Chuong 8 Cac ky thuat phan tich trong sinh hoc phan tu(1)

Chương Các kỹ thuật phân tích Sinh học phân tử 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • • • • • Để thu nhận DNA tinh cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein Sự tách chiết DNA dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hịa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích thu phân tử nucleic acid trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học Các nucleic acid cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh nằm thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dạng cặn tủa dễ bảo quản cần hịa lại nước theo nồng độ mong muốn 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân • Bước 2: loại protein • Bước 3: thu hồi nucleic acid 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • • • Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô hỗn hợp chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA mơi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA • Chất tẩy phân tử lưỡng cực, kết hợp với protein màng phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng • Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ Loại protein: lắc mẫu dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời khơng hịa tan nucleic acid Protein bị biến tính khơng hịa tan pha nước có chứa nucleic acid sau li tâm tủa thành lớp nằm pha nước pha phenol:chloroform Thu hồi nucleic acid pha nước Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme cần hịa lại nước theo nồng độ mong muốn Có thể tủa ethanol isopropanol Sau li tâm để thu nhận lại nucleic acid Cặn tủa rửa ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA Ly tâm phân đoạn (a) phân đoạn vùng (b) phân tách trình tự hỗn hợp dựa khối lượng chúng Thời gian lực ly tâm xác định cho nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng thấp phần tử cần phân tách 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA Ly tâm đẳng tỷ trọng (isopycnic) phân tách phần tử hỗn hợp dựa tỷ trọng chúng Thời gian lực ly tâm chung cho nhóm phần tử Dung dịch ly tâm có tỷ trọng với giá trị từ thấp đến cao tỷ trọng phần tử cần phân tách Ly tâm gradient liên tục CsCl: trình ly tâm, dung dịch CsCl tự động hình thành gradient đẳng tỉ trọng với tỉ trọng tăng dần từ miệng ống xuống đáy ống Dưới tác động lực ly tâm, nucleic acid di chuyển ống đến vị trí có tỉ trọng với tỉ trọng ngừng lại hình thành lớp cố định ống Lớp thu nhận lại sau ly tâm 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí RNA tổng số •Messenger RNA (mRNA): 1-5% Là mạch khn cho q trình sinh tổng hợp protein • Ribosomal RNA (rRNA): >80% Thành phần cấu trúc nên ribosom • Transfer RNA (tRNA): 10-15% Vận chuyển acid amino tương ứng với codon mRNA Tách chiết RNA Phương pháp sắc ký • Sắc ký lực: poly U-Sepharose hay oligodTcellulose, dùng để tinh mRNA • Sắc ký lọc gel dùng phân tách nucleic acid nucleotic tự sau q trình tạo mẫu dị (probe) đánh dấu • Sắc ký trao đổi ion vi cột để thu hồi lượng nhỏ DNA • Sắc ký lỏng hiệu suất cao: có độ phân giải cao, dùng tinh oligonucleotide tổng hợp, plasmid, phân tách đoạn DNA 24/03/2016 3:01 SA Nguyễn Hữu Trí Các phương pháp định tính định lượng thơ nucleic acid • Điện di gel – Agarose – Polyacrylamide • Quang phổ kế: đo mật độ quang (OD – Optical density) 24/03/2016 3:01 SA 10 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp điện di • Mục tiêu: • • • Định tính: diện, cấu hình phân tử, kích thước Định lượng: hàm lượng tương đối so với thang hàm lượng Chuẩn bị: thu hồi đoạn DNA (dùng tạo dịng, …) • Ngun tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc nucleic acid: tích điện âm đồng khắp bề mặt điện trường nên di chuyển cực dương điện trường • Tính linh động