Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá trầu không và diếp cá

Kết quả ảnh hưởng của điều kiện đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E.. Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng khuẩn của

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn: ThS Bùi Tuấn Hà

Thái Nguyên, năm 2015

Em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên, giúp

đỡ trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình

Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy Cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Mông Thị Hương

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi 15 Bảng 2.2: Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng 26 Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng 37 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Trầu không 41 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Trầu không 42 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Trầu không 44 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Diếp cá 47 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Diếp cá 48 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết Diếp cá 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây Trầu không 13 Hình 2.2: Cây Diếp cá 17 Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết Trầu không 42 Hình 4.2: Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng

khuẩn dịch chiết Trầu không 43 Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng

khuẩn dịch chiết Trầu không 45 Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi

sinh vật thử nghiệm 46 Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết Diếp cá 47 Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng khảng khuẩn dịch chiết

Diếp cá 49 Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng

khuẩn của dịch chiết Diếp cá 51 Hình 4.8: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi sinh

vật thử nghiệm 52

DANH MỤC VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Yêu cầu 3

1.4 Ý nghĩa của đề tài 4

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 4

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật 5

2.1.1 Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật 5

2.1.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật 5

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 9

2.2 Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn 9

2.2.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 9

2.2.2 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 11

2.2.3 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 12

2.3 Cơ sở khoa học 13

2.3.1 Tổng quan về Trầu không 13

2.3.2 Tổng quan về các vi sinh vật thử nghiệm 20

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 32

2.4.1 Trầu không 32

2.4.2 Diếp cá 33

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 Vật liệu nghiên cứu 36

3.1.1 Vật liệu 36

3.1.2 Chủng vi sinh vật thử nghiệm 36

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 36

3.1.4 Dụng cụ, thiết bị 37

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 37

3.3 Nội dung nghiên cứu 37

3.4 Phương pháp nghiên cứu 37

3.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 37

3.4.2 Phương pháp chiết 38

3.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết 38

3.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết 38

3.4.5.Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết tới khả năng kháng khuẩn của dịch chiết 39

3.4.6 Phương pháp thử khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm của các loại dịch chiết 39

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không………41

4.1.1 Kết quả ảnh hưởng của điều kiện đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E coli, S aureus, E ictaruli 41

4.1.2 Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E coli, S aureus, E ictaruli 44

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Diếp cá 46

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E coli, S aureus, E ictaruli 46

4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn

dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E coli, S

aureus, E ictaruli 49

PHẦN 5 KẾT LUẬN 53

5.1 Kết luận 53

5.1.1 Dịch chiết Trầu không 53

5.1.2 Dịch chiết Diếp cá 53

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Đất nước ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là một thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc

tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người.Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát triển của các chủng loại cây cỏ, trong đó có không ít loại cây được dùng làm thuốc rất hiệu quả Có những loại thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian

đã được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị bệnh không kém so với các loại thuốc tân dược hiện nay Điển hình là Trầu không và Diếp cá

Trầu không là một loại thân leo, thuộc học hồ tiêu Piperaceae, được trồng nhiều nơi ở nước ta để ăn trầu (lá trầu không, vôi, cau và vỏ cây) Nó còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á như Philipin, Malaisia, Trung Quốc Ngoài công dụng ăn trầu, nhân dân ta còn sử dụng lá Trầu không giã nhỏ, cho thêm vào nước sôi rồi dùng rửa những vết loét, mẩn ngứa, viêm Nước pha Trầu không còn được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, bệnh chàm mặt của trẻ em, có nơi còn dùng chúng để đắp lên ngực chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa tắc sữa ở bà mẹ cho con bú Chúng có được những công dụng như vậy là vì trong thành phần của lá Trầu không ngoài tanin, đường và tinh dầu còn có chứa một hợp chất phenol có tên gọi là chavicol có đặc tính khử trùng rất tốt, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]

Diếp cá dân gian vẫn gọi với những tên gọi phổ biến như giấp cá hay ngư tinh thảo, là một loại cây nhỏ, mọc lâu năm, ưa chỗ ẩm ướt, có thân rễ mọc ngầm dưới đất Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân đứng, có lông hoặc ít lông, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3] Từ xa xưa Diếp cá đã được sử dụng rộng rãi như một loại rau gia vị giúp kích thích tiêu hóa, tăng thêm mùi vị món ăn, tạo cảm giác

ngon miệng Theo Đông y, Diếp cá có vị cay, tính hơi lạnh, giúp thanh nhiệt giải độc cho cơ thể, lợi tiểu và sát trùng Theo Y khoa hiện đại trong thành phần của Diếp cá có chất decanoyl-acetaldehyde mang tính kháng sinh, ngoài

ra nó còn có tác dụng lọc máu, giải độc, kháng viêm, tăng sức miễn dịch cho

cơ thể, [32]

Kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta là vô cùng quý giá, những nghiên cứu Y học gần đây đã chứng minh những cây thuốc mang các chất có tính kháng sinh như trầu không và Diếp cá ở nước ta có tác dụng chữa được nhiều bệnh nhiễm khuẩn, như vậy kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta là

có cơ sở và có kết quả, [32]

Ưu điểm của việc sử dụng các loại thảo dược này trong điều trị bệnh là

an toàn, không có các dụng phụ, không gây ra nhưng tai biến nguy hiểm chết người như các loại thuốc kháng sinh thông thường, sử dụng trong điều trị vết thương làm vết thương mau lành hơn, tuy hiệu quả sử dụng không được cao nhưng chúng khắc phục được những nhược điểm của kháng sinh thông thường như tính kháng thuốc, dị ứng với các thành phần phụ, khi điều trị lâu dài cần phối hợp nhiều loại kháng sinh, ảnh hưởng tới gan, thận và dạ dày Vì vậy xu hướng sử dụng các loại thảo dược trong việc điều trị bệnh hiện nay đang rất được chú trọng và phát triển, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) [6]

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền công nghiệp thì môi trường xung quanh cũng trở nên ô nhiễm, kéo theo đó là sự gia tăng nhiều hơn số

lượng vi khuẩn có hại gây bệnh nguy hiểm cho con người và động vật như E

coli- loại vi khuẩn đường ruột, thường gây ra bệnh tiêu chảy, một số chủng

khác có thể gây ra rối loạn máu, suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong;

Staphylococcus aureus- là một loại tụ cầu khuẩn, kí sinh trên da người, gây ra

các bệnh nhiễm trùng ở da và niêm mạc, tiết ra các độc tố gây ngộ độc thực

phẩm, (Lê Huy Chính, 2001) [4]; Edwardsiella ictalruli- loại vi khuẩn thường

gây các bệnh nhiễm trùng đường máu ở cá tra, là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất và chất lượng loại cá xuất khẩu này của Việt Nam, (Từ Thanh Dung và cs, 2011) [11] Việc tìm ra các kháng sinh để ngăn chặn hoặc hạn chế sự gây hại của chúng đã thành công nhưng với việc sử dụng lâu dài sẽ gây ra tính kháng thuốc ngày càng cao và khó kiểm soát, tiêu biểu như

E coli kháng Ampicillin lên tới 81,4%, vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng Methicillin và các loại kháng sinh liên quan, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho, 2013) [6]

Vì vậy việc nghiên cứu tính kháng khuẩn và tìm ra các hoạt chất kháng khuẩn từ nguồn gốc thực vật là một biện pháp hiệu quả, vừa khắc phục tính kháng thuốc của vi khuẩn, đảm bảo an toàn cho người sử dụng, vừa giảm chi phí trong điều trị, và tận dụng được các dược liệu có sẵn trong tự nhiên

Xuất phát từ những nguyên nhân và thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài với tên gọi : ‘‘Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá Trầu không và Diếp cá’’

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Đưa ra nồng độ thích hợp khi tiến hành tách chiết để ức chế vi khuẩn

- Kết quả nghiên cứu thu được sẽ là nguồn tư liệu bổ sung cho các nhà nghiên cứu các hoạt tính sinh học của thực vật

- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực

tế, củng cố các kiến thức đã học

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sử dụng trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của 2 loại thực vật này

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật

2.1.1 Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật: (Đái Duy Ban, 2008) [2]

- Sulfur (tinh dầu từ củ hành- Allium fistuloseum) có chứa các thành phần là chất kháng sinh allinin, allisufit Có tác dụng lợi tiểu, lợi tiêu hóa, chống viêm, chống thối, chống ung thư Hành thường được dùng chữa cảm lạnh, đau đầu, ngạt mũi, khó tiêu, các bệnh lên men đường tiêu hóa

- Hoạt chất odorin trong cây Hẹ có tác dụng kháng sinh chống khuẩn Ngoài ra trong lá hẹ có hợp chất sulfur, saponi, chất đắng và vitamin C

- Các dẫn xuất naptoquinon trong các cây Bóng nước (Impatines

balsamin Linn.), cây Lá móng (Lawascmia inermis Minn.) có tác dụng điều

trị các vết thương và mụn nhọt

- Các alkaloid có nhân isoquinolein trong các cây Hoằng đằng, Hoàng

bá, Hoàng liên có tác dụng với vi khuẩn hình cầu Gram (+) và Gram (-)

- Các tinh dầu Sả, Quế, Hồi…dùng làm thuốc xông trị cảm cúm và cao dán mụn nhọt

- Các anthraglucosid trong các cây Muồng trâu, Đại hoàng, Chút chít, Hà thủ ô có tác dụng chống nấm gây bệnh hắc lào

2.1.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: (Viện Dược Liệu- Bộ Y Tế) [14]

- Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng không hòa tan với nó

- Mục đích của chiết:

+ Chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của các chất nghiên cứu và đưuọc gọi là chiết làm giàu

+ Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

2.1.2.1 Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:

- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay hơi Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước

- Ưu điểm:

+ Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản

+ Trong quá trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng

tụ từng phần theo thời gian

+ Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng

6-10 giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30phút đến 1 giờ

+ Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử chịu được nhiệt độ cao

-Nhược điểm:

+ Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng tụ + Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân

+ Không có khả năng tách các thành phần bay khó bay hơi trong các thành phần của nguyên liệu

+ Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn

+ Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm những tụ hỗn hợp hơi

2.1.2.2 Tách chiết bằng dung môi:

- Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu

- Yêu cầu của dung môi chiết:

+ Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi

+ Không tương tác hóa học với tinh dầu

+ Có khả năng thu hồi tái sử dụng

+ Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán

+ Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi

+ Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi

lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người

+ Khi bay hơi dung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu

+ Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm

2.1.2.3 Tách chiết bằng soxlet:

Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục

và tiết kiệm dung môi Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14),

diclometan (CH2Cl2), etanol ( C2H5OH)

2.1.2.4 Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi

với vài ba lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm nhiều lần và ngâm nóng Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp tách chiết thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền

2.1.2.5 Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng

cách thường xuyên tác các chất chiết ra khỏi nguyên liệu Phương pháp này thường xuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian

2.1.2.6 Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết

xuất Chiết siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000 Hz Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa 2 pha bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp

2.1.2.7 Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là

hướng di chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của dung môi Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo

2.1.2.8 Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại

dung môi hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước ở trạng thái siêu tới hạn (3740

C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ 2 pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết, có màu sắc,

hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: (Viện Dược Liệu- Bộ Y Tế) [14]

- Những yếu tố thuộc về dung môi: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

- Những yếu tố thuộc về kỹ thuật: nhiệt độ, thời gian, độ mịn, sự khuấy trộn…

2.2 Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn

2.2.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory Concentration) (LakshmiArabewela và cs, 2010) [24], [31]

- Khái niệm: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC là nồng độ thấp nhất của

một chất kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24h nuôi cấy

- Các bước tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch kháng sinh:

- Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch mẹ)

- Dựa vào hoạt lực của kháng sinh (ghi trên nhãn lọ) để tính nồng độ dung dịch mẹ cần pha Khối lượng kháng sinh có hoạt lực a% cần để pha 10ml dung dịch mẹ nồng độ 5120 µg/ml được tính theo công thức: X(g)= (10ml×5120×100)/ a

- Kháng sinh bột phải pha với dung môi thích hợp Cho một lượng dung môi vừa đủ để hòa tan hoàn kháng sinh, bồi phụ đủ thể tích bằng dung môi hoà tan

- Từ dung dịch mẹ, pha dung dịch gốc cần dùng bằng đệm PBS

- Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ thấp nhất cần dùng

Dung dịch mẹ sau khi pha có thể chia nhỏ ra các tube, bảo quản ở

-200C Khi cần lấy ra làm tan băng và dùng trong ngày, lượng thừa sẽ bỏ đi

- Các ống chứa dung dịch kháng sinh cần dùng được bảo quản ở 40C và dùng trong ngày

Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn hợp vi khuẩn:

- Vi khuẩn sau khi được hoạt hóa trong môi trường lỏng 24 giờ được mang ra so với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có vạch kẻ đen Lưu ý cần phải trộn đều vi khuẩn trước khi sử dụng

- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland có thể điều chỉnh bằng cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn

đó đặt nhẹ nhàng (không để chân đinh ấn sâu vào thạch), chính xác (chỉ đặt 1 lần, không di chuyển) lên đĩa thạch MH không có kháng sinh Tiếp tục chấm và đặt lên các đĩa thạch đã có sẵn kháng sinh từ nồng độ thấp đến nồng độ cao

Cuối cùng trước khi kết thúc, chấm vào đĩa thạch MH không có kháng sinh một lần nữa để làm chứng

- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho khô

- Lộn ngược các đĩa và ủ ấm ở 370C trong vòng 18-20 giờ

Đọc kết quả:

- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc

- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng mẫu trên một tờ giấy

- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận

là nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó

- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới kháng để phân biệt thành 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I) hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R)

2.2.2 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán

- Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoang giấy khuếch tán vào thạch

MH có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn xung quang giấy kháng sinh

- Các bước tiến hành:

Các bước chuẩn bị đĩa thạch, chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn hợp chủng

vi khuẩn tư tự như phương pháp MIC

Láng vi khuẩn trên mặt thạch:

- Sử dụng huyền dịch với nồng độ trên, láng đều trên mặt thạch

- Hút huyền dịch thừa bỏ đi

- Để khô đĩa thạch đặt trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt giấy kháng sinh

