SINH HỌC PHÂN TỬ

New Page Page of 203 BỘ Y TẾ SINH HỌC PHÂN TỬ (DÙNG CHO ðÀO TẠO DƯỢC SĨ ðẠI HỌC) Mã số: ð.20.X.06 NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC Chỉ ñạo biên soạn: VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO - BỘ Y TẾ Chủ biên: GS.TS NGUYỄN VĂN THANH Những người biên soạn: GS.TS NGUYỄN VĂN THANH TS TRẦN THU HOA TS TRẦN CÁT ðÔNG ThS HỒ THỊ YẾN LINH Tham gia tổ chức thảo: ThS PHÍ VĂN THÂM TS NGUYỄN MẠNH PHA file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203  Bản quyền thuộc Bộ Y tế (Vụ Khoa học ðào tạo) 770 - 2007/CXB/3 - 1676/GD Mã số: 7K721M7 - DAI Lời giới thiệu Thực số ñiều Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & ðào tạo Bộ Y tế ñã ban hành chương trình khung ñào tạo Dược sĩ ñại học Bộ Y tế tổ chức biên soạn tài liệu dạy - học môn sở chuyên môn theo chương trình nhằm bước xây dựng sách ñạt chuẩn chuyên môn công tác ñào tạo nhân lực y tế Sách SINH HỌC PHÂN TỬ ñược biên soạn dựa chương trình giáo dục Trường ðại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh sở chương trình khung ñã ñược phê duyệt Sách ñược tác giả GS.TS Nguyễn Văn Thanh, TS Trần Thu Hoa, TS Trần Cát ðông, ThS Hồ Thị Yến Linh biên soạn theo phương châm: Kiến thức bản, hệ thống; nội dung xác, khoa học; cập nhật tiến khoa học, kỹ thuật ñại thực tiễn Việt Nam Sách SINH HỌC PHÂN TỬ ñã ñược Hội ñồng chuyên môn thẩm ñịnh sách tài liệu dạy - học chuyên ngành Dược sĩ ñại học Bộ Y tế thẩm ñịnh vào năm 2007 Bộ Y tế ñịnh ban hành tài liệu dạy - học ñạt chuẩn chuyên môn ngành giai ñoạn Trong thời gian từ ñến năm, sách phải ñược chỉnh lý, bổ sung cập nhật Bộ Y tế xin chân thành cảm ơn tác giả Hội ñồng chuyên môn thẩm ñịnh ñã giúp hoàn thành sách; Cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ty, PGS.TS ðinh Hữu Dung ñã ñọc phản biện, ñể sách hoàn thành kịp thời phục vụ cho công tác ñào tạo nhân lực y tế Lần ñầu xuất bản, mong nhận ñược ý kiến ñóng góp ñồng nghiệp, bạn sinh viên ñộc giả ñể lần xuất sau ñược hoàn thiện VỤ KHOA HỌC VÀ ðÀO TẠO - BỘ Y TẾ LỜI NÓI ðẦU Năm 1909, Johansen W xuất chuyên khảo "Các yếu tố học thuyết ñúng ñắn biến dị di truyền" (Element de exakten Erblichkeitslehre), ñó lần ñầu tiên xuất từ gen Năm 1953, file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 Watson Crick khám phá mô hình xoắn kép ADN ñã thúc ñẩy nhanh chóng phát triển di truyền học mức ñộ phân tử Năm 1965, J Watson xuất sách "Sinh học phân tử gen" dày 494 trang ñến năm 1976, lần tái lần thứ ba ñã dày lên 739 trang Tiếp sau ñó, hàng loạt tài liệu Sinh học phân tử ñời Cho ñến ngày 26 - 06 - 2000, Washington D.C, công ty tư nhân Celera Genomics (Anh) Dự án Bộ gen Người (Human Genome Project) Viện nghiên cứu Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ (National Institute of Health) ñã phác thảo ñồ gen người Theo ñó, gen người có 3,12 tỉ nucleotid 97% tổng nucleotid ñã ñược xác ñịnh trình tự, ñó có 85% số trình tự ñã ñặt ñúng vị trí Khoảng 3% ADN có chứa gen, 97% lại ADN "không chức năng" Trong tổng số 3% ADN có khoảng 30 - 50000 gen Ngày 14 - - 2003, Tổ chức Quốc tế ðịnh trình tự Bộ gen Người (International Human Genome Sequencing Consortium) tuyên bố ñã hoàn thành công ñoạn cuối ñồ gen người Kế ñồ gen, phương pháp tìm gen có tính chất trị liệu ñược thực quy mô lớn Dược lý gen (Pharmacogenomics) khám phá sâu gen người ñể ứng dụng ngành Dược Sách "Sinh học phân tử" nhằm giúp cho sinh viên Dược khoa hiểu ñược cấu trúc chức gen Sách gồm bài: Nhập môn; Sao chép ADN; Các loại ARN; Sự phiên mã mã di truyền; Sinh tổng hợp protein; ðiều hoà hoạt ñộng gen; Bộ gen tế bào nhân thật; ðột biến gen - Các phương pháp phân tích ADN Sách xuất lần ñầu nên khó tránh khỏi thiếu sót Các tác giả mong nhận ñược góp ý ñộc giả CÁC TÁC GIẢ CÁC TỪ VIẾT TẮT A Adenine ADN Acid desoxyribonucleic AIDS Acquired immune − deficiency syndrome AP Apurinic or apyrimidinic ARN Acid ribonucleic bp Base pair C Cytosine cADN Complementary DNA cds Coding sequence file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 CpG C phosphat G CTF CCAAT binding Trascription Factor DMD Duchenne muscular dystrophy DNase Deoxyribonuclease dNTP Desoxyribonucleozid triphosphat dsADN Double − stranded DNA eEF Eukaryote