SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

ĐẠI ĐẠIHỌC HỌCQUỐC QUỐCGIA GIAHÀ HÀNỘI NỘI BÌA TRƯỜNG TRƯỜNGĐẠI ĐẠIHỌC HỌCKHOA KHOAHỌC HỌCTỰ TỰNHIÊN NHIÊN - Nguyễn NguyễnTiến TiếnLung Lung SỬ SỬDỤNG DỤNGKỸ KỸTHUẬT THUẬTFISH FISHĐỂ ĐỂKIỂM KIỂMTRA TRA SỰ SỰHỘI HỘINHẬP NHẬPCỦA CỦAGEN GENIL–6 IL–6PHÂN PHÂNLẬP LẬPTỪ TỪNGƯỜI NGƯỜI TRONG TRONGTẾ TẾBÀO BÀOGỐC GỐCPHÔI PHÔIGÀ GÀCHUYỂN CHUYỂNGEN GEN LUẬN LUẬNVĂN VĂNTHẠC THẠCSĨSĨKHOA KHOAHỌC HỌC Hà HàNội Nội– –2013 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Tiến Lung SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người sáng lập nên phịng thí nghiệm nơi học tập làm việc năm năm qua Trong ngày tháng ỏi làm việc thầy, học hỏi nhiều điều, khơng kiến thức, thao tác thực thí nghiệm mà kiên trì, tìm tịi, chịu khó Thầy truyền cho niềm đam mê nghiên cứu công nghệ tế bào động vật, đặc biệt lĩnh vực công nghệ tế bào gốc Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Lai Thành, người thầy hướng dẫn tơi thực khóa luận tốt nghiệp Đại học luận văn cao học Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc giúp tơi hồn thành nghiên cứu Trong q trình làm việc, tơi ln nhận lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để thực tốt nghiên cứu Khơng vậy, sống, tơi nhận giúp đỡ thầy Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên sinh viên phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt CN Đinh Duy Thành dẫn, giúp đỡ thời gian thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy công tác môn Sinh học Tế bào thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức sở để thực luận văn vận dụng công việc sau Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, nghiên cứu tơi thực dựa kinh phí hỗ trợ từ đề tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra hội nhập gen IL–6 phân lập từ người tế bào gốc phôi gà chuyển gen” TS Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Chủ nhiệm đề tài Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Nguyễn Tiến Lung Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1 CHUYỂN GEN Ở GÀ 1.1.1 Các phương thức chuyển gen vào tế bào 1.1.2 Các phương pháp tạo gà chuyển gen 1.1.3 Những ứng dụng gà chuyển gen 10 1.2 KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 12 1.2.1 Nguyên lý 12 1.2.2 Đầu dò cho phản ứng lai 13 1.2.3 Ưu điểm kỹ thuật FISH .18 1.2.4 Ứng dụng kỹ thuật FISH 19 1.3 INTERLEUKIN Ở NGƯỜI 22 1.3.1 Giới thiệu 22 1.3.2 Chức .23 1.3.3 Những ứng dụng lâm sàng .24 1.3.4 Gen mã hóa IL–6 người 25 Chương – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .26 2.1.1 Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 26 2.1.2 Dụng cụ vật tư tiêu hao .29 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 29 2.1.4 Hoá chất sử dụng 30 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH 32 2.2.2 Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người .34 2.2.3 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) 38 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .40 Nguyễn Tiến Lung i K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục 3.1 TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 40 3.1.1 Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 40 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 46 3.1.3 Kết tổng hợp đầu dò phản ứng PCR 49 3.2 THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI .50 3.2.1 Phân lập nhân nuôi tế bào gốc phôi gà 50 3.2.2 Thu nhận trì tế bào gốc phôi gà chuyển gen 52 3.2.3 Kiểm tra có mặt gen chuyển tế bào phản ứng PCR 54 3.3 KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs 55 3.4 THẢO LUẬN 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC A Nguyễn Tiến Lung ii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình Chu trình tái retrovirus cách thức sản xuất vector retrovirus Hình Mơ hình chuyển gen thông qua trung gian tế bào gà Hình Quy trình kỹ thuật FISH 12 Hình Cấu trúc số chất đánh dấu huỳnh quang thường sử dụng 14 Hình Vị trí nhiễm sắc thể nhân tế bào kỳ trung gian 19 Hình Kiểu nhân phổ nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy 21 Hình Một số ảnh hưởng IL–6 thể 23 Hình Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) Invitrogen 27 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32 