KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG CÁC BỆNH PHẨM KHÁC NHAU - KHẢO SÁT TRỰC TIẾP

Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác KHẢO SÁT TRỰC TIẾP Mục tiêu • Sử dụng có hiệu phương tiện khảo sát trực tiếp xét nghiệm vi sinh lâm sàng mẫu bệnh phẩm khác nhờ biết loại khảo sát trực tiếp thực phòng thí nghiệm lâm sàng công dụng loại, nhờ • Phúc trình kết khảo sát trực tiếp đồng thời tham vấn cho lâm sàng ý nghóa hữu dụng lâm sàng mà kết khảo sát trực tiếp nhờ biết vai trò ý nghóa khảo sát trực tiếp xét nghiệm vi sinh lâm sàng • Tránh trường hợp phải làm khảo sát trực tiếp cách vô ích – chí cho thông tin sai lạc đến lâm sàng, không bỏ sót trường hợp cần thiết phải làm khảo sát trực tiếp ý nghóa hữu dụng mà kết khảo sát trực tiếp mang lại cho lâm sàng biết trường hợp bệnh phẩm cần phải làm khảo sát trực tiếp, trường hợp bệnh phẩm không thật cần khảo sát trực tiếp Các phương pháp khảo sát trực tiếp Soi tươi √ Qua kính hiển vi thường - Soi tươi không cần nền, phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đóng bớt tụ quang, với bệnh phẩm đặt giọt nước muối sinh lý lame kính, treo hay ép lamelle Phương pháp nầy dùng để xem di động vi khuẩn - Soi tươi cần nền, phương pháp soi tươi qua kính hiển vi đóng bớt tụ quang với bệnh phẩm đặt giọt dung dòch màu làm dung dòch mực tàu; nigrosin; methylene blue, lame kính, ép lamelle Phương pháp nầy dùng xem nang vi khuẩn, hay tìm nấm men có bệnh phẩm Cryptococcus neoformans dòch não tuỷ 119 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác √ Qua kính hiển vi đen hay đảo phase - Qua kính hiển vi đen, mục đích thông thường xem hình dạng di động vi khuẩn có bệnh phẩm đặt giọt nước muối sinh lý lame kính ép lamelle Phương pháp dùng để tìm xoắn khuẩn giang mai, vi khuẩn leptospira, hay khảo sát di động vi khuẩn - Qua kính hiển vi đảo phase, mục đích thông thường xem nang vi khuẩn S pneumoniae, hay tìm nấm men có bệnh phẩm Cryptococcus neoformans dòch não tuỷ Nhuộm √ Nhuộm Gram, phương pháp nhuộm thông thường phòng thí nghiệm vi sinh Phương pháp nhuộm Gram cho phép xác đònh hình dạng, cách xếp, phân biệt vi khuẩn thuộc loại Gram [+] hay Gram [-] √ Nhuộm đơn Methylene blue kiềm, phương pháp hay dùng để nhuộm khảo sát có diện vi khuẩn Corynebacteria hay không phương pháp nầy cho phép nhuộm vi khuẩn hạt biến sắc có vi khuẩn √ Nhuộm kháng acid, phương pháp hay dùng để nhuộm phát vi khuẩn kháng acid Mycobacteria √ Phương pháp nhuộm huỳnh quang, phương pháp nhuộm vi khuẩn phẩm màu huỳnh quang, áp dụng cho số trường hợp nhuộm huỳnh quang rhodamin phết đàm tìm vi khuẩn lao √ Phương pháp nhuộm kháng thể đặc hiệu đánh dấu men hay đánh dấu huỳnh quang, phương pháp phát trực tiếp vi sinh vật muốn tìm có bệnh phẩm nhờ kháng thể đặc hiệu kháng nguyên vi sinh vật đánh dấu men (phát qua quan sát kính hiển vi thường) hay huỳnh quang (phát qua quan sát kính hiển vi huỳnh quang) √ Các phương pháp nhuộm khác, nhuộm nang, flagella, spore…chỉ dùng trường hợp đặc biệt 120 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Vai trò ý nghóa khảo sát trực tiếp Cho kết sớm, gần chung Có kết khảo sát trực tiếp giúp bác só lâm sàng phòng thí nghiệm nghó đến tác nhân gây bệnh với xác gần 99%, ví dụ: √ Kết khảo sát trực tiếp dòch não tuỷ thấy có song cầu Gram [-]; nghó đến tác nhân N meningitidis, thấy song cầu Gram [+] hình mũi giáo; nghó đến S pneumoniae, hay thấy trực khuẩn Gram [-] nhỏ; nghó đến H influenzae… √ Kết soi tươi mủ niệu đạo từ đàn ông thấy có song cầu Gram [-]; nghó đến tác nhân N gonorrhoeae… √ Kết soi tươi dòch não tuỷ thấy có nấm men có nang; nghó đến tác nhân nấm men C neoformans… √ Kết khảo sát trực tiếp phết quệt cổ tử cung phát C trachomatis phương pháp nhuộm kháng thể huỳnh quang đặc hiệu C trachomatis dương tính đủ để kết kuận bệnh nhân bò nhiễm vi khuẩn Các kết có giá trò giúp cho bác só điều trò chọn kháng sinh điều trò ban đầu, giúp phòng thí nghiệm biết hướng phân lập; đònh danh; kháng sinh đồ xét nghiệm cấy phân lập Cho kết sớm gợi ý Rất nhiều kết khảo sát trực tiếp, biết tận dụng, bác só lâm sàng có hướng điều trò ban đầu phòng thí nghiệm có hướng phân lập đònh danh, ví dụ: √ Khảo sát trực tiếp nước tiểu, thấy có vi khuẩn/quang trường x100, nghó bệnh nhân bò nhiễm trùng tiểu chọn lựa kháng sinh điều trò bước đầu tùy theo hình ảnh Gram vi khuẩn diện mẫu √ Khảo sát phết nhuộm Gram mẫu mủ, hay abcess, hình ảnh vi khuẩn thấy bệnh phẩm qua phết nhuộm Gram gợi ý tác nhân vi khuẩn gây bệnh, nhờ bác só lâm sàng có hướng điều trò ban đầu phòng thí nghiệm có hướng phân lập đònh danh… 121 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Cho kết đánh giá mẫu có tin cậy để nuôi cấy phân lập hay không, cho kết gợi ý √ Làm phết Gram mẫu đàm, quan sát quang trường x100, đánh giá mẫu tin cậy hay không để tiếp tục thực trình nuôi cấy phân lập √ Cũng qua phết nhuộm Gram mẫu đàm, mẫu tin cậy, tiếp tục qua quang trường x1.000 để quan sát hình ảnh Gram vi khuẩn diện, kết nầy có giá trò gợi ý cho phòng thí nghiệm hướng phân lập vi khuẩn gây bệnh, bác só có hướng dùng kháng sinh điều trò ban đầu Có trường hợp mẫu không cần phải làm khảo sát trực tiếp √ Mẫu quyệt họng, yêu cầu tìm vi khuẩn bạch hầu không cần thiết phải làm khảo sát trực tiếp khác biệt mẫu không bêänh với mẫu bệnh √ Mẫu phân, yêu cầu tìm Campylobacter, V cholerae không cần thiết phải làm khảo sát trực tiếp Câu hỏi ôn tập Cho biết phương pháp khảo sát trực tiếp công dụng phương pháp này? Cho biết vai trò ý nghóa kết khảo sát trực tiếp lâm sàng? Nêu ví dụ cụ thể Cho biết trường hợp không thiết phải làm khảo sát trực tiếp, trường hợp bắt buộc phải làm khảo sát trực tiếp trước tiến hành nuôi cấy phân lập? Tại sao? 122 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác A B C D Hình 34: Soi tươi nhiều có giá trò xét nghiệm vi sinh lâm sàng: (A) Một phết soi