elongation factor EF Elongation factor eIF Eukaryote initiation factor eRF Eukaryote release factor EGF Epidermal growth factor FRET Fluorescence resonance energy transfer G Guanine GMO Genetic modified organism Hfr High frequency recombination Hft High frequency transduction HIV Human immunodeficiency virus hnARN Heterogenous nuclear RNA Icr Insensitive to catabolite repression IF Initiation factor IGS Internal guide sequence Kb Kilobase LINE Long interspersed repetitive element MALDI-TOF Matrix − assisted lazer desorption ionization time − of − fligt mARN Messenger RNA NAAAF N − acetoxy − − acetylaminofluorene NAD Nicotinamide − adenine dinucleotide file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 NER Nucleotide excision repair NF Neurofibromatosis NF1 Neurofibromatosis type NMN Nicotinamide mononucleotide NMP Nucleotide monophosphat Ori Origin of replication PCR Polymerase chain reaction PDGF Platelet − derived growth factor PFGE Pulse field gel electrophoresis Pi Inefficient promoter PKU Phenylketonuria PR Photoreactivation Rad Radiation absorbed dose rARN Ribosome RNA RE Restriction enzyme, restriction endonuclease Rem Roentgen equivalent man RF Release factor RFI Replicative form I RFLP Restriction fragments length polymorphism RNase Ribonuclease RNP Ribonucleoprotein RRF Ribosome release factor scRNA Small cytoplasmic RNA SINE Short interspersed repetitive element snRNA Small nuclear RNA SPR Surface plasmon resonace SRP Signal recognition particle SSB Single − stranded binding file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 ssADN Single − stranded DNA T Thymine tRNA Transfer RNA THE Transposable human element THR Thyroid Hormon Receptor Tm Melting temperature U Uracile UTR Untranslated region BẢNG ðỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH Tiếng Việt Tiếng Anh ADN bổ sung Complementary DNA ADN sợi ñôi Double - stranded DNA ADN sợi ñơn Single - stranded DNA ADN vi vệ tinh Microsatellite DNA Alkapton niệu Alkaptonuria ARN nhân không ñồng nhất, hnARN Heterogenous nuclear RNA ARN nhân nhỏ, snARN Small nuclear RNA ARN polymerase phụ thuộc ADN DNA - dependent RNA polymerase ARN ribosom Ribosomal RNA ARN tế bào chất nhỏ, scARN Small cytoplasmic RNA ARN thông tin Messenger RNA ARN vận chuyển Transfer RNA Base ñồng ñẳng Base analogue Bệnh hồng ban lupus Systemic lupus erythematosus Bệnh loạn dưỡng Duchenne Duchenne muscular dystrophy Biến nạp Transformation Bộ ba kết thúc Stop codon file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 Bộ gen Genome Bộ suy giảm Attenuator Bong bóng chép Replication bubble Chạc ba chép Replicating fork Chất cảm ứng Inducer Chất dị nhiễm sắc Heterochromatin Chất dị nhiễm sắc cấu Constitutive heterochromatin Chất hoạt hoá Activator Chất nguyên nhiễm sắc Euchromatin Chất nhiễm sắc Chromatin Chất siêu ức chế Superrepressor Chất ức chế Inhibitor, repressor Chất ức chế gốc Aporepressor Chip ADN DNA microarray Chuỗi xoắn kép Double helix Chuyển vị nghịch Retrotransposition Cơ chế bán bảo tồn Semiconservative mechanism Cơ chế bảo tồn Conservative mechanism Cơ chế lăn vòng Rolling circle mechanism Công nghệ di truyền Genetic engineering Công nghệ sinh học Biotechnology Công nghệ nano sinh học Bionanotechnology Dấu ấn ADN DNA fingerprint Dị xúc tác Heterocatalysis Dự án gen người Human genome project ða cistron Polycistron ða kiểm soát Multiple control ðầu dính Cohesive end ðầu tù Blunt end ðiểm gốc chép Origin of replication ðiện di gel Gel electrophoresis ðiện di trường xung file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 Pulse field gel electrophoresis ðiều hoà âm Negative control ðiều hoà dương Positive control ðịnh kiểu gen Genotyping ðoạn chèn Insertion sequence ðoạn dò Probe ðoạn Okazaki Okazaki fragment ðối mã Anticodon ðơn cistron Monocistron ðơn vị phiên mã Operon ðơn vị chép Replicon ðột biến cảm ứng Induced mutation ðột biến nghĩa Sense mutation ðột biến lặng Silent mutation ðột biến lệch nghĩa Missense mutation ðột biến tự nhiên Spontaneous mutation ðột biến vô nghĩa Nonsense mutation Enzym cắt giới hạn Restriction enzyme Enzym phiên mã ngược Reverse transcriptase Gây ñột biến ñiểm ñịnh hướng Site - directed mutagensis Gen cảm ứng Inducible gene Gen ức chế Repressible gene Gen ñiều hoà Regulatory gene Gen giả Pseudogene Gen nhảy Transposon Gen tiền ung thư Proto - oncogene Gen ung thư Oncogene Hạch nhân Nucleolus Hạt F F - prime Bộ gen học Genomics Hệ protein Proteome file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page of 203 Hệ protein học Proteonomics Heterogenous nuclear ARN hnRNA Hoá miễn dịch Immunochemistry Học thuyết trung tâm Central dogma Hộp Pribnow Pribnow box Hộp TATA TATA box Hợp tử Zygote Hợp tử không hoàn toàn Merozygote Khả nạp Competence Khuôn mẫu Template Kiểm soát âm Negative control Kiểm soát cảm ứng âm Negative inducible control Kiểm soát cảm ứng dương Positive inducible control Kiểm soát dương Positive control Kiểm soát sau dịch mã Post - translation control Kiểm soát ức chế âm Negative repressible control Kiểu gen Genotype Kiểu hình Phenotype Kỹ thuật di truyền Genetic engineering Lai chỗ In situ hybridization Lai vết ADN Southern blot Lai vết ARN Northern blot Lai vết protein Western blot Lồng ghép Catena Lục lạp Chloroplast Lực tiếp hợp Matting force Mã di truyền Genetic code Màng tế bào chất Cell membrance Mồi Primer Môi trường tối thiểu Minimal media Ngoài nhiễm sắc thể Extrachromosome file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 10 of 203 Ngón tay kẽm Zinc finger Nhân Nucleolus Nhiễm sắc thể Chromosome Nhiễm sắc thể ña sợi Polytene chromosome Nicotinamide mononucleotide NMN Nicotinamide - adenine dinucleotide NAD Nút Loop Nút kẹp tóc Hairpin loop Operon cảm ứng Inducible operon Phage ôn hoà Temperate phage Phần gen cấu trúc không mang mã Intron Phần gen cấu trúc mang mã Exon Phần thừa ñầu Terminal redundancy Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction Phenyl ceton niệu Phenylketonuria Phức hợp khởi ñộng ñóng Closed promoter complex Phức hợp khởi ñộng mở Open promoter complex Phức hợp nhận diện tín hiệu xuất Signal recognition particle Promoter vệ tinh Spacer promoter Protein căng mạch Single - stranded binding protein Protein ñiều hoà Regulatory protein Protein gắn chóp Cap - binding protein Protein hiệu ứng Effector protein Protein ức chế Repressor protein Quang phục hồi Photoreactivation Sản phẩm khuếch ñại Amplicon Sau dịch mã Post - translation Sinh học phân tử Molecular biology Sinh vật chuyển gen Genetic modified organism Sợi sớm Leading strand Sợi khuôn sớm Leading strand template file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 189 of 203 ñó lại ñược dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm bước gắn ñoạn mồi, tổng hợp ADN tách rời ñoạn Kết cuối phản ứng PCR sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết ta có 2n-2 phân tử ADN mạch kép nằm hai ñoạn mồi (bảng 9.1) B ng 9.1 Hiệu nhân ADN PCR Số chu kỳ (n) Số phân tử ADN mạch kép sinh Số chu kỳ (n) Số phân tử ADN mạch kép sinh 17 32768 18 65536 19 131072 4 20 262144 21 524288 16 22 1048567 32 23 2097152 64 24 4194304 128 25 8388608 10 256 26 16777216 11 512 27 33544432 12 1,024 28 67108864 13 2,048 29 134217728 14 4,096 30 268435456 15 8,192 31 536870912 16 19,384 32 1073741824 file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm Page 190 of 203 30/09/2009 New Page Page 191 of 203 Hình 9.6 Sơ ñồ nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase ðể ñơn giản hoá sơ ñồ, từ phần (d) không vẽ hai sợi ADN khuôn ban ñầu 9.5.3 Cách tiến hành phản ứng PCR PCR chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử ADN ñược biến tính nhiệt ñộ cao nhiệt ñộ "chảy" Tm phân tử, thường 94oC –95oC vòng 30 giây –1 phút Tại nhiệt ñộ này, phân tử ADN mạch kép tách hoàn toàn, tạo nên sợi ñơn ñể dùng làm khuôn cho ñoạn mồi ADN polymerase ðây giai ñoạn biến tính Bước 2: Nhiệt ñộ ñược hạ thấp (thấp Tm mồi), cho phép ñoạn mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt ñộ dao ñộng khoảng 40oC –70oC, tuỳ thuộc vào Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây ñến phút ðây giai ñoạn lai Bước 3: Nhiệt ñộ ñược tăng lên ñến 72oC giúp cho ADN polymerase chịu nhiệt hoạt ñộng tốt Thời gian tuỳ thuộc ñộ dài trình tự ADN cần khuếch ñại, thường kéo dài khoảng 30 giây hay ðoạn ADN nằm hai mồi ñược tổng hợp ðây giai ñoạn tổng hợp hay kéo