Đặt khoanh giấy kháng sinh:

- Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ ấm, không được

mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoang giấy kháng sinh

- Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn trên mặt thạch

- Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensinh apparatus), dụng

cụ này phải được đóng nắp thật chặt, cất trở lại tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

- Không nên đặt quá 6 khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch 90mm

- Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thế gây sai sót khi đo vòng ức chế

- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho các kháng sinh giấy kháng sinh khuếch tán trên mặt thạch

- Đặt trong tủ ấm 370C trong vòng 20-24 giờ

2.2.3 Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

-Nguyên lý: Kháng sinh được bơm vào các giếng thạch MH đã được

đục lỗ có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi

khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn xung quang các giếng thạch có chứa kháng sinh

- Các bước tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp trên, chỉ khác ở

bước đục lỗ trên đĩa thạch như sau: Vi khuẩn sau khi được láng trên bề mặt thạch, tiến hành đục lỗ trên bề mặt tạo các giếng thạch, các chất kháng sinh sẽ được bơm vào để thử nghiệm tính nhạy cảm, để yên trong 30 phút, đặt trong

tủ ấm 24 giờ và quan sát vòng vô khuẩn

2.3 Cơ sở khoa học

2.3.1 Tổng quan về Trầu không

- Vị trí phân loại thực vật, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]: Trầu không còn có tên gọi khác là cây trầu, trầu cay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia), hruê ê ang ( Buôn Mê Thuật)

- Mô tả: Trầu không là một cây mọc leo, thân nhẵn Lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1,5-3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10-13cm, rộng 4,5-9cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy rất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường 5 Hoa khác gốc mọc thành bông có cuống dài bằng cuống lá, mọc đối diện với lá, hoa đơn tính Bông đực dài bằng phiến lá, trục bông phủ lông, lá bắc không cuống, không

có lông, hình tròn hoặc hình trứng ngược Nhị 2, bao phấn hình bầu dục, chỉ nhị ngắn Bông cái ngắn hơn, trục phủ lông (Võ Văn Chi, 2007) [17] Quả mọng, lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh.Toàn cây có mùi thơm cay

- Phân bố và thu hái: Cây trầu được trồng khắp nơi ở nước ta để lấy lá

ăn trầu Chúng còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á , vùng nhiệt đới như Indonexia, Philipin, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3] Ở Việt Nam có 2 loại trầu chính

là trầu mỡ và trầu quế Lá trầu mỡ to bản, dễ trồng Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta làm giàn cho nó leo Cây trồng không ưa ẩm và chất vôi, nên người ta thường trồng sát tường, cạnh bể nước để thuận tiện cho việc tưới

và bón thêm vôi cũ Lá được hái thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô,

có khi tán bột dùng dần, (Võ Văn Chi, 2004) [16]

- Thành phần hóa học: Theo phân tích dinh dưỡng, cứ 100 gr lá Trầu không thì có đến 85,4 % độ ẩm, 3,1% protein, 0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1% carbohydrat Hàm lượng khoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, carotene, thiamin, riboflavin, niacin và vitamin C, (Võ Văn Chi, 2004) [16]

Thành phần quan trọng nhất là tinh dầu : Chứa 0,8-1,8% có khi tới 2,4% các thành phần của lá trầu, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3] Theo Phạm Thế Chính và các cs(2010) [7], tinh dầu lá trầu có chứa các hợp chất như là

eugenol, eugeny acetat, chavicol và diacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao, tỷ trọng và chiết suất cao

Bảng 2.1: Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi

0,63-0,89mg/100g Iod Tinh dầu 0,08-0,2%

Ít dùng trong, chỉ hay dùng ngoài, liều lượng tùy tiện Có nơi còn giã lá trầu

không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa bệnh tắc sữa (Võ Văn Chi, 2004) [16]

Trầu không còn có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các vi trùng:

Tụ cầu, Subtilit và trực trùng E.coli (Y học tạp chí, 2011) [19]

- Một số bài thuốc dân gian từ Trầu không, (Võ Văn Chi, 2007) [17]: + Đau họng: Khi đau họng, dùng Trầu không sẽ rất có công hiệu Lấy

lá trầu không và ít hoa quả xay nhuyễn lấy nước trộn thêm mật ong rồi ngậm thật lâu, nếu uống được thì càng tốt, sẽ giảm các kích thích gây ho

+ Bỏng nước sôi: Lá Trầu hơ nhẹ để lá mềm ra rồi phết 1 lớp thầu dầu rồi đặt nhẹ lên vết bỏng Cứ sau vài giờ lại thay 1 lá trầu mới Sau vài lần, dịch trong vết bỏng sẽ tiêu hết, chỗ rộp không mọng nước, không gây mủ Nên dùng vào ban đêm và vứt đi vào sáng sớm