phân tử di chuyển điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử nồng độ chất cấu thành gel • Kiểu điện di: Agarose, điện di trường xung (PFGE - Pulse Field Gel Electrophoresis) 24/03/2016 3:01 SA 11 Nguyễn Hữu Trí Điện di - Electrophoresis • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 24/03/2016 3:01 SA 12 Nguyễn Hữu Trí Điện di gel • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di… • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel 24/03/2016 3:01 SA 13 Nguyễn Hữu Trí Chất nhộm gel - Stain 24/03/2016 3:01 SA 14 Nguyễn Hữu Trí Điện di gel agarose • • • • • Gel agarose loại gel thông dụng nhất, thường dùng để phân tách đoạn có kích thước 0,5-20 kb Điện di theo phương nằm ngang Độ phân giải thay đổi nồng độ agarose hay loại agarose thay đổi Phát phóng xạ tự ghi, nhuộm ethidium bromide Chất có khả gắn xen vào base nucleic acid phát huỳnh quang tia tử ngoại Ứng dụng: phát trình tự DNA, phân tích hỗn hợp trình tự DNA (Southern blot), chuẩn bị nguyên liệu 24/03/2016 3:01 SA 15 Nguyễn Hữu Trí Điện di gel polyacrylamide • Được dùng để tách đoạn có kích thước nhỏ, 1000 cặp base • Điện di theo phương thẳng đứng • Độ phân giải cao, phân biệt trình tự cách nucleotide • Phương pháp phát hiện: DNA – phóng xạ tự ghi, xanh methylene, ethidium bromide, protein – xanh Coomassie, nhuộm nitrate bạc • Ứng dụng: tinh oligonucleotic tổng hợp, giải trình tự DNA, tách trình tự DNA có kích thước gần nhau, SDS-PAGE (phân tích protein) 24/03/2016 3:01 SA 16 Nguyễn Hữu Trí Điện di chiều 24/03/2016 3:01 SA 17 Nguyễn Hữu Trí Điện di chiều 24/03/2016 3:01 SA 18 Nguyễn Hữu Trí Điện di chiều 24/03/2016 3:01 SA 19 Nguyễn Hữu Trí Điện di chiều 24/03/2016 3:01 SA 20 Nguyễn Hữu Trí 10 Northern Blot: RNA-DNA*(RNA*) • Sau E M Southern mơ tả phương pháp Southern blot vào năm 1975, Alwine dùng phương pháp tương tự để xác định đoạn RNA đặc biệt gọi Northern blot vào năm 1977 • Khơng cần phải cắt RNA restriction enzyme • Dùng formaldehyde để phá cầu nối Hydrogen biến tính RNA mạch đơn RNA tạo cấu trúc thứ cấp gấp cuộn 31 Northern blot • Northern blot bao gồm bước sau: Tách RNA (RNA tổng số mRNA) xử lý với formaldehyde RNA phân tách điện di gel agarose biến tính (có formaldehyde) RNA sau phân tách chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ ngun vị trí gel), thơng thường màng nitrocellulose dùng, nhiên dùng màng nylon tích điện dương RNA cố định màng lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có đánh dấu phóng xạ gắn với enzyme (alkalin phosphatase horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNADNA (hoặc RNA-RNA) sợi kép Vị trí mẫu dị phát nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi đánh dấu phóng xạ Trong trường hợp mẫu dò gắn với enzyme đem ủ với chất khơng màu Enzyme liên kết với biến đổi thành sản phẩm màu nhìn thấy phát ánh sáng mà phát phim X quang cách trực tiếp 24/03/2016 3:01 SA 32 Nguyễn Hữu Trí 16 Northern blot 24/03/2016 3:01 SA 33 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR • PCR (polymerase chain reaction-phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymease) phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp Kary Mullis phát minh vào năm 1985; giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1986 ông nhận giải thưởng Nobel Hố sinh học vào năm 1993 • Nguyên tắc phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động DNA polymerase: cần diện mồi chuyên biệt để hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Như vậy, ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA, ta tổng hợp đoạn DNA nằm hai mồi • Phương pháp PCR cho phép tổng hợp nhanh xác đoạn DNA riêng biệt Ðây thực phương pháp đại thuận tiện cho việc xác định có mặt gen tế bào với độ xác cao 24/03/2016 3:01 SA 34 Nguyễn Hữu Trí 17 Ba giai đoạn chu kỳ phản ứng PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn phân tử DNA mẫu bị biến tính nhiệt độ cao (thường từ 94-950C, lớn nhiệt độ nóng chảy phân tử) vòng 30 giây đến phút, tất liên kết hydro hai mạch phân tử bị bẻ gãy tạo thành DNA sợi đơn Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ hạ thấp ( thường từ 40-700C, thấp nhiệt độ nóng chảy mồi sử dụng khoảng từ 3-50C) cho phép mồi bám vào phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần khuyếch đại Giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến phút Giai đoạn kéo dài (elongation) Nhiệt độ tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt Công việc DNA polymerase di chuyển dọc theo DNA sợi đơn sử dụng làm khn để tổng hợp sợi DNA bổ sung với DNA mẫu cách kéo dài phần đánh dấu mồi Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào kích thước DNA mẫu, thường kéo 35 Nguyễn Hữu Trí 24/03/2016 3:01 SA dài từ 30 giây đến nhiều phút Các thành phần phản ứng PCR Primer (mồi): Mồi đoạn DNA sợi đơn ngắn cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với đầu DNA mẫu tạo vị trí bắt đầu tái Các mồi có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forward primer) mồi ngược (reverse primer)  Mồi tiêu quan trọng phản ứng PCR để định tính đặc trưng hiệu phản ứng Do việc thiết kế mồi cần tuân thủ số nguyên tắc định: dài khoảng 18-24 base; Tm mồi gần nhau; thành phần nucleotic mồi cần tránh cặp GC lặp lặp lại nhiều lần; mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại; khơng hình thành primer dimer, khơng phải trình tự lặp lại DNA mẫu (DNA template): hàm lượng đủ không cao, tinh – không chứa chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin, …) PCR cho kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay mẫu DNA không bảo quản tốt Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động Taq polymerase, hàm lượng cao tạo nhiều sản phẩm ký sinh, thấp làm giảm hiệu nhân enzyme Nồng độ tối ưu phải xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm  24/03/2016 3:01 SA 36 Nguyễn Hữu Trí 18 Các thành phần phản ứng PCR dNTP: thành phần loại dNTP phải cân bằng, cần làm tăng lỗi chép polymerase; hàm lượng thường khơng đổi thay đổi tùy điều kiện thực tế Enzyme polymerase chịu nhiệt Tag-polymerase DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần bán thị trường Tag-polymerase nhà Vi sinh vật học Thomas Brock phát Thermus aquaticus loài vi khuẩn phát triển mạnh nhiệt độ cao Enzyme chịu nhiệt giúp giải vấn đề enzyme biến tính sau chu kỳ Từ đến nay, số vi sinh vật chịu nhiệt khác khám phá người ta tách chiết thêm DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) Số lượng chu kỳ phản ứng tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu, thông thường số lượng chu kỳ nhỏ 40 cho phản ứng PCR Thời gian chu kỳ phụ thuộc thiết bị kích thước sản phẩm Thiết bị dụng cụ cho phản ứng PCR: cần đáp ứng nhu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh xác Những cải tiến máy luân nhiệt quan tâm đến microtiler plate 96 giếng, block nhiệt riêng biệt máy, block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR 24/03/2016 3:01 SA 37 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp PCR 5 3 Gene mục tiêu DNA gene 3 5 19 Biến tính 5 3 3 5 Bắt cặp Chu kỳ thu phân tử Primer Kéo dài nucleotide Phương pháp PCR Chu kỳ thu phân tử Chu kỳ thu phân tử Chu kỳ n thu 2n phân tử 20 Các ứng dụng phương pháp PCR    Hiện thành tựu PCR mở nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng sinh học, y khoa, nơng nghiệp, … Một số ứng dụng có tính tổng quát: Sản xuất mẫu dò: PCR giúp sản xuất nhanh lượng lớn mẫu dò đánh dấu thực phản ứng với cặp mồi chuyên biệt nucleotide