Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành

Khối lượng phân tử: [21] Khối lượng phân tử của urease được nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m và so sánh với các protein đã biết tr

1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5): [31, 35, 44]

Urease có tên hệ thống là carbamine amideohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình thủy phân urea thành ammoniac và khí cacbonic Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase (enzyme thủy phân) [35]

Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước

quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong đó:

- Số 3: chỉ nhóm chính, là nhóm hydrolase

- Số 5: chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên

liên kết C-N, khác liên kết peptid

- Số 1: chỉ phân nhóm phụ cắt các amid

Urease là enzyme lần đầu tiên được J.B.Sumner tách

chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean_Canavalia ensiformis)

vào năm 1926 Và chính công trình nghiên cứu này đã đạt

giải Nobel vào năm 1946 đồng thời cũng đăït nền tảng đầu

tiên cho các công trình nghiên cứu về urease sau này [31]

Hình1.2: Tinh thể urease được

J.B.Summer chiết tách và kết tinh [31]

1.1.1 Khối lượng phân tử: [21]

Khối lượng phân tử của urease được nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m và so sánh với các protein đã biết trước khối lượng phân tử Kết quả cho thấy urease từ đậu nành có 2 peak ứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khi đó urease từ jack bean chỉ xuất hiện 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da

Hình 1.3: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [21]

Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau và ngay cả trong cùng một nguồn là đậu nành, có tới 2 loại urease Hai loại urease này khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không thay đổi

Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid amin Thành phần các acid amin này không giống nhau ở những nguồn khác nhau đã giải thích cho sự khác nhau về khối lượng phân tử như đã nói ở trên

Bảng 1.1: Thành phần amino acid của soybean và jack bean urease [21]

a: Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát

b: Dữ liệu để so sánh (do Staples và Reithel khảo sát)

1.1.2 Trung tâm hoạt động: [23, 26, 30]

Theo [23] thì trung tâm hoạt động của urease có chứa 2 nguyên tử Ni Mỗi nguyên tử Ni này được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và 1 nhóm carboxylate, 1 phân tử H2O (hình 1.4) Và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò rất quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease Đó cũng chính là lí do mà

urease còn được gọi là “Nikel dependent enzyme”

Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease (Ni: 2 quả cầu màu xanh) [23]

Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn

Bacillus pasteurii trong trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn2+ [26], còn ở

Klebsiella aerogenes có cofactor là Cu2+ [30] như hình bên dưới:

Hình 1.5: Urease từ K aerogenes [30] Hình1.6: Urease từ Bacillus

pasteurii [26]

1.1.3 Cơ chế xúc tác: [42]

Cơ chế của quá trình xúc tác phản ứng của urease theo phương trình [42]:

Cụ thể xảy ra ở trung tâm hoạt động như sau:

Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease [42]

Theo sơ đồ trên ta thấy: ban đầu phân tử urea sẽ tấn công và tạo liên kết với

2 nguyên tử Ni đồng thời có 2 phân tử H2O được giải phóng ra Tiếp theo là sự sắp xếp lại của các điện tử, hình thành những mối liên kết mới tại trung tâm hoạt động Cuối cùng là sự tái cấu trúc ở trung tâm hoạt động của urease với sự tham gia của 2 phân tử nước, đẩy gốc carbamate ra ngoài đồng thời giải phóng 1 phân tử NH3 Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian Đây chính là một cofactor của urease

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease: [1, 10,

14, 19, 23, 44]

1.1.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: [14]

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme: V= k [E]

V : vận tốc phản ứng

[E] : nồng độ enzyme

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

1.1.4.2 Aûnh hưởng của nồng độ cơ chất, mô hình

Michaelis_Menten: [14, 44]

Phương trình Michaelis_Menten:

] [

] [ max

S K

S v

v

m +

×

=Trong đó:

Km : hằng số Michaelis, là hằng số ái

lực của enzyme đối với cơ chất, đặc

trưng của mỗi loại enzyme đối với mỗi

loại cơ chất

vmax : vận tốc phản ứng đạt cực đại

[S] : nồng độ cơ chất

Từ phương trình ta có thể xét đến 3 trường hợp:

- Nếu [S] << Km thì:

m

K

S v

=Như vậy, ở nồng độ cơ chất thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S]

- Nếu [S] >> Km thì: v = vmax: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc [S] Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng không tăng theo

- Nếu [S] = Km thì

2 max

v

v= : vận tốc phản ứng bằng nửa vận tốc cực đại

Hoặc ta cũng có thể xác định Km và

Vmax theo phương trình được viết lại từ phương

trình trên như sau:

] [

1 1

1

max

K v

v

m

i

× +

=Từ đó ta sẽ biểu diễn sự phụ thuộc của

S bằng một phương trình đường

thẳng và xác định Km, Vmax như đồ thị bên

Trên cơ sở đó, một thí nghiệm của trường đại học Regensburg (Đức) việc xác định Km, Vmax có kết quả như sau [44]:

Kết quả suy ra từ đồ thị (hình 1.8):

Km (mol.L-1) 2.41 * 10-2 2.41 * 10-2

Vmax (mS.min-1) 0.5118 0.7868

Hình 1.8: Đồ thị xác định K m và V max ở hai nhiệt độ khác nhau [44]

(1): ở 400C (2): 500C

1.1.4.3 Aûnh hưởng của nhiệt độ: [14, 17, 23, 44]

Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động của các phân tử tăng, sự tiếp xúc giữa các phân tử cũng tăng nên vận tốc phản ứng tăng

Tuy nhiên do bản chất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein, enzyme mất hoạt tính Do đó, mỗi enzyme sẽ tồn tại một nhiệt độ mà ở đó hoạt tính cao nhất, gọi là: nhiệt độ tối thích topt

Theo các nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) thì nhiệt độ topt vào khoảng

45-500C [17] Tuy nhiên nhiệt độ topt của urease không cố định, mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng…

Người ta đã thấy rằng độ bền nhiệt của urease tăng khi có mặt cơ chất hoặc L_cystein và urease ở dung dịch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [23]

Ơû nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng không bị biến tính

Cũng là một thí nghiệm của trường đại học Regensburg (Đức) đã xác định

topt được thực hiện dưới thiết bị sau [44]:

Hình 1.9: Thiết bị thí nghiệm xác định topt của urease [44]

Theo sơ đồ trên, nhiệt độ sẽ được đo ở (2) với sự trợ giúp của tế bào bán dẫn (1) và tất cả được nối với bộ điều kiển gọi là CHEMBOX Nhiệt độ sẽ được khảo sát ở 20, 30, 40, 50, 600C Kết quả thu được của các nhà nghiên cứu này là topt =

500C như đồ thị hình bên:

Hình 1.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính urease [44]

1.1.4.4 Ảnh hưởng của pH: [14, 19]

Enzyme rất nhạy cảm với sự biến đổi pH của môi trường do pH ảnh hưởng đến sự phân ly ion của phân tử cơ chất Do đó mỗi enzyme có một pH mà hoạt tính của nó đạt cực đại, gọi là pH tối thích (pHopt) Khi pH càng xa pHopt thì hoạt tính càng giảm [2]

Bảng 1.2: Giá trị pHopt ở các loại đệm [19]

Urease có pHopt = 6 khi nồng độ cơ chất urea 8% và bằng 7.5 khi nồng độ urea là 1% [19] Điều này cho thấy giá trị pH tối

ưu của urease cũng không cố định mà nó còn phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ cũng như vào nguồn nguyên liệu thu nhận

Theo các tài liệu thì giá trị pH tối ưu của urease nằm trong khoảng 6.4-7.6 Như vậy, hoạt tính của urease phụ thuộc vào dung dịch đệm, giá trị pH, nồng độ urea, nhiệt độ và nồng độ muối (bảng 1.2)

Hình 1.11: Giá trị pHopt ở nồng độ urea 2.5 % của các loại đệm [19]

6.4 6.5 6.9 0.1 Acetate

Citrate Phosphate

6.7 6.7 7.6

1.1.4.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất ức chế: [10, 14, 23, 27]

Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt

của chúng có khả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất

kích thích (chất hoạt hóa) và chất kìm hãm (chất ức chế) Tuy nhiên không có sự

phân biệt rõ ràng chất ức chế và kìm hãm vì một chất có thể là kích thích với

enzyme này nhưng là kìm hãm của enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích,

nồng độ khác là kìm hãm [14]

™ Cơ chế tác dụng của chất hoạt hóa: [14]

Các chất hoạt hóa có thể là chất biến enzyme từ trạng thái không hoạt động

sang trạng thái hoạt động, có thể là các chất dị lập thể dương hoặc các chất có khả

năng biến tiền enzyme không hoạt động sang hoạt động mạnh Các chất này có thể

là các ion kim loại, có thể đóng vai trò nhóm ngoại của các enzyme 2 cấu tử hoặc

tham gia vào cấu tạo của coenzyme, hoặc là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc

là cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme

™ Cơ chế tác dụng của chất kìm hãm: [14]