Hình 10 Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi với cADN gen IL–6 42 Hình 11 Kết xác định vị trí tương đồng cADN mARN gen IL–6 43 Hình 12 Kết kiểm tra vị trí chèn gen IL–6 vector 44 Hình 13 Kết kiểm tra vị trí bắt cặp đầu dị vector 45 Hình 14 Kết kiểm tra khả bắt cặp đầu dò với hệ gen gà BLASTn 46 Hình 15 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi nồng độ ion Mg2+ tới hiệu suất phản ứng PCR 47 Hình 16 Kết giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR so sánh với trình tự đầu dị theo lý thuyết 48 Hình 17 Kết điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò 49 Hình 18 cESCs 24 nuôi cấy in vitro sau phân lập 51 Hình 19 cESCs ni cấy lớp tế bào nuôi 52 Hình 20 Đánh giá ảnh hưởng lentivirus tới sinh trưởng cESCs 53 Hình 21 Kết phân tích PCR mẫu tế bào chuyển gen 54 Hình 22 Kết phân tích PCR mẫu tế bào qua lần cấy chuyển 55 Hình 23 Kết lai FISH tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 56 Nguyễn Tiến Lung iii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng Một số chất đánh dấu huỳnh quang thuốc nhuộm sử dụng FISH 15 Bảng Vai trò số yếu tố vector pLenti6/V5–DEST Gateway 28 Bảng Dụng cụ vật tư tiêu hao sử dụng đề tài 29 Bảng Các thiết bị nghiên cứu sử dụng đề tài 29 Bảng Các hóa chất sử dụng đề tài 30 Bảng Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp mồi IL–6 33 Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs 35 Bảng Thành phẩn phản ứng PCR phát gen chuyển tế bào 37 Bảng Kết thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 41 Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iv Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu chữ viết tắt BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine serum albumin cESCs Chicken Embryonic Stem Cells cADN Complementary ADN CMV Cytomegalovirus DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole DIG Digoxigenin DNase Deoxyribonuclease EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum FISH Fluorescence in situ hybridization HIV Human Immunodeficiency Virus IL–6 Interleukin – LTR Long Terminal Repeats NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PGCs Primordial germ cells RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline – sodium citrate buffer SSCs Spermatogonial Stem Cells Ta Annealing template Tm Melting temperature Nguyễn Tiến Lung v K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu MỞ ĐẦU Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất loại protein dược phẩm hướng quan tâm từ lâu Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen ý đến với số lợi vượt trội so với động vật có vú thời gian tạo dịng ngắn, trứng có mơi trường vơ trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,… Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp người nghiên cứu tạo từ gà chuyển gen, số sản phẩm bước vào giai đoạn thử nghiệm kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng interferon α–2a có thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu Những nghiên cứu gà chuyển gen gần tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua tế bào gốc phôi, với ưu điểm lựa chọn từ đầu tế bào mang gen chuyển mong muốn trước tiêm chúng vào phơi nhận, tiết kiệm thời gian chi phí cho q trình sàng lọc thể chuyển gen từ bố mẹ khảm Để tạo động vật chuyển gen hiệu cần phải có hệ thống vector đủ mạnh để chuyển gen mong muốn với hiệu suất cao, trì ổn định thể vật chủ Hệ thống sử dụng thường xuyên dựa vào retrovirus (virus ARN) sử dụng enzyme thân máy phiên mã tế bào chủ để chép hệ gen chúng, sau tích hợp vào nhiễm sắc thể vật chủ trình phân bào Gần đây, nhóm nhỏ retrovirus lentivirus coi công cụ hứa hẹn chuyển gen Chúng mang đầy đủ ưu điểm retrovirus, cịn có khả chèn gen vào tế bào không phân chia, loại vector đặc biệt hiệu tế bào gốc phôi loại tế bào khó chuyển gen phương pháp khác Trong trình tạo động vật chuyển gen, bước sàng lọc tế bào hay thể mang gen mong muốn đóng vai trị quan trọng Gen chuyển cần cài vào ADN nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho hệ sau qua đường sinh sản hữu tính, đồng thời phải trì bền vững qua nhiều hệ động vật Ngồi ra, Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm