Đánh giá ảnh hưởng của trọng lực đến sự phát triển của phôi cá

Phôi cá ngựa vằn tên khoa học là Danio rerio là một mô hình đánh giá ngày càng phổ biến với nhiều đặc tính ưu việt như dễ dàng quan sát sự phát triển bởi phôi cá ngựa vằn trong

Đề tài:

Đánh giá ảnh hưởng của trọng lực đến sự

phát triển của phôi cá.

GV hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Lai Thành Thạc sỹ Trần Văn Tuấn.

Nhóm 9:

1 Lê Đình Tú

2 Nguyễn Thị Phượng

3 Nguyễn Thị Loan

4 Phan Thị Gấm

5 Vũ Đăng Hưng

6 Nguyễn Tiến Thắng

7 Nhữ Văn Hùng

8 Lê Thị Quỳnh Giang

Sinh học phát triển- Developmental Biology

- -Hà Nội - 2016

PHẦN I: TỔNG QUAN

I.1 Giới thiệu về cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn hay còn gọi là cá ngựa đuôi hổ (Tiger tail seahorse) phân bố chủ yếu

ở vùng biển nhiệt đới (Philippines, Malaysia, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam) (Lourie và cs., 1999) thường gặp ở độ sâu 5 -10m, ít khi gặp ở độ sâu 20m

(Morgan và Lourie, 2006) Ở Việt Nam, chúng chỉ mới phát hiện ở vùng biển

Khánh Hòa và Phú Yên, những nơi có rạn san hô phân bố Phương tiện khai thác chủ yếu là lặn bắt hoặc đánh lưới giã cào Đây là loài cá quí hiếm có giá trị kinh tế cao và nằm trong danh mục CITES (Convention on International Trade of

Endangerous Species), phụ lục II Bộ gen cá Ngựa vằn có độ tương đồng cao với bộ gen người; có nhiều tế bào, đặc điểm giải phẫu và sinh lí với các động vật có xương sống khác Bên cạnh đó, chúng có kích thước nhỏ, phát triển nhanh và vòng đời ngắn nên rất lí tưởng cho các mô hình đánh giá Đặc biệt, cá cái mỗi lần đẻ cho

số lượng phôi lớn và phôi được bao bọc trong lớp vỏ trong suốt, dễ quan sát

Phôi cá ngựa vằn (tên khoa học là Danio rerio) là một mô hình đánh giá ngày

càng phổ biến với nhiều đặc tính ưu việt như dễ dàng quan sát sự phát triển bởi phôi

cá ngựa vằn trong suốt, có thể quan sát được những biến đổi về hình thái bên trong,

số lượng phôi lớn và có thể chủ động, quá trình phát triển phôi sớm Hơn nữa phương pháp nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn sẽ giúp tiết kiệm nhiều thời gian, chi phí và không vấp phải các vấn đề đạo đức

I.2 Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn.

Quá trình phát triển của phôi được chia thành các giai đoạn :

- Giai đoạn hợp tử 1 tế bào: ( 0h-3/4h )

- Giai đoạn phân cắt: ( 3/4h – 21/4 h)

- Giai đoạn phôi nang: (21/4 h - 51/4 h )

- Giai đoạn phôi vị: (51/4h – 10h )

- Giai đoạn phân đốt: ( 10h-24h)

- Giai đoạn hình thành các đặc điểm của ngành: ( 24h-48h )

- Giai đoạn nở: ( 48h-72h )

- Giai đoạn ấu trùng sớm

Hình 1: Các giai đoạn quá trình phát triển phôi cá ngựa vằn

I.3 Lý do chọn đề tài.

Việc đánh giá tác động của trọng lực khi ly tâm đến sự sống và phát triển của phôi sinh vật đã và đang được nhiều nhóm nghiên cứu với các mô hình thí nghiệm khác nhau Đề tài này được tiến hành trên mô hình phôi cá Ngựa vằn nhằm đánh giá ảnh hưởng của trọng lực khi ly tâm đối với phôi cá thông qua đánh giá tỉ lệ sống chết của phôi ở các giai đoạn: phôi nang, phôi vị, phân đốt, hình thành hầu họng; và thông qua đánh giá tỉ lệ nở của phôi Sử dụng phương pháp ly tâm ở các tôc độ khác nhau

để tách hoặc cô đặc các vật liệu lơ lửng trong môi trường chất lỏng Cơ sở lý thuyết của công nghệ này là do ảnh hưởng của trọng lực lên các phần tử (bao gồm các phân

tử lớn) lơ lửng trong chất lỏng Hai phần tử có khối lượng khác nhau sẽ lắng trong một ống ở những tốc độ khác nhau tương đương với trọng lượng Lực ly tâm tạo ra là

tỷ lệ đối với tốc độ quay của roto (rpm) và khoảng cách giữa tâm của roto và ống ly tâm

Xuất phát từ các thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lực

lên phôi cá ngựa vằn Do đó chúng tôi chọn đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của trọng lực đến sự phát triển của phôi cá (cụ thể là sự phát triển sau ly tâm ở các tốc độ

PHẦN II: QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

II.1 QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU

II.1.1 Mục đích nghiên cứu

 Các thành viên nắm được cách thiết kế, quy trình thí nghiệm, thao tác với các hóa chất

 Quan sát phôi, phân biệt các phôi dị dạng, phôi chết, phôi sống

Từ đó:

- Hiểu rõ hơn về quá trình phát triển phôi

- Đánh giá ảnh hưởng của trọng lực lên sự phát triển phôi cá (trong trường hợp này là cá Ngựa vằn)

II.1.2 Vật liệu và dụng cụ

II.1.2.1 Vật liệu

- Dung dịch rửa phôi E3 chứa 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, và 0.33mM MgSO4 được pha loãng 6x về dung dịch E3 1x được dùng trong thí nghiệm

III.1.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

Bảng 1 Danh sách dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm

Dụng cụ

Micropipette 100-1000µL Pipet bán tự động

Đĩa Petri Đĩa 6 giếng Kính hiển vi soi nổi

II.1.3 Tiến hành Thí Nghiệm:

 Ghép cá bố mẹ để cho sinh sản

 Thu nhận và rửa phôi

 Chọn phôi đang phát triển

 Ly tâm ở các tốc độ khác nhau

 Đánh giá các biến đổi hình thái phôi và xác định tỷ lệ phôi chết

 Phân tích kết quả

Tập hợp và chọn cá trưởng thành: Ấu trùng cá ngựa vằn được giữ trong bể

nuôi, nhiệt độ 26 - 28°C, theo chu kì 14h sáng/10h tối trong 1 ngày, cho ăn hàng ngày và hút chất thải 2h sau khi cho ăn Đến khi cá trưởng thành (sau 5

-6 tháng), cá đực và cá cái được tách riêng vào các bể khác nhau Các con trưởng thành được chia thành các cặp, giao phối theo cặp, mỗi cặp từ 3 đến 4 lần Nếu kết quả tốt thì cá được tách nhau ra Ngược lại, tráo các cặp và giao phối lại để chọn những con đực và cái có khả năng sinh sản tốt Những cặp tốt

sẽ có những đặc tính sau: trung bình khoảng 100 trứng mỗi lần sinh sản (3 - 4 ngày), tỷ lệ thụ tinh cao (trên 90%), tỷ lệ phôi thụ tinh nở cao hơn 75%, tỷ lệ phôi dị dạng nhỏ hơn 10%

Hình 2 Bể nuôi cá ngựa vằn trưởng thành

Sinh sản:

Trước ngày sinh sản, thả cá đực và cá cái vào cùng một bể chứa được ngăn cách bởi một tấm lưới

Cá bắt đầu quá trình thụ tinh ở đầu chu kì sáng vào ngày hôm sau Lưới được

bỏ và đưa một tấm lưới khác trong bể để tránh cá ăn phôi Thời gian thụ tinh kéo dài

25 – 30 phút, sau đó cá bố mẹ được chuyển trả về bể nuôi Phôi được hút vào khay, rửa bằng nước sạch để loại bỏ chất bẩn và phôi không thụ tinh, sau đó được bảo quản trong đĩa nước cất Thời điểm này được tính là 0h tức 0 ngày sau thụ tinh

Cụ thể:

II.1.3.1 Ghép cá

 Chiều 20/04, thả cá đực và cá cái vào cùng một bể chứa được ngăn cách bởi một tấm lưới (tỉ lệ đực:cái thường <1)  để qua đêm (để cá tiết hoocmon dẫn dụ)

 Sáng 21/04 (khoảng 7h), nhấc tấm lưới lên cho cá đực và cá cái gặp nhau, đặt tấm lưới gần sát đáy để ngăn cá ăn phôi

Sau khoảng 1,5h tiến hành thu phôi

Hình 3: Tiến hành Ghép cá.

II.1.3.2 Thu phôi và rửa phôi.

- Phôi được thu nhận trong hộp nuôi

- Rửa sạch phôi bằng E3  loại bỏ chất bẩn

II.1.3.3 Chọn phôi.

Chọn phôi: Ở 1 giờ sau thụ tinh ( 1hpf), phôi được chọn dưới kính hiển vi Ở

giai đoạn này, thường các phôi sẽ có 4 hoặc 8, 16 tế bào Chỉ có các phôi hình thái bình thường ( trên thành phôi và trong noãn hoàng) và phân cắt đồng đều mới được chọn

Hình 4 Đĩa chọn phôi

Tiêu chuẩn chọn phôi:

- Phôi đang trong giai đoạn phân chia từ 4-16 tế bào

- Noãn hoàng lớn, tròn, không dị dạng

- Màng phôi trong suốt

- Các phôi chọn phải đồng đều, đẹp để đảm bảo tính khách quan cho thí nghiệm

II.1.3.4 Ly tâm ở các tốc độ khác nhau.

- Ly tâm ở giai đoạn 4-16 tế bào

- Ly tâm ở các tốc độ 1000rcf, 1500rcf, 2000rcf, 2500rcf trong 3 phút

- Cho các giếng đánh số từ 1-4, 1 giếng đối chứng

II.1.3.5 Đánh giá phôi.

gian

Giếng Số con

bất thường

Số con chết

Tỉ lệ bất thường (%)

Tỉ lệ chết (%)

Thời gian

Giếng Số con

bất thường

Số con chết

Tỉ lệ bất thường (%)

Tỉ lệ chết (%)

Số con nở

Hình 5: biểu đồ tỉ lệ chết của phôi cá ngựa vằn theo thời gian.

Tại thời điểm 1h:

Phôi cá ngựa vằn sau khi được đem đi li tâm, thì ở giếng số 4 thấy xuất hiện

1 trứng chết,tạm thời chưa thể quan sát thấy trứng bất thường Chứng tỏ phôi

cá có chất lượng tốt, phân chia bình thường, chưa xuất hiện biến dạng và cho thấy môi trường trọng lực cao có tính độc với phôi

Hình 6: A Phôi cá ngựa vằn phân chia đến 4 tế bào( giai đoạn 0h)

B Phôi cá ngựa vằn bị chết

Tại thời điểm 7h:

Không có nhiều biến dạng xuất hiện tại thời điểm này Các biến dạng cũng không rõ ràng Cụ thể mỗi giếng có 1 trứng thuộc trạng thái bất thường Riêng giếng thứ 2 có 1 con chết Những con không bình thường hoặc chết có thể do ảnh hưởng của việc li tâm bị chèn ép ở giai đoạn này chưa thấy được

sự ảnh hưởng của trọng lực lên sự phát triển phôi cá ngựa vằn

Hình 7: phôi bị phát triển bất thường, có 2 dạng: A và B

Tại thời điểm 24h:

1 : 1 chết

2 : 8 bất thường( đuôi nhỏ/ đuôi gập vào trong)

3 : 2 chết, 9 bất thường

4 : 8 bất thương, 2 chập phát triển

ĐC : 1 chết

ở thời điểm này đã thấy rõ sự ảnh hưởng của trọng lực lên sự phát triển phôi

cá ngựa vằn Cụ thể, ở ống đối chứng, chỉ có 1 con chết, thể hiện tỉ lệ sống sót của phôi cá ngựa vằn ở giếng thứ nhất, tốc độ li tâm là thấp nhất, do đó phôi ít bị ảnh hưởng nhất, nên chỉ có 1 phôi chết Còn lại 3 giếng số 2, 3, 4

tỉ lệ bất thường khá lớn

Hình 8: A Phôi cá ngựa vằn phát triển bình thường.

B phôi cá không bình thường

C phôi phát triển không bình thường, đuôi và xương đuôi ngắn, đầu không phát triển

D.phôi phát triển không bình thường, đuôi nhỏ không có xương đuôi, đầu không bình thường

E phôi cá ngựa vằn phát triển không bình thường, đuôi gập vào trong

Tại thời điểm 30h:

Tại thời điểm này, tỉ lệ phôi cá ngựa vằn khác thường cũng khá lớn Tuy nhiên so với thời điểm 24h thì lượng phôibấtthường có xu hướng giảm do một số phôi phát triển chậm đã phát triển bình thường trở lại Riêng giếng thứ nhất có tốc độ li tâm ít nhất thì phát hiện thấy tỉ lệ khác thường là rất thấp, chỉ chiếm 2,63% và giếng thứ tư có tốc độ li tâm cao nhất xuất hiện 4 phôi chết chứng tỏ mức độ độc tính cao của mức li tâm 4000rpm

Tại thời điểm 48h:

Tại thời điểm này phôi cá thấy được tương tự như thời điểm 29h và xuất hiện thêm một số phôi chết ở giếng 2, 3 và 4 Ở giếng thứ nhất thấy tỉ lệ khác thường là thấp, chỉ chiếm 2,63% Giếng thứ 2 có tỉ lệ khác thường là lớn nhất, chiếm 31,03% Các giếng thứ 3 và thứ 4 tỉ lệ khác thường thấp hơn

giếng 2 lần lượt là12,5% và 16,67% Còn giếng đối chứng đến giai đoạn này không phát hiện các trường hợp bất thường Trong các trường hợp bất thường ở giai đoạn này xuất hiện thêm hiện tượng phù noãn hoàng

Hình 9: các kiểu bất thường được ghi lại tại thời điểm 47h

Tại thời điểm 56h:

Khi phôi đã phát triển được đến giai đoạn 55h, ta nhận thấy tỉ lệ chết dường như là bằng 0, các phôi vẫn xuất hiện bất thường với tỉ lệ khá lớn Cụ thể, giếng 2 có tỉ lệ này ở mức 31,03%, giếng 3 ở mức 40% và giếng 4 là 25% Ngoài ra ở giai đoạn này đã có một số ít phôi nở, các phôi nở đều bình thường chứng tỏ đây là các phôi khỏe mạnh, phát triển tốt và ít chịu ảnh hưởng của trọng lực

Hình 10: các dạng bất thường được ghi lại ở thời điểm 55h.

Tại thời điểm 73h:

Đây là thời điểm cuối của sự phát triển phôi và cũng là thời điểm cuối cùng mà nhóm quan sát ở thời điểm này tỉ lệ bất thường giảmđi nhiều do một số phôi có sự bất thường không lớn đã nở thành các con non không bình thườngvà còn xuất hiện các phôi chết Cụ thể, ở giếng 1 là 5,26%, ở giếng 2 là 20,69%, giếng 3 là 17,5%, giếng 4 là 4,17% tỉ lệ nở ở giai đoạn này cũng

đã khá cao, ở giếng 1 là 55,26%, giếng 2 là 17,24%, giếng 3 là 27,5%, giếng

4 là 37,5% và ở giếng đối chứng là 42,85% Lượng trứng chưa nở thường là những trứng có hiện tượng bất thường trong quá trình phát triển phôi, làm ảnh hưởng đến quá tình phát triển bình thường nên chưa nở thành cá được Có một số trứng tuy bất thường nhưng sự sai khác không ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển nên vẫn nở như bình thường, tuy nhiên con nở ra có hình dạng không bình thường

PHẦN III: TỔNG KẾT III.1 Kết luận

Thí nghiệm đã đạt được kết quả sau:

- Môi trường trọng lực cao có tính độc đối với sự phát triển của phôi cá ngựa

vằn Tính độc cao khi li tâm ở tốc độ 4000rpm dẫn đến tỉ lệ gây chết phôi cao, còn ở các tốc độ thấp hơn có tỉ lệ gây quái thai cao

- Dạng bất thường chủ yếu do môi trường trọng lực cao gây ra là phôi dị dạng,

phù noãn hoàng Các bất thường thường xuất hiện vào thời điển 24h sau khi li tâm Các phôi xuất hiện bất thường trong giai đoạn này có thể chết, nở muộn, hoặc nở ra hình dạng bất thường

III.2 Dự kiến mở rộng đề tài

Tìm hiểu thêm về các tác động của môi trường đến sự phát triển của phôi cá ngựa vằn