tươi dòch não tuỷ giọt mực tàu cho hình ảnh có giá trò để chẩn đoán viêm màng não Cryptococcus neoformans (B) Phết soi tươi qua kính hiển vi đen giọt môi trường EMJH cấy máu bệnh nhân cho kết giúp kết luận mẫu cấy có vi khuẩn Leptospira (C) Phản ứng phồng nang (quellung reaction) dùng đònh type S pneumoniae đọc kết qua phết soi tươi giọt nigrosin (D) Soi tươi giọt môi trường chai cấy máu qua kính hiển vi đảo phase với hình ảnh giúp sớm nhận biết chai cấy máu [+] trực khuẩn 123 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác NHUỘM GRAM Mục tiêu • Nhận đònh kết nhuộm Gram tốt hay có vấn đề mặt kỹ thuật nhờ biết rõ nguyên tắc phương pháp nhuộm Gram • Thực tốt kỹ thuật nhuộm Gram mẫu bệnh phẩm khác nhờ nắm vững bước thực hành kỹ thuật nhuộm Gram • Tránh yếu tố kỹ thuật làm sai lệch kết nhuộm Gram biện luận kết nhuộm Gram có vấn đề mặt kỹ thuật nhờ biết yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng lên kết nhuộm Gram Nguyên tắc Do khác biệt cấu trúc vách tế bào nên trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram [+] giữ phức hợp tím Gentian-iode không bò tẩy màu alcool, vi khuẩn Gram [-] không giữ phức hợp màu này, kết sau nhuộm vi khuẩn Gram [+] giữ màu tím gentian, vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng phẩm màu safranin hay fuchsin Bộ thuốc nhuộm Gram Để nhuộm Gram, cần phải có thuốc nhuộm Gram gồm lọ thuốc thử sau: Lọ thuốc nhuộm Gram dung dòch tím gentian Lọ lugol dung dòch iode Lọ alcool 95% Lọ safranin chứa dung dòch safranin Bộ thuốc nhuộm Gram chứa chai sẫm màu, nắp vặn chặt, giữ tối nhiệt độ phòng 124 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Phương pháp thực Trước hết làm phết mỏng bệnh phẩm hay vi khuẩn lame kính, để khô tự nhiên, sau gắn lame cách hơ nhanh qua lửa đèn cồn hay đèn bunsen lần Lưu ý hơ nhẹ lửa để lam ấm lên vừa phải không làm lame bò nóng làm biến thể hình dạng vi khuẩn Đặt lame giá nhuộm, cho vài giọt thuốc nhuộm Gram (crystal violet = tím gentian) phủ trùm lên phết vi khuẩn, để yên phút Sau cầm lame lên rửa màu thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Đặt lame trở lại giá nhuộm, cho tiếp vài giọt lugol (iode) phủ trùm tiếp lên phết vi khuẩn, để yên phút Sau cầm lame lên rửa lugol thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Tẩy màu cách nhỏ lên góc lame nhuộm dung dòch alcool 95% giọt alcool rời khỏi lame màu Sau cầm lame lên rửa alcool khỏi lame vòi nước máy chảy nhẹ Để lại lame giá nhuộm phủ vài giọt safranine lên phết nhuộm, để yên phút Sau cầm lame lên rửa safranin thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Thấm khô lame cách ép lame tờ giấy thấm Để khô lame hoàn toàn không khí Sau nhỏ giọt dầu soi kính lên phết nhuộm quan sát qua kính hiển vi, trước hết vật kính x10 để tìm vùng phết bệnh phẩm, sau xoay sang vật kính ×100 (vật kính dầu) để quan sát hình thái cách ăn màu vi khuẩn Đọc kết Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, vật