dài Vào cuối giai ñoạn này, nhiệt ñộ lần ñược nâng lên 94oC, lần vòng 30 giây ñể cho mẩu ngắn ADN mạch kép (cả sợi ban ñầu sợi ñược tổng hợp) tách Các sợi ñơn trở thành khuôn cho chu kỳ tổng hợp ADN khác Tóm lại, chu kỳ gồm ba bước: biến tính (ñun nóng) ñể tách sợi ADN kép thành sợi ñơn ñể làm khuôn, lai hoá (gắn kết) ñoạn mồi vào sợi khuôn kéo dài (tổng hợp) ADN polymerase, ñược lặp ñi lặp lại nhiều lần lần lại làm tăng gấp ñôi lượng mẫu lần trước ðây khuếch ñại theo cấp số nhân (hình 9.6) 9.5.4 Các thành phần phản ứng Vật liệu gồm trước hết ADN có chứa ñoạn cần nhân lên Không cần thiết phải tách riêng ñoạn cần nhân lên việc ñó ñã ñược ñoạn mồi dùng phản ứng xác ñịnh Hàm lượng ADN cần cho phản ứng nhỏ Trong thí nghiệm bình thường phòng thí nghiệm cần microgram ADN gen ñủ Trong nhiều trường hợp, phản ứng PCR nhân ñoạn ADN từ phân tử riêng lẻ Hai ñoạn mồi ñể xác ñịnh ñiểm bắt ñầu tổng hợp ADN, ADN polymerase, hỗn hợp deoxyribonucleotid (ở dạng dNTP) dung dịch ñệm có ion Mg2+ cần ñược ñưa vào ống nghiệm có chứa ADN khuôn Dung tích tổng số thường 50 µl 20 µl Hỗn hợp phản ứng ñược cho vào ống nhựa nhỏ chịu nhiệt, có nắp ñậy Một phản ứng PCR gồm thành phần hay vật liệu ban ñầu: mạch khuôn cho khuếch ñại, ñoạn mồi oligonucleotide, dNTP, ADN polymerase chịu nhiệt với dung dịch ñệm phản ứng thích hợp MgCl2 Nồng ñộ thành phần tuỳ yêu cầu Trừ ADN khuôn ñoạn mồi, thành phần cho PCR ñều có sẵn từ nhà cung cấp 9.5.4.1 Các polymerase chịu nhiệt Enzym ADN polymerase ñược sử dụng ñầu tiên PCR ñoạn Klenow ADN polymerase I ðặc tính ñoạn xúc tác tổng hợp ADN theo chiều 5’ - 3’ có hoạt tính exonuclease (thuỷ file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 192 of 203 giải liên kết nucleotide từ ñầu phân tử ADN) theo chiều 3’ - 5’ Tuy nhiên enzym không chịu ñược nhiệt nên thao tác phức tạp hiệu thấp (phải thêm enzym vào phản ứng sau lần biến tính enzym cũ ñã bị nhiệt phân huỷ, nhiệt ñộ lai thấp khiến khuếch ñại không ñặc hiệu vv ) Hiện thường dùng ADN polymerase Taq polymerase chịu nhiệt, ñược tách chiết từ loài vi khuẩn suối nước nóng có tên Thermus aquaticus Enzym không bị phá huỷ nhiệt ñộ biến tính xúc tác tổng hợp từ ñầu ñến cuối trình phản ứng Taq polymerase có sẵn thị trường từ công ty công nghệ sinh học Các polymerase chịu nhiệt khác có thị trường bao gồm Vent polymerase ñược phân lập từ Thermococcus litoralis, xúc tác tổng hợp nhiều xác từ mạch khuôn Taq polymerase Ngoài có Tth polymerase ñược phân lập từ Thermus thermophilus Các polymerase chịu nhiệt thành phần ñắt PCR thường ñược sử dụng ñơn vị cho phản ứng Hàm lượng ñủ ñể xúc tác cho khuếch ñại khoảng 40 chu kỳ máy PCR Trước ñây, việc lựa chọn polymerase chịu nhiệt cho thí nghiệm không khó khăn có loại ADN polymerase chịu nhiệt (Taq) Hiện có nhiều loại polymerase có nguồn gốc khác nhau, nhiều polymerase ñược biến ñổi di truyền chúng ưu việt polymerase gốc phạm vi vài ứng dụng (bảng 9.2) Sự chọn lựa polymerase chịu nhiệt cho thí nghiệm PCR phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm B ng 9.2 Các loại ADN polymerase thường gặp Enzym Nguồn gốc Nơi Mức ổn ñịnh 95oC (t1/2) Hoạt ñộng tối ưu Cation cần thiết 3’→ 5’ Exonuclease Taq Thermus aquaticus Suối nước nóng 40 phút 50 - 75 MgCl2 - AmpliTaq Tag tái tổ hợp 40 phút 50 - 75 MgCl2 - AmpliTaq AmpliTag cắt bỏ 289 aa N tận 80 phút 75 - 80 MgCl2 - 20 phút 55 - 75 MnCl2 (RT), MgCl2 (PCR) - Stoffel Tth Thermus thermophilus Suối nước nóng Ultima Thermotoga maritima Dòng chảy nóng biển sâu Vent Thermococcus litoralis Dòng chảy nóng biển sâu Vent (Exo ) Vent tái tổ hợp Deep Vent Pyrococcus sp Strain GB -D Dòng chảy nóng biển sâu >95% hoạt ñộng sau h Pfu Pyrococcus furiosus Dòng chảy nóng biển sâu >95% hoạt ñộng sau h + >95% hoạt ñộng sau h file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm MgSO4 + MgSO4 - 72 - 80 MgSO4 + 75 MgCl2 + 80 30/09/2009 New Page Page 193 of 203 9.5.5.2 ADN khuôn mẫu Phản ứng chuỗi cực nhạy, cần dùng phân tử ADN làm khuôn thu ñược sản phẩm Tuy nhiên, mức ñộ nhạy cảm cao nguyên nhân gây dương tính giả ADN ngoại nhiễm Phản ứng khuếch ñại tối ưu xảy ADN thật tinh khiết nhiều kỹ thuật chẩn ñoán PCR ñạt kết tốt với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết mẫu thử (vết máu, vật liệu lưu trữ, ADN cũ vi khuẩn ñã tiệt trùng) Tuy nhiên, nhiều trường hợp khác, trình chuẩn bị mẫu phải ñược thực ñể ñảm bảo cho việc khuếch ñại, chất ức chế heparin, EDTA, hay acid diện mẫu Mạch ADN khuôn mẫu ảnh hưởng ñến phản ứng chuỗi Nếu ADN có chứa nhiều GC khó khăn cho việc tách rời chuỗi ADN nhiệt ñộ cao Trong trường hợp này, việc thêm formamide hay dimethyl sulfoxide (DMSO) vào hỗn hợp phản ứng giải ñược vấn ñề Nồng ñộ ADN khuôn mẫu PCR ảnh hưởng ñến mức ñộ khuếch ñại Với việc sử dụng polymerase cho hiệu cao, lượng ADN mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm (1 microgram 100 nanogram) Mặc dù, khuôn mẫu ñơn ñược khuếch ñại thí nghiệm ñều ñạt ñược nhạy cảm Do ñó, nên thiết lập PCR với lượng ADN khuôn mẫu thích hợp Lượng khuôn mẫu ADN dư thừa ảnh hưởng xấu ñến trình khuếch ñại Nếu lượng ADN khuôn mẫu cao có khuynh hướng tạo lượng lớn sản phẩm ñược kéo dài từ ñoạn mồi sản phẩm nằm ñoạn mồi Việc lựa chọn mồi, trình ủ lặp lại không thích hợp có mặt chất ức chế làm giảm khuếch ñại ADN khuôn gen tách từ tế bào, ADN từ ngân hàng genome cADN (chỉ cần nồng ñộ ng), ADN bất kỳ, ARN toàn ARNm 9.5.4.3 Các ñoạn mồi Các ñoạn mồi thành phần ñịnh khuếch ñại ñặc trưng có hiệu cao PCR Việc chọn ñoạn mồi phải tuân thủ số nguyên tắc: - Trình tự mồi ñược chọn cho có bắt cặp bổ sung mồi tạo cấu trúc bậc hai hay tạo dimer nucleotid ñoạn mồi làm cho phản ứng giảm hiệu ngăn cản tạo thành ñoạn mong muốn - Các mồi chọn phải ñặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch ñại, không trùng với trình tự lặp lại gen - Kích thước ñoạn mồi tối ưu từ 18 - 25 nucleotid ðoạn mồi với kích thước ñảm bảo cho việc gắn ñặc hiệu nhiệt ñộ tối ưu giá thành cho ñoạn mồi ñược giảm thiểu - Khoảng cách hai mồi không dài kb Phản ứng PCR tối ưu trình tự nhỏ kb Tuy nhiên có số enzym polymerase chịu nhiệt tổng hợp ñược ñoạn ADN có kích thước khoảng 30kb - Tỷ lệ GC mồi thường chiếm khoảng 40 - 75% Trong thành phần ñoạn mồi tránh có nhiều cặp GC loạt nucleotid G C Vì liên kết G: C mạnh liên kết A: T (G nối với C liên kết hydro A với T có 2) Do vậy, việc bẻ gãy liên kết G: C cần nhiều file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 194 of 203 lượng liên kết A: T Người ta tính ñược nhiệt ñộ tối ưu cho việc ủ ñoạn mồi PCR, nhiệt ñộ gọi Tm –5oC nhiệt ñộ "chảy" ñoạn mồi trừ ñi Kết có từ phép tính ñơn giản: Tm = 2(A + T) + 4(G + C) Nhiệt ñộ ủ = Tm –5oC Các ñoạn mồi ñược tổng hợp hoá học chất tải rắn máy tổng hợp oligonucleotide Các máy ñược tự ñộng hoá cao, dễ dàng tổng hợp ñoạn mồi Có nhiều quy tắc ñể thiết kế ñoạn mồi ñã có số phần mềm cho chọn lựa cặp ñoạn mồi tối ưu cho khuếch ñại ADN khuôn mẫu có trình tự ñã biết Nồng ñộ mồi khoảng 0,1 µ M ñến µM Nồng ñộ thường ñược xác ñịnh dựa vào giá trị OD (optical density) ño 260 nm 9.5.4.4 Magnesium chloride Nồng ñộ MgCl2 ảnh hưởng ñến thành công phản ứng, mặt Mg+2 khuếch ñại không xảy MgCl2 cần thiết cho hoạt ñộng ADN polymerase ủ ADN với ñoạn mồi có mối tương quan với nucleotid triphosphat Nồng ñộ MgCl2 tối ưu cho PCR phải ñược xác ñịnh cho phản ứng thực nghiệm Có thể dùng phương pháp ñịnh phân cách thiết lập loạt phản ứng với nồng ñộ MgCl2 khác từ mM ñến mM xác ñịnh nồng ñộ MgCl2 tối ưu cho mẫu mong muốn 9.5.4.5 Nucleotid triphosphat (dNTP) Bốn loại nucleotide thường ñược sử dụng nồng ñộ 20 - 200 µM/ loại nucleotid Nồng ñộ cao dễ dẫn ñến khuếch ñại "ký sinh" Sự cân thành phần nucleotid làm tăng lỗi chép polymerase 9.5.5 Chu kỳ nhiệt PCR Phản ứng chuỗi khuếch ñại ADN ñạt ñược chu kỳ ñược lặp ñi lặp lại Mỗi chu kỳ gồm biến tính cách nâng nhiệt ñộ, ủ cách hạ nhiệt ñộ kéo dài Một chu kỳ ñiển hình cho việc khuếch ñại ñoạn ADN gồm 500 cặp base biến tính 94oC 60 giây, ủ 50oC 60 giây 72oC 60 giây Mỗi PCR ñược thiết kế ñược tối ưu hoá khác tuỳ thuộc số yếu tố: - Kích thước ñoạn ñược khuếch ñại Các sản phẩm khuếch ñại lớn cần giai ñoạn biến tính kéo dài lâu Các ñoạn ngắn cần thời gian giai ñoạn kéo dài - Trình tự ñoạn mồi ñiều kiện ion ñịnh nhiệt ñộ ủ tốt cho chu kỳ Vì vậy, dựa vào phản ứng ñã ñược thực hiện, nhiệt ñộ ủ thay ñổi từ 37oC ñến 65oC 9.5.6 Ưu ñiểm nhược ñiểm phương pháp PCR Việc ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR có nhiều lý do: - Rất nhanh chóng Chỉ tốn khoảng khuếch ñại trình tự mong muốn ñã biết so với file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 195 of 203 kỹ thuật công nghệ di truyền "cổ ñiển" phải tuần hay - ðơn giản: PCR ñược thực ống nhỏ với thành phần tối thiểu việc trộn chúng lại với Các phương pháp tạo dòng gen ñiển hình khác cần có vật liệu mắc tiền màng nucleotid triphosphate ñược ñánh dấu phóng xạ kỹ thuật ñặc biệt PCR ñược thực mẫu có chứa ADN tương ñối thô, ví dụ vết máu chưa ñược xử lý cho việc phân tích pháp y ðiều ngược với phương pháp thao tác gen cần phải có ADN khuôn mẫu lẫn vector tương ñối tinh khiết Các yếu tố cho thấy PCR thay ñổi ñáng kể so với phương pháp cổ ñiển cho việc khuếch ñại trình tự ñặc biệt - Nhạy: Phản ứng PCR cực nhạy cần dùng phân tử ADN làm khuôn thu ñược sản phẩm Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh ứng dụng rộng rãi kỹ thuật PCR ñòi hỏi phải biết rõ trình tự ADN khuôn mẫu ðây ñiểm giới hạn kỹ thuật này, nghĩa phải dựa vào tảng kỹ thuật công nghệ di truyền không thay kỹ thuật Do người ta không sử dụng kỹ thuật kỹ thuật tạo dòng gen thiết kế Trong vài trường hợp phương pháp PCR không áp dụng ñược với ñoạn ADN kích thước lớn kb (thường kb tốt nhất) Ngoài khả ngoại nhiễm ñối với phương pháp lớn 9.5.7 Các phương pháp PCR cải tiến Phản ứng PCR ñược áp dụng rộng rãi có biến ñổi phù hợp với mục ñích nghiên cứu riêng Vì gặp nhiều phương pháp khác PRC tổ (Nested - PCR), ADN nhánh (Branch ADN), PCR ña thành phần (multiplex - PCR), PCR ngược (Reverse - PCR), RAPD - PCR tất ñều dựa nguyên tắc phản ứng PCR 9.5.7.1 PCR "tổ" ðể ñạt ñược ñộ nhạy cao PCR, người ta thực PCR liên tiếp Trên ñiện di ñồ ñoạn thu ñược sau PCR thứ nhất, người ta quan sát thấy vệt có vệt nhỏ khác ðiều mồi bắt cặp với vùng khác ADN ñích lai hoá không ñặc hiệu PCR thứ ñược thực với mồi giống PCR 1, khuếch ñại sản phẩm thu ñược từ PCR thứ PCR "tổ" có ñộ ñặc hiệu cao sử dụng cặp mồi khác Cặp mồi ngoại: Cặp mồi tạo ñoạn ADN ñược khuếch ñại giống với PCR cổ ñiển Chúng ñặc hiệu cho trình tự mút ADN cần khuếch ñại Các ñoạn ADN thu ñược làm khuôn mẫu cho PCR thứ Cặp mồi nội: Cặp mồi bổ sung với vùng nằm bên chuỗi nucleotid thu ñược với cặp mồi thứ Thuật ngữ "PCR tổ" ñoạn mồi ñược tổ, ñóng hộp lần PCR ñầu Kỹ thuật có ñộ nhạy ñộ chuyên biệt cao Người ta dùng kỹ thuật ñể phát virus gây bệnh viêm gan C, loại virus có vật liệu di truyền ARN ARN virus ñược phát lai hoá trực tiếp, nên phải thực file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 196 of 203 phản ứng chuỗi khuếch ñại vật liệu di truyền virus PCR thứ chuyển tất ARN virus thành cADN, ñây bước mã ngược nhờ enzym phiên mã ngược tạo cADN kỹ thuật PCR "tổ" Trong PCR thứ 2, mồi ñược biotin hoá, mồi ñược gắn với iod 125 Các ñoạn thu ñược ñược gắn giá mang avidin (avidin chất có lực mạnh ñối với biotin), cuối người ta ño hoạt tính phóng xạ ñể kết luận mẫu dương tính hay âm tính (hình 9.7) PCR "tổ" có ñộ nhạy cao PCR tiêu chuẩn lặp lại khuếch ñại sản phẩm từ PCR thứ với PCR thứ Tuy nhiên vấn ñề ngoại nhiễm vấn ñề hạn chế Hình 9.7 PCR "tổ" phát HCV 9.5.7.2 ADN "nhánh" ADN ñích ñược khuếch ñại PCR, sau ñó cho lai với ñoạn dò (là phần ñặc hiệu ADN này) Tín hiệu ñược lai hoá ñặc hiệu với ñoạn dò theo cách thức ADN ñích có gắn (chất huỳnh quang, chất quang hay chất màu), tín hiệu ñược tạo nhờ chất ñánh dấu diện sau máy khuếch ñại PCR "nhánh" có ñộ ñặc hiệu cao Kỹ thuật ADN "nhánh" ñược dùng ñể phát ADN virus gây bệnh viêm gan B Trong kỹ thuật sử dụng ñoạn dò Một ñoạn dò thành phần trình tự cho phép lai hoá lúc ñoạn ñích khác file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 197 of 203 Hình 9.8 Kỹ thuật ADN "nhánh" sử dụng ñoạn dò 9.5.7.3 PCR ña thành phần Trong kỹ thuật này, hay nhiều ADN ñích ñược khuếch ñại ñồng thời PCR ña thành phần ñược sử dụng thường xuyên xét nghiệm chẩn ñoán, sử dụng mồi khác nhau: thứ ñể xác ñịnh ñồng PCR thứ hai nhắm vào trình tự ADN dư thừa PCR ña thành phần ñược sử dụng phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng với ñoạn dò cho mẫu xét nghiệm cho vài sinh vật khác ống PCR Khi tiến hành PCR ña thành phần cần phải xem xét số yếu tố thiết kế ñoạn mồi Các mồi phải có nhiệt