+ Chữa đau mắt đỏ (viêm kết mạc): Lấy 3 lá Trầu không, 5-10 lá dâu

vò nát, cho vào ca, đổ ngập nước sôi để xông hơi con mắt đau Xông mỗi lần 5-10 phút, ngày 2 lần Thuốc giúp chóng hết viêm, mắt dịu

+ Rửa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá Trầu không và phèn đen mỗi thứ 20g vò nát hoặc giã nát, đổ 1,5 lít nước, sắc lấy 1 lít, rửa tại chỗ ngày 1 lần

+ Ngoài ra Trầu không còn có tác dụng tăng sinh lực, làm sạch răng và làm ngọt miệng

2.3.2.3 Tổng quan về Diếp cá

- Vị trí phân loại thực vật: Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb Saururaceae,

để tôn vinh Marteen Houttuyn là thầy thuốc nhà thực vật học Hà Lan, chuyên

về Rêu và Quyết thực vật, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]

Hệ thống phân loại, (Võ Văn Chi, 2004) [16]:

- Mô tả: cây Diếp cá là cây thuộc thân thảo, cao 20-40cm, ưa chỗ ẩm

ướt, có thân màu lục hay tía đỏ Rễ mọc ngầm dưới đất, rễ nhỏ mọc ở các đốt

Lá mọc so le, có bẹ; phiến là hình tim, khi vò ra có mùi tanh của cá Hoa nhỏ,

nở vào tháng 5-8, không có bao hoa, màu vàng nhạt, mọc thành bông Quả

nang mở ở đỉnh, hạt hình trứng hoặc trái xoan, nhẵn, (Dược Điển Việt Nam,

2002)[1], (Võ Văn Chi, 2004) [16]

- Phân bố và thu hái: Diếp cá có nguồn gốc ở Hymalaya và phân bố cả

ở Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Campuchia và Việt Nam Ở nước ta, Diếp cá phổ biến ở trạng thái hoang dại ở những nơi ẩm ướt, trên các bãi hoang, bờ ruộng…và cũng được trồng lấy lá ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác,

(Dược Học Cổ Truyền, 2006) [18]

- Thành phần hóa học:

Trong Diếp cá có khoảng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ankaloid gọi

là cordalin Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton

CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), chất myrcen C10H46, axit caprinic C9

H19COOH và laurinaldehyde Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7% ( Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]

Thành phần hóa học trong Diếp cá gồm có : flavonoid, tinh dầu, alkaloid

và một số thành phần khác, (Hoàng Văn Tuấn và cs, 2013) [5], (Jiangang Fu

và cs, 2013) [22]

- Flavonoid: Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú Các flavonoid đáng chú ý trong Diếp cá có thể kể đến như quercetin, quercitrin, isoquercitrin Ngoài ra còn một số flavonid khác cũng không kém phần quan trọng

- Tinh dầu: Thành phần chủ yếu của tinh dầu Diếp cá là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như methyl-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá khi vò có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen, limone, limone, linalol, bornyl aceta, geranilo và caryophenylen Ngoài ra tinh dầu còn chứa acid caprinic, lauryl aldehyde, benzamid, acid hexadecannoic, acid decanoic, acid palmitic, acid lionleic, acid oleic, acid stearic…

- Alkaloid: Một số alkaloid có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong cây Diếp cá là aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion A, cepharadion B, splendidin

- Axit hữu cơ và axit béo: Trong Diếp cá có chứa các loại axit như axit palmitic, axit stearic, axita heptanoic, axit nonanoic, axit aspartic, axit glutamic, axit capric…

- Axit amin và các nguyên tố vi lượng: Diếp cá có chứa hơn 20 axit amin, trong đó có alanin, valin, lysine, cystein… và các nguyên tố vi lượng khác như Fe,

Mg, Mn, Mg, Zn, đây là những khoáng chất rất cần thiết cho cơ thể

- Thành phần khác: Nước 91,5%, protid 2,99%, lipid 0,5%, cellilose

1,8%, dẫn xuất không protein 2,2% và các khoáng chất toàn phần, (Dược

Điển Việt Nam, 2002) [1]

- Công dụng, (Jiangang Fu và cs (2013), [22]:

+ Tác dụng kháng khuẩn : Diếp cá có tác dụng ngăn cản sự sinh sản của

các vi khuẩn Steptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

subtilis, Vibrio parahaemolyticus và E.coli Ngoài ra chúng còn có khả năng

diệt được Gonococuc (gây bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các

+ Tác dụng trên hệ miễn nhiễm : Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp

cá có khả năng làm tính thực bào của các tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng của hệ miễn dịch chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh do siêu vi trùng

+ Tác dụng lợi tiểu: Tác dụng này có thể là do liên quan đến các chất quercitrin, isoquercitrin và muối kali trong cây Diếp cá