kính dầu, thấy vi khuẩn Gram[+] ăn màu tím, vi khuẩn Gram[-] ăn màu hồng Khi trả lời kết nhuộm Gram, phải trả lời chi tiết sau: √ Hình dáng vi khuẩn √ Cách xếp vi khuẩn √ Cách ăn màu vi khuẩn, tức vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-] 125 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Các sai lầm gặp phương pháp nhuộm Gram Có sai lầm phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram [+] nhuộm thành màu hồng vi khuẩn Gram [-], là: √ Phết vi khuẩn lứa cấy gìa, 24 giờ, lúc cấu trúc vách vi khuẩn không bền chặt cấu trúc vách vi khuẩn Gram [+] lứa cấy trẻ, khả ngăn cản tẩy màu Alcool √ Dung dòch lugol không tốt pha lâu iodine, nhận biết trường hợp dung dòch lugol không sậm màu √ Tẩy màu alcool lâu làm cho vi khuẩn Gram [+] cuối bò tẩy màu, hay dùng lộn chai tẩy màu alcool acid phương pháp nhuộm kháng acid Có sai lầm phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram [-] nhuộm thành màu tím vi khuẩn Gram [+], là: √ Phết vi khuẩn dày làm cho alcool tẩy màu toàn vi khuẩn phết nhuộm √ Tẩy alcool thời gian ngắn hay dung dòch alcool bò pha loãng làm cho màu Gram không tẩy khỏi tế bào vi khuẩn Ngoài có sai lầm kỹ thuật mà thường gặp, sau phủ Gram, không rửa màu thừa lame phủ lugol phết nhuộn màu Gram thừa bò tủa lại bám bề mặt phết nhuộm Kết nhìn qua kính hiển vi thấy nhiều tinh thể màu Gram bám phết nhuộm làm lầm tưởng hình ảnh vi nấm Câu hỏi ôn tập Cho biết nguyên tắc phương pháp nhuộm Gram Phương pháp tiến hành nhuộm Gram nào? Kết ăn màu vi khuẩn sau giai đoạn nhuộm nào? Cho biết cách trả lời kết phết nhuộm Gram vi khuẩn Cho biết sai lầm thường gặp phương pháp nhuộm Gram hậu sai lầm 126 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác 1a Phủ thuốc nhuộm Gram 1’ 1b Rửa màu Gram nước máy 2a Phủ dung dòch lugol 1’ 2b Rửa lugol nước máy 3a Tẩy màu alcool giọt alcool rơi khỏi lam hết màu 3b Rửa alcool nước máy 4a Phủ thuốc nhuộm safranin 1’ 4b Rửa safranin nước máy 3b Thấm khô lame hai tờ giấy thấm Hình 35: Hình vẽ mô tả giai đoạn tiến hành phương pháp nhuộm Gram Hình 36: Một thuốc nhuộm Gram đầy đủ 127 Hình 37: Kết nhuộm Gram Gram [+] ăn màu tím, Gram [-] ăn màu hồng Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác NHUỘM METHYLENE BLUE KIỀM Mục tiêu • Sử dụng hiệu phương pháp nhuộm nhuộm methylene blue kiềm, đặc biệt phát vi khuẩn Corynebacterium diphthriae mẫu quệt hầu họng nhờ biết nguyên tắc mục đích phương pháp nhuộm • Thực tốt kỹ thuật nhuộm đơn nhờ nắm vững bước thực hành kỹ thuật nhuộm methylene blue kiềm Nguyên tắc Methylene blue làm kiềm hoá nhuộm hạt biến sắc trực khuẩn Corynebacteria, đặc biệt trực khuẩn bạch hầu Do nhuộm methylene blue kiềm mục đích dùng để nhuộm đơn, nhuộm sau nhuộm kháng acid, có mục đích nhuộm phết bệnh phẩm quệt hầu họng để phát Corynebacterium diphtheriae Bộ thuốc nhuộm methylene blue kiềm Để nhuộm methylene blue kiềm, cần có chai thuốc nhuộm methylene blue kiềm chứa chai sẫm màu, nắp vặn chặt, giữ tối nhiệt độ phòng Phương pháp thực Trước hết làm phết mỏng bệnh phẩm hay vi khuẩn lame kính, để khô tự nhiên, sau gắn lame cách hơ nhanh qua lửa đèn cồn hay đèn bunsen lần Lưu ý hơ nhẹ lửa để lame ấm lên vừa phải không làm lame bò nóng làm biến thể hình dạng vi khuẩn Đặt lame giá nhuộm, cho vài giọt thuốc nhuộm methylene blue kiềm phủ trùm lên phết vi khuẩn, để yên phút Sau cầm lame lên rửa màu thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Thấm khô lame cách ép lame tờ giấy thấm Để khô lame hoàn toàn không khí Sau nhỏ giọt dầu soi kính lên phết nhuộm quan sát qua kính hiển 128 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác vi, trước hết vật kính x10 để tìm vùng phết bệnh phẩm, sau xoay sang vật kính ×100 (vật kính dầu) để quan sát hình thái cách ăn màu vi khuẩn Đọc kết Tế bào vi khuẩn bắt màu xanh biển nhạt, hạt biến sắc bắt màu tím đen (xem Hình 21A) Hình 38: Một chai nhựa sẫm màu chứa bên thuốc nhuộm alkaline methylene blue 129 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác NHUỘM KHÁNG ACID Mục tiêu • Tránh sai sót kỹ thuật có thực hành nhuộm kháng acid nhờ biết nguyên tắc phương pháp nhuộm kháng acid, biết phương pháp nhuộm kháng acid, khâu đònh tính xác kết để • Thực tốt kỹ thuật nhuộm kháng acid nhờ nắm vững bước thực hành kỹ thuật nhuộm • Biện luận kết phương pháp nhuộm kháng acid đặc biệt phết nhuộm có sơ sót xãy nhờ biết sơ sót kỹ thuật xãy thực hành phương pháp nhuôm kháng acid Nguyên tắc Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên nhuộm phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp không bò tẩy màu dung dòch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid) Tuy nhiên để phức hợp màu thấm xuyên qua lớp vỏ sáp vi khuẩn, có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dòch màu carbolfuchin, nhờ mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen (2) Phương pháp thứ hai phương pháp nhuộm lạnh gọi phương pháp Kinyoun, phương pháp người ta dùng dung dòch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ phủ dung dòch màu đậm đặc lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn Bộ thuốc nhuộm kháng acid Để nhuộm kháng acid, cần phải có thuốc nhuộm kháng acid gồm lọ thuốc thử sau: Lọ thuốc nhuộm carbolfuchsin dung dòch basic fuchsin với phenol, pha đậm đặc để dùng cho phương pháp nhuộm lạnh Lọ alcool-acid với alcool 70% acid chlohydric 3% Lọ methylene blue chứa dung dòch màu methylene blue 130 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Bộ thuốc nhuộm kháng acid chứa chai sẫm màu, nắp vặn chặt, giữ tối nhiệt độ phòng Phương pháp thực Phương pháp trình bày sau phương pháp nhuộm lạnh, với bước sau: Trước hết làm phết mỏng bệnh phẩm hay vi khuẩn lame kính, để khô tự nhiên, sau gắn lame cách hơ nhanh qua lửa đèn cồn hay đèn bunsen lần Đặt lame giá nhuộm, cho vài giọt thuốc nhuộm carbolfuchsin phủ trùm lên phết vi khuẩn, để yên phút Sau cầm lame lên rửa màu thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Tẩy màu cách nhỏ góc lame nhuộm dung dòch alcool acid giọt alcool rời khỏi lame màu Sau rửa alcool acid khỏi lame vòi nước máy chảy nhẹ Để lại lame giá nhuộm phủ vài giọt methylene blue lên phết nhuộm, để yên phút Sau cầm lame lên rửa methylene blue thừa dính lame vòi nước máy chảy nhẹ Thấm khô lame cách ép lame tờ giấy thấm Để khô lame hoàn toàn không khí Sau nhỏ giọt dầu soi kính lên phết nhuộm quan sát qua kính hiển vi, trước hết vật kính x10 để tìm vùng phết bệnh phẩm, sau xoay sang vật kính ×100 (vật kính dầu) để quan sát tìm trực khuẩn kháng acid Đọc kết Quan sát phết nhuộm kháng acid qua kính hiển vi, vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid ăn màu đỏ cánh sen, vi khuẩn thường khác tế bào biểu mô hay bạch cầu ăn màu xanh methylene blue Khi trả lời kết nhuộm kháng acid, không kết luận dương tính M tuberculosis mà trả lời có diện trực khuẩn kháng acid Riêng mẫu đàm, cần quan sát dòng, dòng quan sát khoảng 100 quang trường (QT) dầu, ghi nhận kết theo bảng để trả lời phiếu trả lời kết quả: 131 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Bảng 5: Cách ghi kết quan sát phết nhuộm kháng acid mẫu đàm Số trực khuẩn kháng acid /số quang trường Cách ghi kết 1-2/300 QT (3 dòng) +/- 1-9/100 QT (1 dòng) 1+, số trung bình/100 QT 1-9/10 QT 2+, số trung bình/10 QT 1-9/1 QT 3+, số trung bình/1QT >9/1 QT 4+, >9/QT Các sai lầm kỹ thuật gặp phương pháp nhuộm kháng acid Phết nhuộm dày làm alcool acid tẩy hết màu carbolfuchsin, trực khuẩn không kháng acid ăn màu đỏ cánh sen Tuy nhiên phân biệt vi khuẩn kháng acid quan sát màu vùng nhầy hay tế bào biểu mô hay bạch cầu chung quanh màu đỏ chứng tỏ màu không bò tẩy hết Ngoài ra, trực khuẩn hình dạng tiêu biểu trực khuẩn kháng acid: mập, không mãnh khảnh trực khuẩn kháng acid thực Màu carbolfuchsin bò cặn, đóng lên phết nhuộm làm alcool acid tẩy hết màu vi khuẩn thường nhuộm màu đỏ cánh sen Để tránh tính trạng này, phải thường xuyên lọc màu qua giấy lọc kiểm tra nhỏ màu carbolfuchsin lên lame trống thấy có cặn sau đổ bỏ carbolfuchsin khỏi lame Thời gian phủ màu carbolfuchin ngắn không đủ phút, hay dùng carbolfuchsin pha cho phương pháp nhuộm nóng để nhuộm lạnh, trực khuẩn kháng acid không bắt màu carbolfuchsin Để tránh sai lầm trên, nên nhuộm kiểm tra chất lượng trước lot thuốc nhuộm pha đònh kỳ tháng lần lot thuốc nhuộm sử dụng 132 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Câu hỏi ôn tập Cho biết nguyên tắc phương pháp nhuộm kháng acid Có phương pháp tiến hành nhuộm kháng acid? Phương pháp nhuộm lạnh tiến hành nào? Kết ăn màu vi khuẩn sau giai đoạn nhuộm? Cho biết cách trả lời kết phết nhuộm kháng acid mẫu đàm Cho biết sai lầm thường gặp phương pháp nhuộm kháng acid hậu sai lầm Hình 39: Một thuốc nhuộm kháng acid hoàn chỉnh bao gồm chai carbol