứu provitamin A giới 14 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 15 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.1.3 Hóa chất 17 3.1.4 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 19 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 20 3.3 Nội dung 20 3.3.1 Nội dung 20 3.3.2 Nội dung 20 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 vi PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 kết thiết kế vector biểu mang polycistronic operon chứa gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY tảng vector pET28 28 4.1.1 Kết gắn crtY vào vector pET28 tạo vector tái tổ hợp pET-Y 28 4.1.2 Kết gắn cụm gene iEIB (idi, crtE, crtI, crtB) vào vector pET-Y tạo vector tái tổ hợp pET-iEIBY 34 4.2 Kết đánh giá biểu pET- iEIBY E coli BL21 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Provitamin A (ß-caroten) hợp chất thuộc nhóm carotenoid tiền chất để tổng hợp vitamin A- nhóm sắc tố tự nhiên tổng hợp nhiều nhiều loại thực vật, vi khuẩn, tảo nấm (Das cs, 2007)[7] Trong thực vật, provitamin A tham gia vào trình quang hợp, che chắn ánh sáng, hình thành màu sắc thực vật màu vàng, da cam, đỏ tham gia vào tham gia vào trình hình thành số hormone (Vilchez cs, 2011)[8] Ngoài provitamin A tham gia hình thành màu sắc cho vi sinh vật, chim, côn trùng, cá động vật giáp xác (Takahashi cs, 1998)[9] Ngày người ta tìm thấy 600 chất họ carotenoid, có 20 loại tìm thấy máu người đông vật, tiêu biểu α-caroten, ßcaroten, lycopene, lutein crytoxamthin (Rao and Rao, 2007)[10] Ngoài provitamin A có nhiều tác dụng quan trọng thể người Provitamin A tiền chất vitamin A (Hà Thị Bích Ngọc, 2006)[4], loại vitamin liên quan đến thị lực Ngoài provitamin A có tác dụng chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế phát triển tế bào ung thư, bệnh tim mạch (Paiva and Russell, 1999)[11] Mặc dù provitamin A quan trọng thể người tự tổng hợp loại vitamin mà chủ yếu thông qua đường hấp thụ từ nguồn thức ăn cung cấp từ bên Hiện nay, nhu cầu sử dụng provitamin A ngày gia tăng Nó bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, sản xuất dược phẩm mỹ phẩm (Lee cs, 2003)[12] Ngày nay, có số phương pháp để sản xuất provitamin A, chủ yếu sản xuất phương pháp tổng hợp hóa học, lên men tách chiết từ nguồn có sẵn tự nhiên với quy mô số lượng nhỏ (Johnson cs, 1996)[13], nhược điểm phương pháp phương pháp sản phẩm thu với số lượng ít, không thân thiện với môi trường phải có nguồn nguyên liệu với số lượng lớn Vì vậy, Cần có phương pháp sản xuất ưu việt yêu cầu đặt Cùng với phát triển khoa học công nghệ, nhà khoa học đạt nhiều thành tựu việc sản xuất provitamin A phương pháp sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để tổng hợp provitamin A từ vi sinh vật Quá trình sinh tổng hợp provitamin A gồm có hai đường đường Mevalonate với tiền chất glucose, pyruvate đường Nonmevalonate với tiền chất Acetyl- CoA Cả hai đường dẫn đến hình thành chất isopentenyl diphosphate (IPP) (Slattery cs, 2000)[14] dimethylallyl diphosphate (DMAPP) đồng phân IPP Hai chất hai tiền chất cấu tạo nên tất hợp chất isoprenoid ( Das cs 2007)[7] Sau diễn phản ứng ngưng tụ liên tiếp IPP tạo sản phẩm C30 