ñộ lai tương tự Sự khác biệt 10oC nhiệt ñộ lai mồi làm cho sản phẩm khuếch ñại khác hay tạo khuếch ñại phát ñược sản phẩm hay sản phẩm khác Các ñoạn mồi ñược sử dụng ñược thiết kế cho sản phẩm khác ñủ kích thước ñể sản phẩm ñược xác ñịnh không khác ñể cho khuếch ñại ADN ñích ñược ưu tiên so với khuếch ñại ADN ñích khác PCR ña thành phần có ADN ñích khác nhiều kích thước thường ưu tiên khuếch ñại ADN ñích ngắn trước ADN ñích dài, kết có khác số lượng sản phẩm ñược khuếch ñại Tuy nhiên, khác ñáng kể nhiệt ñộ lai hay chiều dài ADN ñích tránh khỏi Người ta ñiều chỉnh quy trình thực ñể làm cân phản ứng ñạt ñược số lượng sản phẩm tương ñương ñiều chỉnh nồng ñộ mồi cân với phản ứng ña thành phần 9.5.7.4 PCR ARN ARN retrovirus ñược ly trích ñược chuyển ñổi thành cADN enzym mã ngược enzym phiên mã ngược, cADN ñược dùng làm khuôn mẫu cho PCR Tuy nhiên, phản ứng nhờ enzym phiên mã ngược khó thực việc sử dụng enzym không chịu ñược nhiệt 42oC bất lợi xảy lai không nghiêm ngặt Vì vậy, phiên mã ngược hiệu trở ngại làm cho phát ARN ñích nhạy ñặc hiệu Người ta ñã tìm ADN polymerase chịu nhiệt có hoạt tính enzym phiên mã ngược ñó ADN polymerase tái tổ hợp ñược trích từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus thermophilus (Tth pol) ADN polymerase chịu nhiệt hoạt ñộng hữu hiệu có diện ion Mn2+ Hỗn hợp phản ứng file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 198 of 203 PCR ARN bao gồm: Tth pol, loại mồi oligonucleotide (một ñược sử dụng cho tổng hợp cADN, ñược sử dụng cho PCR), ion mangan dạng MnCl2, tất thành phần khác cần cho phiên mã ngược PCR Máy chu kỳ nhiệt ñược ñun nóng trước ñến 70oC, thành phần phiên mã ngược ñược ủ 15 phút Sau phản ứng nhờ enzym phiên mã ngược, hỗn hợp phản ứng ñược nâng nhiệt ñộ lên 95oC ñể làm biến tính phức hợp ARN - ADN PCR sau ñó ñược bắt ñầu với chu kỳ 95oC 15 phút 60oC 20 giây, 38 chu kỳ 90oC 15 giây 60oC khoảng 20 giây Sự phiên mã ngược ñược thực 70oC ñộ ñặc hiệu ñộ nhạy việc phát ARN ñích cao 9.5.8 Các lĩnh vực ứng dụng PCR Trong nghiên cứu khoa học, PCR giúp cho việc xác ñịnh trình tự nucleotid ñoạn ADN ñược nhân lên; sử dụng PCR ñể tách dòng ñoạn ADN ñặc hiệu, nhiều trường hợp tách dòng không cần ñến PCR; giúp phát ñột biến, nghiên cứu mARN tạo ñột biến gen, cho phép phân tích liên kết gen từ tế bào riêng lẻ; giúp nghiên cứu trình tiến hoá mức phân tử Thậm chí giúp phục hồi gen cổ vật ñã tồn cách ñây hàng chục triệu năm Trong chọn giống vật nuôi trồng, ñặc biệt ñối với ñộng vật thực vật bậc cao, vốn trước ñây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống khó khăn, cần nhiều năm, PCR cho phép thực vài ngày, chí vài với hiệu cao Trong y học, PCR chẩn ñoán xác bệnh nhiễm trùng từ virut ñến vi khuẩn bệnh nấm, kể HIV - AIDS, chẩn ñoán sớm theo dõi ñiều trị ung thư Trong tư vấn di truyền y học, PCR cho phép chẩn ñoán nhanh, xác bệnh di truyền kể chẩn ñoán trước sinh giới tính dị tật bẩm sinh có từ thai ñược tuần tuổi ñiều quan trọng không cần chọc ối, cần lấy giọt máu ngoại vi mẹ ñể làm mẫu thí nghiệm Trong khoa học hình sự, PCR thiếu, giúp chẩn ñoán nhanh, xác thủ phạm từ vết máu khô, sợi tóc sinh phẩm ñó mà thủ phạm ñể lại trường Ngoài kỹ thuật cho phép xác ñịnh xác quan hệ huyết thống cha - con, ông - cháu v.v vài Trong bảo vệ môi trường, việc xác ñịnh mức ñộ ô nhiễm sinh học thực hiệu nhanh chóng phản ứng PCR Những ứng dụng thực tiễn ña dạng phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật vô tận Nếu năm 1985 có công trình ñược công bố PCR năm sau kỹ thuật ñược sử dụng hàng nghìn phòng thí nghiệm khắp giới Ngay nước ta, PCR ñã ñang ñược dùng nhiều trường ñại học, viện nghiên cứu ngày trở nên phổ biến Phản ứng chuỗi tổng hợp ADN thật ñã ñưa lại cách mạng lĩnh vực ứng dụng thực tế sinh học phân tử Ngày nói lĩnh vực nghiên cứu sinh học ñều sử dụng PCR Tóm tắt Chiết tách tinh chế ADN ñóng vai trò quan trọng nghiên cứu sinh học phân tử Các bước ñể chiết tách ADN phá vỡ tế bào, loại bỏ protein, tủa acid nucleic Tinh chế ADN áp dụng kỹ thuật siêu ly tâm sắc ký Nồng ñộ ADN ño quang kế bước sóng 260 nm, kích thước tương ñối ADN xác ñịnh kỹ thuật ñiện di gel ñối chiếu với thang file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 