Các chất kìm hãm ngược lại là các chất có tác dụng biến enzyme từ trạng

thái hoạt động sang không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang hoạt

động yếu Các chất này có thể là dị lập thể âm, tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh

tranh và không cạnh tranh

- Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường

hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương đồng

với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết

hợp với enzyme, giảm mối liên kết giữa

enzyme và cơ chất

- Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong

trường hợp chất kìm hãm có khả năng kết

hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion

kim loại cùng hóa trị với các ion kim loại là nhóm ngoại của enzyme

Hình 1.12: Ảnh hưởng của chất kìm hãm

cạnh tranh và không cạnh tranh

Theo [28], các ion kim loại như Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… là những chất kìm hãm không cạnh tranh vì nó có hóa trị cùng với cofactor của urease là Ni2+ Các ion kim loại này sẽ tranh giành các liên kết với Ni2+, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm hoạt động của urease

Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các chất ức chế lên hoạt tính urease [28]

Theo bảng trên, với hàm lượng AgNO3 0.002mg/ml đã làm mất hoạt tính của urease, đối với HgCl2 là 0.004mg/ml và đối với Cu2+ là 0.01mg/ml

Ngoài ra, hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là những chất ức chế đặc hiệu cạnh tranh của urease Vì chúng có cấu tạo gần giống

cơ chất nên chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme Do đó sự có mặt của chúng trong dung dịch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea Có thể làm giảm tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea [23]

™ Ví dụ với chất ức chế là hydroxamic acid [23]:

Cụ thể như sau:

Hình 1.13: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease [23]

Hydroxamic acid do có cấu tạo gần giống urea nên nó tấn công vào trung tâm hoạt động của urease là 2 quả cầu Ni và đã “khóa” chặt 2 quả cầu này

1.2 Các phương pháp thu nhận urease:

1.2.1 Nguồn thu nhận: [8, 9, 11, 17, 21, 24, 31]

Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác nhau

Vào năm 1876, Musculus lần đầu tiên trình bày báo cáo về enzyme urease Ông lọc lấy vi khuẩn trên giấy lọc, làm khô giấy, sau đó thấm ướt bằng dung dịch chỉ thị acid_base để kiểm tra urea Ông cũng tìm thấy urease có trong nước tiểu [8]

Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là trong các

vi sinh vật đất, trong thực vật và một số ít ở động vật Ông đã tìm ra ở hơn 200 loài

vi khuẩn, nhiều loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài,

chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae [31]

Năm 1922, Przylecki tìm thấy urease trong gan của động vật thân mềm, trong một số loài ấu trùng và loài giáp xác Ngoài ra urease còn được tìm thấy ở

con Sam (Limulus polyphemus) và ở ấu trùng của ruồi Lucilia sericata [31]

Các loại cây họ Đậu như đậu rựa, đậu nành, đậu ngự, đậu rằn đều có chứa một lượng đáng kể urease Trong các loại đậu kể trên thì đậu rựa (jack bean) chứa một lượng urease rất lớn, tới gần 20% trọng lượng chất khô của hạt [31]

Đậu rựa có nguồn gốc từ Ấn Độ Ở nước ta, giống đậu rựa được trồng nhiều

ở miền Bắc, ở miền Nam có giống đậu rựa leo Hạt đậu rựa độc, ăn say do trong hạt có chứa chất Concanavalin là chất độc Nó phân lập immunoglobulin và glucoprotein trong máu, làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng qua ruột non [9] Vì lí do trên nên ở nước ta đậu rựa ít được trồng nhiều

So với 3 loại đậu còn lại: đậu rằn, đậu ngự, đậu nành thì đậu nành có chứa một lượng urease lớn hơn cả và cho hoạt tính cao hơn 2 loại còn lại [8] Đậu nành

do có giá trị dinh dưỡng cao nên được trồng khá phổ biến ở nước ta, giá thành lại rẻ nên rất thích hợp được dùng làm nguyên liệu để nghiên cứu thu nhận urease trong khuôn khổ luận văn này

1.2.1.1 Cây đậu nành (Glycine max Merill): [5, 7, 9, 37]

Cây đậu nành là một trong số cây trồng có lịch sử lâu đời nhất của loài người Theo thống kê của FAO (1994), đậu nành được phân loại thực vật học như sau:

Bảng 1.4: Phân loại thực vật học của cây đậu nành [37]