+ Tác dụng trên hệ hô hấp: Khi chích dung dịch nước Diếp cá qua màng phúc mô thỏ tác dụng hạ ho được nhận thấy rõ rệt Khả năng trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp của Diếp cá cũng đã được chứng minh rõ ràng Khi dùng

liều cao (60g) để trị bệnh sưng phổi có ung nhọt, kết quả rất tốt, ung nhọt biến mất và không để lại di chứng sau 2 tuần điều trị

+ Tác dụng chống oxy hóa : Diếp cá có chứa hợp chất flavonoid có tác dụng đối với sự peroxy hóa lipid màng tế bào gan bằng cách hạn chế quá trình peroxy góp phần bảo vệ tế bào và duy trì sự hoạt động bình thường của tế bào + Tác dụng kháng tế bào ung thư : Dịch chiết Diếp cá có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa và đột biến gen Nồng độ polyphenol trong dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol, và khả năng kháng đột biến gen của dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol Các alkaloid được tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp cá có tác dụng chống lại 5 dòng tế bào u ở người

- Một số bài thuốc dân gian từ Diếp cá: (Dược Điển Việt Nam, 2002) [1]

+Trị mụn nhọt sưng đỏ (chưa có mủ) : 12g Diếp cá, rửa sạch, giã nát đắp vào mụn nhọt rồi băng lại Ngày thực hiện 2 lần Làm trong 3 ngày, mụn nhọt

sẽ đỡ sưng đau nhanh chóng

+ Chữa đau mắt đỏ do trực khuẩn mủ xanh : 35g Diếp cá, rửa sạch, tráng qua nước đun sôi để nguội, để ráo nước, rồi giã nát, ép vào 2 miếng gạch sạch, đắp lêm mắt sưng đau khi đi ngủ Thực hiện trong 3 ngày

+ Trị chứng đái buốt, đái dắt : 20g Diếp cá, rau má, rau mã đề mỗi vị 40g rửa sạch, giã nát lấy nước trong Ngày uống 3 lần Thực hiện trong 7-10 ngày

2.3.2 Tổng quan về các vi sinh vật thử nghiệm

2.3.2.1 Tổng quan về E coli (Lê Huy Chính, 2001) [4]

Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885 Giống này

có nhiều loài, trong đó E coli có vai trò quan trọng nhất

*Đặc điểm sinh học:

E coli là trực khuẩn Gram âm, có vỏ hoặc không có vỏ, hầu hết đều có

lông Phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường; hiếu kỵ

khí tùy tiện Lên men nhiều loại đường và sinh hơi; các E.coli đều lên men

lactose và sinh hơi (trừ EIEC); indol (+), H2S (-), Simmons và uraese (-)

E coli có cả 3 nhóm kháng nguyên: kháng nguyên O gồm 160 yếu tố

kháng nguyên; kháng nguyên K được chia thành 3 loại: A, B và L; kháng

nguyên H gồm hơn 50 yếu tố Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E coli được

chia thành các type huyết thanh Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên

sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau, mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7

Dựa vào tính chất gây bệnh, E coli được chia thành các loại:

EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E coli): E coli sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xâm nhập đường ruột

EAEC (Enteroadherent E coli): E coli bám dính đường ruột

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E coli gây chảy máu đường ruột

*Khả năng và cơ chế gây bệnh:

Trong đường tiêu hóa, E coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí Nhưng E coli cũng là vi khuẩn gây bênh quan trọng, nó đứng đầu trong các

vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu

trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết E coli có thể gây nhiều bệnh

khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương

- Cơ chế gây bệnh của E coli khác nhau tùy loại:

+ ETEC: Gây bệnh do ngoại độc tố LT, là loại độc tố ruột giống độc tố

ruột của V.choleae

+ EAEC: Gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột, cơ chế chưa sáng tỏ

+ EHEC: Cơ chế cũng chưa hoàn toàn rõ, nhưng người ta đã xác định được một loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống với

ngoại độc tố của S shiga Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương

xuất huyết ở ruột

+ EPEC: Cơ chế gây bệnh chưa được biết rõ

*Chẩn đoán vi sinh vật:

Chẩn đoán trực tiếp: Bệnh phẩm khác nhau tùy bệnh: là phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu, máu nếu là nhiễm khuẩn máu Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não soi tủy Phương pháp chẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập

2.3.2.2 Tổng quan về Staphylococus aureus (Lê Huy Chính, 2001) [4]

*Đặc điểm sinh học:

- Hình dạng và kích thước: Staphylococus aureus (còn gọi là tụ cầu

vàng) là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8-1,0μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ

- Nuôi cấy: Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt

độ 10 - 450

C Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí

+ Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 370C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh

+ Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin): μ,β,δ,ε,γ

+ Trên môi trường canh thang: Tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu

nó có thể lắng cặn

- Khả năng đề kháng: Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ

và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác Nó bị diệt ở 800C trong 1 giờ (các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ

tối đa (450C) mà vi khuẩn có thể phát triển Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian tồn tại ở môi trường

- Sự kháng kháng sinh: Đa số tụ cầu vàng kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid Một số

còn kháng được methicillin resistance S.aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo

ra được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ Kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin

*Tính chất sinh vật hóa học: Tụ cầu có hệ thống enzym phong phú, những

enzyme được dùng trong chẩn đoán là:

- Coagulase có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi đã

được chống đông Đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu khác Coagulase có ở tất cả các chủng tụ cầu vàng Hoạt động của coagulase giống như thrombokiase tạo thành một “áo fibrinogen” trong huyết tương

Coagulase có 2 loại: Một loại tiết ra môi trường- gọi là coagulase tự do

và một loại bám vào vách tế bào- gọi là coagulase cố định

- Catalase dương tính Enzyme này xúc tác gây phân giải H2O2 => O + H2O catalase có ở tất cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu

- Lên men đường mannitol

- Desoxyribpnuclese là enzyme phân giải DNA

mạc mũi Acid này gắn vào polysaccharid vách tụ cầu vàng Đây là thành phần đặc hiệu của kháng nguyên O

+ Protein A: Là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu chuẩn để xác định tụ cầu vàng 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này Sở dĩ kháng nguyên này mang tên protein A, vì protein này gắn được phần Fc của IgG Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi opsonin hóa (opsonisation), nên làm giảm thực bào

+ Vỏ polysaccharid: Một số ít chủng S aureus có vỏ và có thể quan sát được

bằng phương pháp nhuộm vỏ Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học

+ Kháng nguyên adherin (yếu tố bám)

+ Giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào Adherin có thể là các protein: laminin, fibronectin, collagen

- Phân loại bằng phage (phage typing): Các phương pháp phân loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó khăn, vì vậy việc phân loại tụ cầu vàng là chủ yếu dựa trên phage Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính

đặc hiệu rất cao Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại S

aureus, vì đây là vi khuẩn gây nhiễm trung nhiều nhất trên người

*Độc tố và các yếu tố độc lực:

- Độc tố ruột (enterotoxin): Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không phải là tất cả mọi chủng: đây là những protein tương đối chịu nhiệt, nên không bị hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử 28000-30000 dalton và bao gồm 6 type được ký hiệu từ A-F Về miễn dịch, 6 type này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có kháng nguyên chéo Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II Xác định enterotoxin bằng các kỹ thuật miễn dịch

- Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndromme toxin- TSST): Độc tố gây shock nhiễm độc thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương Độc tố này khó phân biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor necrosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I, II

Cơ chế gây shock của nó tương tự như của nội độc tố

- Exfoliatin toxin hay epidermolytic toxin: Đây là một ngoại độc tố Nó gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da ( Scaded skin syndrome) ở trẻ em Hội chứng này đã được biết khá lâu, nhưng mãi đến năm 1971 người ta mới biết đến exfoliatin Độc tố này được tạo bởi gen của 85% các chủng tụ cầu vàng thuộc loại phage nhóm II

- Alphatoxin: Độc tố này gây tan các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ đó gây ra các ổ áp xe, gây ra hoại tử da và tan máu Alphatoxin là một protein là một protein trọng lượng phân tử 33000-36000 dalton Nó gắn trên màng tế bào và thể hiện các thuộc tính hoạt động bề mặt Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không có tác dụng chống nhiễm khuẩn

- Độc tố bạch cầu (Leucocidin): Mặc dù một số staphylosyn chứa độc

tố bạch cầu, nhưng chỉ một độc tố tụ cầu thực sự độc với bạch cầu và được coi là leucocidin Độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ và không gây độc cho bạch cầu các loại động vật khác Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏ Leucocidin bao gồm 2 mảnh F và S và có thể tách rời bằng sắc ký in, trọng lượng phân tử là 32000 và 38000 dalton Nếu tách rời 2 mảng này thì mất tác dụng gây độc

- Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): Vào 1979, Schlivent và cộng sự đã tách biệt được một độc tố từ tụ cầu vàng Về nhiều phương diện, độc tố này tương tự độc tố sinh mủ của liên cầu Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyt, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về

một số phương diện đối với nội độc tố như gây shock và hoại tử gan và cơ tim Sau đó, người ta đã phân biệt được 3 loại ngoại độc tố sinh mủ, ký kiệu

là A, B, C Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử (theo thứ tự: 1200,

1800 và 22000 dalton) về tính đặc hiệu kháng nguyên nhưng giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào

- Dung huyết tố (hemolysin còn gọi là staphylokysin): Tụ cầu vàng sinh

ra 4 loại hemlysin có các tính chất khác nhau:

Bảng 2.2: Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng

Loại hồng cầu

nhạy cảm

Loại bạch cầu nhạy cảm

Nguồn gốc

vi khuẩn

Tác động trên động vật thí

nghiệm

Thỏ, cừu Thỏ, người Người

Gây hoại tử da thỏ, gây chết chuột và thỏ, gây độc tế bào nuôi cấy

Cừu, người, bò Không Động vật Liều cao gây chết thỏ, hoại tử

từng đám tế bào nuôi cấy Thỏ, người, cừu,

chuột, bò, ngựa Người Hoại tử nhẹ da thỏ và da

chuột, gây chết thỏ Người, thỏ, ngựa,

cừu, chuột

Thỏ, người,

Làm xơ cứng da thỏ và da chuột, gây hoại tử tế bào nuôi cấy

- Coagulase: Có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi

đã được chống đông

- Hyaluronidase: Là enzyme phân giải các aicd hyaluroic của mô liên kết, giúp vi khuẩn lan tràn vào mô

*Khả năng gây bệnh: Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở

da Vi khuẩn này gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có

nhiều yếu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau

- Nhiễm khuẩn ngoài da: Do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ

áp xe, eczema, hậu bối…Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp

ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch

- Nhiễm khuẩn huyết: Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đấy vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn huyết, tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên ổ áp xe (gan, phôi, não, tủy xương ) hoặc viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các vêm tắc tĩnh mạch Một

số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương…

- Viêm phổi: Viêm phổi do tụ cầu vàng ít gặp Nó chỉ xảy ra sau viêm đường hô hấp do virus (như cúm) hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng

có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng, ở trẻ em hoặc những người suy yếu Tỷ

lệ tử vong của bệnh này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nặng

- Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Ngộ độc thức ăn do phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về

số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh

có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến

8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới shock

- Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu: Rất thường gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng…từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn huyết Các chủng

tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng tới vancomycin Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao

- Miễn dịch dịch thể cũng xuất hiện để chống lại các yếu tố độc lực (độc

tố và enzyme) Nhưng nó không có vai trò bảo vệ có ý nghĩa Vì tụ cầu ít tiếp xúc với kháng thể hoặc tế bào sản xuất kháng thể Do vi khuẩn này thường ẩn trú trong các ổ áp xe, trong các cục fibrin và trong các tế bào bạch cầu Như vậy miễn dịch tích cực chống nhiễm tụ cầu ít có vai trò bảo vệ

*Chẩn đoán vi khuẩn học:

Phân lập xác định tụ cầu là việc cần thực hiện và không mấy khó khăn Bệnh phẩm là máu, mủ, phân…tùy theo loại bệnh của tụ cầu Thạch máu là môi trường thích hợp để phân lập Tụ cầu phát triển rất tốt trên môi trường này Có thể sử dụng môi trường lựa chọn chứa 7,5% NaCl, đường mannitol

và có thể có cả kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm, khi bệnh phẩm có nhiều loại vi khuẩn Sau đó xác định các tính chất:

- Khuẩn lạc S và màng vàng nhẹ

- Cầu khuẩn Gram dương, đứng thành hình chùm nho

- Coagulase dương tính

vệ sinh môi trường bệnh viện để chống nhiễm khuẩn bệnh viện

- Điều trị: Kháng sinh trị liệu là biện pháp chủ yếu Vấn đề khó khăn là

tụ cầu rất kháng thuốc, nên cần phải làm kháng sinh đồ để chọn lọc thuốc thích hợp Dùng vacxin gây miễn dịch chống tụ cầu vàng cũng là một biện pháp cần thiết ở những bệnh nhân dùng kháng sinh ít kết quả Đây là những vacxin chết và có thể được bào chế từ chủng tụ cầu vàng phân lập được ở chính bệnh nhân đó (gọi là vacxin tự liệu), hoặc dùng các chủng tụ cầu vàng mẫu, là những chủng thường gặp (gọi là vacxin trị liệu)

2.3.2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaruli (Phạm thị Ngọc Xuân,

2010),[8], (Từ Thanh Dung và cs, 2009) [11]

*Đặc điểm:

Vi khuẩn E ictaruli được mô tả bởi Hawke (1981) là một loài đặc

trưng thuộc nhóm Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,75×1,5-2,5μm, di động yếu ở 25-300C, không di động ở nhiệt độ cao, lên men glucose, không sinh oxi hóa, phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxidase, phát triển tốt ở 280C và phát triển yếu ở 370C (Từ Thanh Dung và cs, 2004)[11] Từ Thanh Dung và cs (2004)[11] vi khuẩn

có thể phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận) trên mô trường TSA(Trytone Soya Agar) hoặc NA (Nutrent Agar) sau 38 giờ ở 280C tạo thành khuẩn lạc màu

trắng đục Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn E ictaruli cho hầu hết phản ứng âm