199 of 203 kích thước ñã biết Các thao tác cắt, nối lai ADN thao tác kỹ thuật di truyền phân tử Trình tự ADN xác ñịnh phương pháp hoá học (Maxam Gilbert) phương pháp enzym (Sanger cộng sự) Phương pháp Sanger ñã ñược cải tiến ñơn giản tự ñộng hoá Phương pháp PCR sử dụng enzym ADN polymerase máy luân nhiệt cho phép khuếch ñại in vitro acid nucleic lên gấp tỉ lần sau 30 - 40 chu kỳ vài Kỹ thuật có nhiều ưu ñiểm ñơn giản, nhanh nhạy nên ñược ứng dụng rộng rãi nghiên cứu khoa học, chẩn ñoán, khoa học hình sự, chọn giống CÂU HỎI Cách không dùng ñể tinh chế and? a) Sắc ký lực b) Sắc ký lọc gel c) Sắc ký trao ñổi ion vi cột d) Sắc ký lỏng hiệu cao e) Sắc ký khí Tốc ñộ ñiện di không phụ thuộc: a) Kích thước phân tử ADN b) Cấu dạng ADN c) Nồng ñộ ADN d) Nồng ñộ gel e) ðiện sử dụng Enzym cắt giới hạn loại ñược ứng dụng nhiều kỹ thuật tái tổ hợp di truyền a) I b) II c) III d) I III e) II III Yếu tố ảnh hưỏng ñến lai hoá: a) Nồng ñộ ADN b) Nhiệt ñộ thời gian phản ứng file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page c) ðộ dài trình tự Page 200 of 203 d) Lực ion e) Tất ðặc ñiểm không thuộc phương pháp ñịnh trình tự Sanger: a) Xử lý hoá học chuyên biệt làm biến ñổi ñặc trưng loại nucleotid b) Sử dụng ADN polymerase c) Nucleotid ñược ñánh dấu d) Phản ứng tiến hành bốn phân ñoạn e) Có sử dụng dideoxynucleotid Chất làm giảm nhiệt ñộ biến tính ADN PCR a) Formamid b) MgCl2 c) DMSO d) EDTA e) a c Mồi phản ứng PCR a) ðoạn ADN ngắn, mạch ñơn b) Có trình tự bổ sung với ADN khuôn ñiểm ñầu chép c) Dài từ - 30 nucleotid d) Là oligonucleotid e) Tất Tính nhiệt ñộ "chảy" ñoạn mồi nhằm xác ñịnh nhiệt ñộ thích hợp ñể a) Biến tính mồi b) Mồi gắn vào khuôn c) Tổng hợp từ khuôn gen d) Mồi không gắn bổ sung vào e) Mồi gắn vào ñoạn khác Chọn chu kỳ nhiệt PCR dựa vào yếu tố kích thước khuôn file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 201 of 203 a) ðộ tinh khiết khuôn b) Năng ñộ khuôn c) Kích thước mồi d) Trình tự mồi e) c d 10 PCR tổ: a) Dựa nguyên tắc phản ứng PCR b) Là hai PCR liên tiếp, sử dụng hai cặp mồi "ngoại" "nội" c) Có ñộ nhạy chuyên biệt cao PCR thường d) Ứng dụng chẩn ñoán e) Tất ñúng ðÁP ÁN Bài Nhập môn sinh học phân tử b e c e a Bài Sao chép ADN d b d e e e a b b 10 b Bài Các loại ARN e a a d b b e c d 10 e Bài Sự phiên mã mã di truyền e e e c e b c c e 10 a a a b Bài Sinh tổng hợp protein e d file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page d Page 202 of 203 e e d 10 c Bài ðiều hoà hoạt ñộng gen e e d b a e d e b 10 b Bài Bộ gen tế bào nhân thật b d e e e e e e e 10 e c e e d d e e d c 10 a Bài ðột biến gen Bài Các phương pháp phân tích ADN e c b e a e e b e 10 e TÀI LIỆU THAM KHẢO Benjamin Lewin, Genes VIII Prentice - Hall, 2004 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Sinh học phân tử NXB Giáo Dục, 1997 James Swarbrick, Pharmaceutical Gene Delivery Systems Marcel Dekker Inc New York, 2003 Lê ðình Lương Nguyên lý kỹ thuật di truyền NXB Khoa học Kỹ thuật, 2001 Phạm Thành Hổ Di truyền học NXB Giáo Dục, 1998 Richard A Harvey, Pamela C Champe Biochemistry 3rd ed Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, 2005 Richter, J D in Translational Control of Gene Expression (Hershey, J W B , Mathews, M B , and Sonenberg, N., eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2000 Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed., Vol 3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 Smith C A and Wood E J Molecular biology and Biotechnology Chapman & Hall, 1991 10 Tom Strachan and Andrew P Read Human Molecular Genetics Bios Scientific Publishers Ltd, 1996 file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009 New Page Page 203 of 203 Chịu trách nhiệm xuất bản: Chủ tịch HðQT kiêm Tổng Giám ñốc NGÔ TRẦN ÁI Phó Tổng Giám ñốc kiêm Tổng biên tập NGUYỄN QUÝ THAO Chịu trách nhiệm nội dung: Chủ tịch HðQT kiêm Giám ñốc Công ty CP Sách ðH − DN TRẦN NHẬT TÂN Biên tập sửa in: TRẦN NGỌC OANH Trình bày bìa: BÙI QUANG TUẤN Chế bản: THÁI SƠN SINH HỌC PHÂN TỬ Mã số: 7K721M7 − DAI In bản, (Qð: ) khổ 19 × 27 cm, Số ðKKH xuất bản: 770 − 2007/CXB/3 − 1676/GD In xong nộp lưu chiểu tháng 12 năm 2007 file://C:\Windows\Temp\nlddyqkdsp\sinh_hoc_phan_tu.htm 30/09/2009