fuchsin, chai alcool acid, chai methylene blue A B C D Hình 40: Một số hình ảnh quan sát qua kính hiển vi thấy có trực khuẩn kháng acid (A) phết nhuộm kháng acid làm từ khúm vi khuẩn M tuberculosis, (B) Mẫu đàm tập trung nhất; (C) Mẫu đàm thấy nhiều M avium; (D) Mẫu đàm không tập trung 133 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác Sản phẩm liên quan SPUTAPREP Bộ thuốc thử nhất, loại trừ tạp nhiễm tập trung đàm Nguyên tắc hoạt động Nhờ tác dụng dung dòch kiềm có chứa N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) mà chất nhầy có đàm bò làm tan hoàn toàn đồng thời vi khuẩn tạp nhiễm đàm bò pH kiềm ly giải Sau đó, mẫu đàm loại trừ tạp nhiễm trung hoà lại đệm phosphate, cuối cặn đàm tập trung ly tâm Cặn đàm tập trung nhiều Mycobacteria để sẵn sàng cho nuôi cấy, khảo sát trực tiếp, hay làm ly trích DNA cho thử nghiệm PCR Trình bày SPUTAPREP gồm thành phần sau: N-Acetyl-L-Cysteine (NALC) bột nguyên chất chứa tube Eppendorf nhỏ, tube chứa NALC đủ dùng cho xử lý mẫu đàm Dung dòch MUCOPREP có sodium citrate NaOH, 50ml chứa lọ nắp vặn chặt Lượng dung dòch nầy đủ dùng cho xử lý 10 mẫu đàm Dung dòch đệm phosphate đậm đặc 10 lần, 5ml, chứa tube 5ml, nắp vặn chặt Bộ thuốc thử SPUTAPREP chưa dùng hay sau dùng nên giữ tủ lạnh 4oC ngày hết hạn ghi hộp (2 năm sau ngày sản xuất) Qui trình nhất, loại trừ ngoại nhiễm tập trung mẫu đàm với SPUTAPREP Trước hết, pha loãng đệm phosphate 10X với 45ml nước cất vô trùng để có 50ml đệm phosphate 1X Giữ đệm phosphate 1X nầy lọ trữ tủ lạnh 4oC Để xử lý mẫu đàm, chuẩn bò tube ly tâm 15ml nắp vặn Cho vào tube 10ml MUCOPREP toàn bột NALC từ tube Eppendorf Lắc nhẹ cho tan NALC MUCOPREP, chia 5ml dung dòch nầy vào tube 15ml khác, có tube, 134 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh phẩm khác tube có 5ml để xử lý cho hai mẫu đàm Dung dòch NALC dùng ngày, không lưu lại cho ngày sau Cho tối đa 5ml đàm vào tube 15ml chưa 5ml NALC Lắc đều, hay vortex vòng vài phút cho tan hoàn toàn đàm Sau cho thêm 5ml đệm phosphate lần Lắc nhẹ để trộn Ly tâm với máy ly tâm bàn tốc độ tối đa (4.000 RPM) 15 phút Đổ bỏ phần nước nổi, chừa khoảng 0.5ml cặn Cặn dùng làm phết nhuộm kháng acid, cấy vào môi trường cấy lao (Lownstein Jensen hay Bactec), hay để ly trích DNA cho PCR lao Hình 41: Hai thuốc thử nhất, loại trừ tạp nhiễm tập trung đàm thường dùng thành phần bên Bộ SPUTAPREP-LJ dành cho xử lý mẫu đàm cấy môi trường Loweinstein Jensen hay làm PCR Bộ SPUTAPREP-OGW dành cho xử lý mẫu đàm cấy môi trường Ogawa 135 [...]... kết luận là dương tính M tuberculosis mà chỉ trả lời có hiện diện trực khuẩn kháng acid Riêng đối với mẫu đàm, cần quan sát 3 dòng, mỗi dòng quan sát khoảng 100 quang trường (QT) dầu, ghi nhận kết quả theo bảng dưới đây để trả lời trên phiếu trả lời kết quả: 131 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau Bảng 5: Cách ghi kết quả quan sát phết nhuộm kháng acid một mẫu đàm Số trực khuẩn