C40 carotenoid Hiện nay, việc sản xuất hợp chất provitamin A Việt Nam vấn đề mới, nghiên cứu dừng lại việc tách chiết từ thực vật phân lập chủng vi sinh vật sản xuất provitamin A quy mô nhỏ Việc sử dụng hợp chất provitamin A Việt Nam chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, thực đề tài: ‘‘Thiết kế vector biểu đƣờng sinh tổng hợp provitamin A E coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả sản xuất provitamin A tái tổ hợp 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector biểu mang polycistronic operon gồm gene idi, crtE, crtI, crtB crtY mã hóa enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa đường sinh tổng hợp provitamin A tảng vector pET 28 29 Hình 4.1: Kết cắt plasmid pLUG-crtY mở vòng vector pET28 với EcoRI HindIII Đường chạy L : Ladder chuẩn 1kb hãng Thermo Scientific (mã # SM 0311 ) Đường chạy 1: Đối chứng plasmid crtY Đường chạy 2: sản phẩm cắt plasmid crtY Đường chạy 3: sản phẩm cắt plasmid pET28 Đường chạy 4: Đối chứng plasmid pET28 Từ hình 4.1 kết cho thấy đường chạy (sản phẩm cắt plasmid crtY) có xuất hai băng: băng có kích thước 4155 bp tưng ứng với kích thước vector pLUG-crtY băng có kích thước 1161 bp tương ứng 30 với đoạn gene crtY đoạn gene có kích thước mong muốn (đã cắt văng gene crtY) Ở đường chạy số có xuất băng có kích thước khoảng 5369 bp (tương ứng với vector pET28 mở vòng) băng có kích thước mong muốn (đã cắt mở vòng vector pET28) Sau cắt văng gene crtY từ plasmid pLUG-crtY cắt mở vòng vector pET28, tiến hành gắn nối gene crtY vào vector pET28 để tạo vector tái tổ hợp pET-Y, biến nạp vector tái tổ hợp pET-Y vào E coli nuôi khuẩn để tách tiến hành tách chiết DNA plasmid thu kết hình 4.2 Hình 4.2 Kết sàng lọc dòng mang vector pET-Y Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pET28 Đường chạy -> 6: dòng plasmid pET-Y Các dòng plamid 1, 2, 3, 4, 5, 6, có vị trí băng cao so với plasmid vector pET28 Điều chứng tỏ có đoạn chèn vào vector pET28 dòng plasmid tiếp tục sử dụng để tiến hành bước sàng lọc bước với mục đích kiểm tra xem có đoạn chèn crtY vector pET28 hay không kiểm tra chiều gắn đoạn chèn crtY vector pET28 31  Kết chọn lọc dòng plasmid pET-Y phƣơng pháp lập đồ giới hạn Chọn lọc lần hai với dòng plasmid pET-Y phương pháp lập đồ giới hạn, phản ứng cắt đồng thời với hai Enzyme giới hạn EcoRI HindIII Hình 4.3 Kết cắt dòng plasmid đồng thời hai Ezym EcoRI HindIII Đường chạy L : Ladder chuẩn 1kb hãng Thermo Scientific Đường chạy 1: Đối chứng vector pET28 Đường chạy 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm cắt dòng plasmid pET-Y Kết hình 4.3 cho thấy dòng plasmid sau cắt với hai enzyme giới hạn EcoRI HindIII (hai enzyme sử dụng với mục đích cắt văng gene crtY vector pET28 Ở đường chạy 2, 3, 4, 5, 6, có xuất băng: Một băng có kích thước khoảng 1161 bp (tương ứng với kích thước đoạn gene crtY), băng có kích thước khoảng 5369 bp (tương ứng với kích thước vector pET28 mở vòng) 32 Từ kết kết luận có đoạn gene crtY chèn vào vector pET28 Để khẳng định chiều gắn đoạn gene crtY vector pET28, tiến hành thí nghiệm kiểm tra chiều gắn đoạn gene crtY vector pET28  Kiểm tra chiều gắn gene crtY pET-Y Hình 4.4: Kết kiểm tra chiều gắn gene crtY vector pET-Y Đường chạy ĐC : đối chứng plasmid pET-Y Đường chạy L : Ladder chuẩn 1kb hãng Thermo Scientific Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm cắt plasmid pET-Y Kết hình 4.4 cho thấy đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, có xuất băng kích thước khoảng 6387 bp (tương ứng với kích thước vector tái tổ pET-Y mở vòng) Dựa sở vector pET-Y có Enzyme XbaI Enzyme EcoRI gene crtY Khi cắt đồng thời Enzyme xảy trường hợp 33 Hình 4.5: Hình minh họa cở sở kiểm tra chiều gắn gene crtY pET-Y Trƣờng hợp 1: gene crtY gắn xuôi chiều Khi đó, vị trí EcoRI nằm gần vị trí XbaI nên cắt pET-Y đồng thời hai enzyme EcoRI XbaI tạo đoạn: Một đoạn có kích thước 143 bp, đoạn kích thước nhỏ bị chạy gel trình điện di đoạn có kích thước khoảng 6387 bp đoạn mong đợi Trƣờng hợp 2: gene crtY gắn ngƣợc chiều Khi khoảng cách từ vị trí EcoRI XbaI tổng kích thước đoạn gene crtY cộng thêm 143 bp, tức cắt đồng thời Enzyme tạo đoạn: Một đoạn có kích thước khoảng 1161 bp (tương ứng với gene crtY) đoạn có kích thước khoảng 5369 bp (tương ứng với kích thước vector pET28) Dựa theo kết khẳng định: Đoạn gene crtY gắn chiều vector pET-Y 34 4.1.2 Kết gắn cụm gene iEIB (idi, crtE, crtI, crtB) vào vector pET-Y tạo vector tái tổ hợp pET-iEIBY Cụm gene iEIB gắn nối vào vector pET-Y để tạo vector tái tổ hợp pET-iEIBY Biến nạp vector vào E coli nuôi qua đêm 370C lắc 200 vòng/phút Trong tổng số khuẩn lạc thu chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc để tách chiết DNA plasmid Kết thu hình 4.6 Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pET-iEIBY Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pET-Y Đường chạy -> 6: dòng plasmid Kết hình 4.6 cho thấy dòng plamid 1, 2, 3, 4, 5, 6, có vị trí băng cao so với plasmid vector pET-Y (đối chứng) Điều chứng tỏ cụm gene (iEIB) chèn vào vector pET-Y tạo vector pET-iEIBY có mang gene biểu provitamin A dòng plasmid sử dụng để sàng lọc bước 35  Kết chọn lọc dòng plasmid pET-iEIBY phƣơng pháp lập đồ giới hạn Từ dòng plasmid pET-iEIBY tiếp tục sử dụng để tiến hành thí nghiệm cắt với enzyme giới hạn XbaI EcoRI để kiểm tra cụm gene iEIB chèn vào vector pET-Y hay không Dựa sở: Ở hai đầu cụm iEIB thiết kế hai enzyme giới hạn enzyme XbaI (ở đầu gene idi) enym EcoRI (ở cuối gene crtB), enzyme có vị trí vector pET-iEIBY Do cắt đồng thời hai enzyme tạo đoạn: Một đoạn có kích thước gần 3994 bp (tương ứng với cụm gene iEIB) đoạn có kích thước gần 6387 bp (tương ứng với vector pET28 mở vòng) Hình 4.7: Kết điện di kiểm cắt dong plasmid pET-iEIBY XbaI EcoRI Đường chạy L : Ladder chuẩn 1kb hãng Thermo Scientific Đường chạy ĐC: Đối chứng vector pET-iEIB Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm cắt dòng plasmid 36 Kết cho thấy đường chạy 1, 2, 3, 5, có xuất băng: băng kích thước khoảng 6387 bp (tương ứng với vector pET28 mở vòng), băng kích thước khoảng 3994 bp (tương ứng với cụm gene iEIB) Đây vector pET-iEIB theo lý thuyết Đường chạy số có xuất băng có kích thước khác phản ứng cắt không triệt để Như dòng plasmid 1, 2, 3, 5, có gene biểu provitamin A dòng plasmid lựa chọn để tiến hành bước kiểm tra  Kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB pET- iEIBY Hình 4.8: Kết điện di kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB pET-iEIBY Đường chạy L : Ladder chuẩn 1kb hãng Thermo Scientific Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm cắt dòng plasmid pET- iEIBY Kết điện di cho thấy, đường chạy 1, 2, 3, 4, 5, xuất băng: băng có kích thước khoảng 8613 bp băng có kích thước khoảng 1768 bp 37 Để kiểm tra xác việc gắn cụm gene iEIB pET- iEIBY, dòng plasmid 1, 2, 3, 5, tiến hành cắt kiểm tra enzyme giới hạn NcoI NotI dựa sở Cơ sở: Trên Cụm gene iEIB có vị trí nhận biết enzyme NcoI (nằm gene crtB), Trên vector pET28 có vị trí enzyme NotI Khi cắt đồng thời hai enzyme có hai trường hợp xảy Hình 4.9: Cụm iEIB gắn xuôi chiều Trƣờng hợp 1: Cụm gene iEIB gắn xuôi chiều Trên đồ vector, khoảng cách hai vị trí nhận biết enzyme NcoI NotI 1768 bp, nên cắt đồng thời hai enzyme tạo hai băng có kích thước 1768 bp 8613 bp Trƣờng hợp 2: Cụm gene iEIB gắn ngƣợc chiều Khoảng cách hai vị trí nhận biết enzyme NcoI NotI 2370 bp, nên cắt văng hai băng: 4593 bp 5782 bp Từ kết khẳng định: Cụm gene iEIB gắn chiều vector pET- iEIBY 38 Như kết luận thiết kế thành công vector mang gene tổng hợp provitamin A tảng vector pET28 gọi vector pET- iEIBY 4.2 Kết đánh giá biểu pET- iEIBY E coli BL21 Để biểu sản phẩm, dòng plasmid pET- iEIBY chọn dòng để biểu hiện, sử dụng dòng để đánh giá biểu Plasmid dòng số biến nạp vào chủng E coli BL21 Đầu tiên biến nạp pET- iEIBY dòng vào vi khuẩn E coli BL21, sau chọn lọc khuẩn lạc nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung chất cảm ứng IPTG, đồng thời tiến hành thí nghiệm với pET28 (đối chứng) để so sánh biểu thu kết hình 4.10 Hình 4.10: Biểu pET- iEIBY E coli BL21 Ống 1: cặn khuẩn tế bào E coli BL21 mang pET28 Ống 2: cặn khuẩn tế bào E coli BL21 mang pET-iEIBY Kết cho thấy: ống màu vàng đặc trưng provitamin A chứng tỏ gene (cụm gene iEIBY) tổng hợp provitamin A, ống có xuất màu vàng, màu đặc trưng protamin A chứng tỏ ống có đầy đủ gene tổng hợp provitamin A biểu thành công vi khuẩn E coli BL21 (có xuất màu vàng đặc trưng) 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tạo thành công vector biểu pET- iEIBY chứa gene mã hóa cho enzyme xúc tác cho trình sinh tổng hợp provitamin A vi khuẩn E coli tảng vector biểu pET28 Tổ hợp gene biểu chủng vi khuẩn E coli BL21 tạo sinh khối màu vàng đặc trưng provitamin A 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu mức độ biểu cụm gene iEIBY vector khác Biến nạp hệ vector tái tổ hợp vào chủng E coli khác để so sánh lực biểu chủng E coli từ lựa chọn vector biểu provitamin A tối ưu Tiến hành phương pháp định lượng provitamin A để đánh giá khả sinh tổng hợp chủng E coli TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1.Hà Thị Bích Ngọc, T T H N., Nguyễn Văn Mùi (2007) "Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam " Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 130-134(23) 2.Nguyễn Minh Thủy (2005) Giáo trình dinh dưỡng người Đại học Cần Thơ pp 140 Bùi Minh Đức, Nguyễn Công Khẩn, Tu Ngu, Bùi Hoàng Anh, Lâm Xuân Thanh (2003) Tinh thể tự nhiên beta- carotene phân lập từ gấc giàu carotenoid (provitamin A) cho tác phòng, chống thiếu vitamin A Việt Nam Absstract trình bày XXI IVCG Metting Marakech, Moroco 4.Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi, 2006, Điều tra hợp chất carotenoid số thực vật Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa Tự nhiên Công nghệ 5.Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Xuân Vũ, Dương Văn Cường (2011) Tách dòng gene crtI mã hóa cho Phytoene dehydrogenase từ Pantoea ananatis Tạp chí Y học Việt Nam 6.Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Xuân Vũ, Ngô Xuân Bình, Dương Văn Cường (2012) Tạo chủng vi khuẩn E coli có khả sản xuất lycopene Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thông Tài liệu tiếng anh: Das, A., et al (2007) "An update on microbial carotenoid production: application of recent metabolic engineering tools." Appl Microbiol Biotechnol 77(3): 505-512 Vilchez, C., et al (2011) "Marine carotenoids: biological functions and commercial applications." Mar Drugs 9(3): 319-333 Takahashi, S., et al (1998) "A 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase catalyzing the formation of 2-C-methyl-D-erythritol 4phosphate in an alternative nonmevalonate pathway for terpenoid biosynthesis." Proc Natl Acad Sci U S A 95(17): 9879-9884 10 Rao, A V and L G Rao (2007) "Carotenoids and human health." Pharmacol Res 55(3): 207-216 11 Paiva, S A and R M Russell (1999) "Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants." J Am Coll Nutr 18(5): 426-433 12 Lee, P C., et al (2003) "Biosynthesis of structurally novel carotenoids in Escherichia coli." Chem Biol 10(5): 453-462 13 Johnson, E A and W A Schroeder (1996) "Microbial carotenoids." Adv Biochem Eng Biotechnol 53: 119-178 14 Slattery, M L., et al (2000) "Carotenoids and colon cancer." Am J Clin Nutr 71(2): 575-582 15 Britton, G (1995) "Structure and properties of carotenoids in relation to function." FASEB J 9(15): 1551-1558 16 Debjani Dutta, U.R.C.(2005), Structure, health benefits, antioxidant property and processing and storage of carotenoids Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavper University, Kolkata- 700032, India: p 153-155 17 Bertram, J S (1999) "Carotenoids and gene regulation." Nutr Rev 57(6): 182-191 18 Misawa, N., et al (1991) "Production of beta-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora." Appl Environ Microbiol 57(6): 1847-1849 19 Heller, F R., et al (1998) "LDL oxidation: therapeutic perspectives." Atherosclerosis 137 Suppl: S25-31 20 Palozza, P., et al (2008) "The protective role of carotenoids against 7-ketocholesterol formation in solution." Mol Cell Biochem 309(1-2): 61-68 21 Singh, N., et al (1995) "Oxidative stress and heart failure." Molecular and Cellular Biochemistry 147(1): 77-81 22 Dhalla, N S., et al (2000) "Role of oxidative stress in cardiovascular diseases." J Hypertens 18(6): 655-673 23 Reaven, P D., et al (1994) "Susceptibility of human LDL to oxidative modification Effects of variations in beta-carotene concentration and oxygen tension." Arterioscler Thromb 14(7): 1162-1169 24 Gordon, J E and M Schooff (2002) "Can high-dose supplementation with vitamins C and E, beta carotene, and zinc slow the progression of macular degeneration?" J Fam Pract 51(2): 105 25 Ausich, R L (1997) "Commercial opportunities for carotenoid production by biotechnology." Pure and Applied Chemistry 69(10): 2169–2174 26 Del Campo, J A., et al (2000) "Carotenoid content of chlorophycean microalgae: factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp (Chlorophyta)." J Biotechnol 76(1): 51-59 27 Ernst, H (2002) "Recent advances in industrial carotenoid synthesis*." Pure Appl Chem 74(11): 2213–2226 28 Bailey, J (1991) "Toward a science of metabolic engineering." Science 252(5013): 1668-1675 29 Ikeda, M and R Katsumata (1992) "Metabolic Engineering To Produce Tyrosine or Phenylalanine in a Tryptophan-Producing Corynebacterium glutamicum Strain." Appl Environ Microbiol 58(3): 781-785 30 P Lee, C S.-D ( 2002) "Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms." Appl Microbiol Biotechnol 60(1-2): 1-11 31 Yutaka Miura, K K., Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura andNorihiko Misawa* (1998) "Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid." Biotechnology and Bioengineering 58(2-3): 306–308 32 Norihoko Misawa, M N., Kazuo Kobayashi, Shigeyuki Yamano, Yuko Izawa, Katsumi Nakamura, and Keij Harashima (1990) "Elucidation of Pathway the Erwinia uredovora Carotenoid Biosynthetic by Functional Analysis of Gene Products Expressed in Escherichia coli." JOURNAL OF BACTERIOLOGY 59(3): 6704-6712 33 Raman Babu, Natalia Palacios Rojas, Shibin Gao, Jianbing Yan and Kevin Pixley (2012) "Validation of the effects of molecular marker polymorphisms in LcyE and CrtRB1 on provitamin A concentrations for 26 tropical maize populations." International Journal of Plant Breeding Research: 122-012-1987-3 34 Monica A Schmidt1, Wayne A Parrott , David F Hildebrand , R Howard Berg , Amanda Cooksey, Ken Pendarvis , Yonghua He , Fiona McCarthy and Eliot M Herman (2014) "Transgenic soya bean seeds accumulating β-carotene exhibit the collateral enhancements of oleate and protein content traits." Biotechnology Journa: pp 1–11 Plant Biotechnology JournaPlant [...]... 2000)[26] 2.1.2 Các con đường tổng hợp provitamin A 2.1.2.1 Con đường sinh tổng hợp provitamin A trong tự nhiên Trong tự nhiên tất cả carotenoid nói chung và provitamin A nói riêng đều tổng hợp theo con đường ispenoid Sinh tổng hợp carotenoid bắt đầu từ đơn phân isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate Có hai con 9 đường tổng hợp carotenoid đó là con đường mevalonate (MVA) và một con đường tương... pET 28 21 Plasmimid pLUG-crtY Vector pET 28 Đoạn gene crtY Vector pET28 mở vòng Plasmid pRiEIB Cụm gene pR-iEIB pET-Y pET-iEIBY Hình 3.4 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện con đường sinh tổng hợp rovitamin A trên nền tảng vevtor pET28 Để tiến hành thiết kế vector biểu hiện ch a 5 gene (iEIBY) tổng hợp provitamin A Các chủng giống E coli gốc được nuôi cấy, có ch a các vector mang các gene mong muốn sau... IPP và DMAPP qua một phản ứng ngưng tụ ban đầu gi a pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate Tổng hợp carotenoid ở thực vật được diễn ra theo cả hai con đường MVA và MEP 2.1.2.2 Tổng hợp provitamin A bằng con đường h a học Trong 600 carotenoid tự nhiên thì có 8 loại đã được tổng hợp trên quy mô công nghiệp Các carotenoid này bao gồm lycopen, lutein, zeaxanthin, cathanxanthin, astaxanthin, α-caroten, β-cryptoxanthin... Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli chủng biểu hiện và cảm ứng biểu hiện vector tái tổ hợp để sinh tổng hợp provitamin A - Đánh giá sơ bộ khả năng biểu hiện provitamin A c a chủng E coli tái tổ hợp 1.3 Ý ngh a c a đề tài 1.3.1 Ý ngh a khoa học Kết quả c a đề tài tạo ra vật liệu nghiên cứu cho các nghiên cứu về biểu hiện provitamin A trong E coli sau này 1.3.2 Ý ngh a thực tiễn Sản phẩm c a nghiên... gene còn lại (iEIB) để tạo vector pET- iEIBY tái tổ hợp bằng cách: tách chiết DNA plasmid pET-Y và Plasmid pR-iEIB để thu vector pET-Y và vector pR-iEIB, tiến hành cắt 2 vector này bằng 2 ezym giới hạn XbaI và EcoRI để mở vòng vector pET-Y và cắt văng cụm gene iEIB (thu nhận cụm gene iEIB), sau đó tiến hành thôi gel thu nhận các đoạn gene mong muốn, gắn nối cụm gene iEIB vào vector pET-Y để tạo vector. .. chiết DNA plasmid để thu các đoạn gene này Đầu tiên tách chiết DNA plasmid crtY (từ vector pLUGY) và vector pET28, sau đó tiến hành cắt văng gene crtY và cắt mở vòng vector pET28 bằng hai enzyme giới hạn EcoRI và HindIII, sau khi thu được 22 đoạn gene crtY và vector pET28 mở vòng tiến hành thôi gel gắn nối bằng enzyme T4 ligase gene crtY vào vector pET28 tạo vector pET-Y tái tổ hợp Vector pET-Y sẽ... Co.UK 4 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu – 425 – 40 0E – Nuaire – USA 5 Máy đo pH F – 51 BW – Horiba – Japan 6 Nồi hấp khử trùng HV – 110 – Hirayama – Japan 7 Cân điện tử TE 214S – Startorius Germany 8 Máy li tâm Eppendorf – CHLB Đức 9 Tủ lạnh -200C; -800C Super freezer Eco 130 – Ficchetti – Italy 10 Máy votex Vortex Genius 3 – IKA Genmany/ China 11 Máy spindown E- centrifuge – Wealtex – Taiwan/USA 12 Bể ổn... c a gene Cho phép tạo ra số lượng lớn trong E coli Cho phép gắn gene quan tâm Xpress fwd primer Vị trí Base 368-386 Base 3207-3889 Base 158-204 Base 222-240 0RF frame 1 Vị trí khung đọc 1 Base 523- 1023 0RF frame 2 Vị trí khung đọc 2 Base 3995-4810 origin Cho phép tổng hợp DNA Base 3270-3889 3.1.3 H a chất Các h a chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử c a Invitrogen, Fermantas,... tổ hợp pET- iEIBY ch a 5 gene (iEIBY) tổng hợp provitamin A 3.3.3.1 Phương pháp tách chiết DNA plasmid Ba chủng E coli có ch a các plasmid crtY, vector pET 28, Plasmid pRiEIB được nuôi tăng sinh bằng môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin hoặc kanamicin (100µg/ml), lắc 200 vòng /phút trong tủ ấm 37 0C, qua đêm Sau đó tách chiết plasmid bằng phương pháp “Preparation of plasmid DNA by Alkaline... đột biến trong hệ thống s a đổi hạn chế nội sinh (hsdR) hay gây đột biến trong phức hợp mcrA/mcrB/mrr là phức hợp phân giải DNA lạ không được methyl h a một cách chính xác Hệ thống s a đổi DNA được s a đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp Gene recA c a E coli mã h a cho một DNA- dependent- ATPase cần thiết cho sự tái tỏ hợp ở E coli Các chủng E coli dùng để tạo dòng có đột biến recA thông thường thực hiện được