đánh dấu Khuyếch đại số lượng RNA: sử dụng kĩ thuật phối hợp RT-PCR (kết hợp enzyme phiên mã ngược Taq polymerase; sử dụng Tth polymerase) RT-PCR cho phép nghiên cứu mRNA thông tin tồn với hàm lượng thấp, phát phương pháp cổ điển Northern blot, … Kĩ thuật in situ RT-PCR cho phép khuyếch đại RNA mô tế bào Định lượng phương pháp PCR: dùng để nghiên cứu trình tự RNA hay DNA có số lượng thấp Trình tự đích khuyếch đại đồng thời với trình tự chứng có nồng độ biết, sau phản ứng so sánh hàm lượng sản phẩm, suy số lượng mẫu ban đầu 24/03/2016 3:01 SA 41 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp giải trình tự (DNA sequencing) • Phương pháp xác định vị trí xếp nucleotid phân tử DNA – Phương pháp Maxam Gilbert – Phương pháp Sanger – Pyrosequencing – Array sequencing 21 Phương pháp Maxam Gilbert • Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Lần cơng bố vào năm 1977 • Nguyên tắc phương pháp dựa phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác • Trước hết, phân tử DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ mạch đơn, tạo đoạn đánh dấu phát hình phóng xạ • Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng loại nucleotide mạch DNA đánh dấu phóng xạ, tạo đoạn oligonucleotide có chiều dài nucleotide phát điện di Kết qủa phản ứng hóa học xử lí mạch DNA phát điện di gel polyacriamid xác định trình tự mạch đơn Phương pháp Maxam Gilbert Mạch đơn đánh dấu phóng xạ xử lí theo nhóm phản ứng - Nhóm phản ứng thứ xử lí mạch đơn DNA dimethyl sulphat làm đứt mạch G - Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA axit (pH=2) gây đứt mạch đơn A G - Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA hydrazin gây đứt mạch đơn T C - Nhóm phản ứng thứ xử lí mạch đơn DNA hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn C DMS FA G H G G H+S C A G T T G G G C A G C C C T C A A C C T 22 Phương pháp Maxam Gilbert G Mảnh dài G+A T+C C A Mảnh ngắn G 3′ A A G C A A C G T G C A G 5′ Trình tự đọc theo thứ tự từ lên (5′ - 3′) Phương pháp Sanger Nguyên lý: Sanger, Smith Coulson công bố vào năm 1977, dựa theo chế tổng hợp DNA Đã giải trình tự hồn chỉnh gen thực khuẩn thể X 174 Trong trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP) Do ddNTP nhóm OH (carbon số 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại Dideoxynucleotide dùng DNA sequencing 23 Phương pháp Sanger ddATP + four dNTPs ddA dAdGdCdTdGdCdCdCdG C ddCTP + four dNTPs dAdGddC dAdGdCdTdGddC dAdGdCdTdGdCddC dAdGdCdTdGdCdCddC G ddGTP + four dNTPs dAddG dAdGdCdTddG dAdGdCdTdGdCdCdCddG A Sự kéo dài kết thúc diện dideoxynucleotide T ddTTP + four dNTPs dAdGdCddT dAdGdCdTdGdCdCdCdG Phương pháp Sanger G Mảnh dài ddG Mảnh ngắn ddG A T C 3′ G G T A A A T C A T G 5′ Trình tự đọc theo thứ tự từ lên (5′ - 3′) 48 24 Giải trình tự máy tự động (Sequencer) • Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP Sanger cộng phát minh • Trong q trình tổng hợp DNA sử dụng mồi dNTP đánh dấu huỳnh quang, loại dNTP có màu khác • Máy tổng hợp mạch đơn mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết ABI 3100 Chromatogram Giải trình tự máy tự động (Sequencer) 5-50 25 ... rộng rãi lĩnh vực Sinh học phân tử Phương pháp Kary Mullis phát minh vào năm 1 985 ; giới thiệu lần Hội thảo lần thứ 51 Cold Spring Harbor vào năm 1 986 ông nhận giải thưởng Nobel Hố sinh học vào năm... μg/ml cho dung dịch DNA hay RNA sợi đơn Định tính: độ dựa tỉ số OD260/OD 280 , tính chất nucleic acid (mạch đơi/đơn) ( 280 nm bước sóng protein có mức độ hấp thụ cao • 24/03/2016 3:01 SA 21 Nguyễn... Hữu Trí RNA tổng số •Messenger RNA (mRNA): 1-5% Là mạch khn cho q trình sinh tổng hợp protein • Ribosomal RNA (rRNA): >80 % Thành phần cấu trúc nên ribosom • Transfer RNA (tRNA): 10-15% Vận chuyển