Phân giới Cormobinata Họ Leguminosae

Phân loại Spermatophyta Phân họ Papilionaceae

Phân hiệu (chi) Angcospermae Tông Phaseoleae

Lớp Dicotyldoneeae Phân tông Phaseolinae Glycininae

Phân lớp Archichlamydae Giống Glycine L

Thứ Rosales Phân giống Glycine Subg, Soja

Phân họ Leguminosinae Loài Glycine max

Hình 1.14: Cây đậu nành, quả và hạt [37]

1.2.1.2 Hạt đậu nành: [5, 7, 9, 37]

Hạt đậu nành, cũng như hạt của nhiều họ đậu khác, không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Tùy theo giống, hình dạng của hạt có thể biến đổi từ hình cầu, dẹt, dài và hầu hết là có hình ô van [7]

Hạt đậu nành gồm ba bộ phận [7]:

- Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt

- Rốn hạt chiếm 2% trọng lượng hạt

- Phôi trưởng thành gồm hai lá mầm chiếm 90% trọng lượng hạt

Hình 1.15: Cấu tạo của hạt và phôi đậu nành [37]

1.2.1.3 Thành phần hóa học của đậu nành: [4, 7]

Đậu nành được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải quyết nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người Ngoài ra, đậu nành còn được dùng để chữa bệnh tiểu đường, suy nhược thần kinh, suy nhược dinh dưỡng [7]

Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều [7]

Bảng1.5: Thành phần hóa học của đậu nành tính trên tổng khối lượng hạt [4]

™ Protein:

Hàm lượng protein tổng dao động trong hạt đậu nành từ 29.6–50.5%, trung bình là 36–40% Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein): albumin (6–8%), globulin (25–34%), glutelin (13–14%), prolamin chiếm lượng nhỏ không đáng kể Gần 80% protein có trong hạt có thể tách riêng ra ngoài nhờ vào phương pháp sử dụng kiềm

™ Lipid:

Chất béo trong đậu nành dao động từ 13.5–24% theo hàm lượng chất khô, trung bình 18% Chất béo chứa khoảng 6.4–15.1% acid béo no (acid stearic, acid arachidic) và 80–93.6% acid béo không no (acid linoleic, acid linolenic, acid oleic trong đó acid linolenic chiếm tỷ lệ tương đối cao) Chất béo không no có lợi cho sức khỏe hơn là acid béo no Tuy nhiên các acid béo không no dễ bị oxy hóa và làm giảm chất lượng dầu nành

Dầu nành được tiêu hóa dễ dàng với thành phần các acid béo không no, không có cholesterol và các acid béo không thay thế như acid linoleic, acid linolenic và acid arachidonic … có vai trò sinh học cao đối với con người

Thành phần hóa học % Khối lượng

Protein Chất béo Carbohydrate Cellulose Hemicellulose Đường

Stachyose Rafinose Saccharose Đường khác (arabinose, glucose…)Viatamin và khoáng

40.0 20.0

4.0 15.0

3.8 1.1 5.0 5.1 6.0

Bảng 1.6: Hàm lượng acid béo trong đậu nành [4]

Acid béo no Hàm lượng (%) Acid béo không no Hàm lượng (%)

Tổng cộng

0.42-1.6 10.9-60 25-64.8

- 0.3-12.1

85

™ Carbohydrates:

Bảng 1.7: Hàm lượng carbohydrate trong đậu nành [4]

Carbohydrates trong đậu nành chiếm khoảng 34% khối lượng khô, trong đó hàm lượng tinh bột không đáng kể Carbohydrates được chia làm 2 loại:

- Loại tan trong nước: chiếm khoảng

10% lượng carbohydrates, gồm các loại đường không khử như saccharose, rafinose và stachyose

- Loại không tan trong nước: gồm

Đậu nành chứa nhiều vitamine khác nhau, trừ vitamine C và vitamine D

Thành phần vitamine như sau:

Bảng 1.8 : Thành phần vitamine trong hạt đậu nành [4]

Inositol Vitamine A Vitamine E Vitamine K Vitamine B1Vitamine B2

Vitamine PP

2300 mg%

0.18–2.43 % 1.4 mg%

1.9 mg%

0.54 mg%

0.29 mg%

2.3 mg%

™ Một số Enzyme trong đậu nành: [4]

- Urease: đây là enzyme được tìm thấy với hàm lượng lớn ở đậu nành

sống Nó sẽ phân hủy urea thành ammoniac là một hợp chất độc đôí với

cơ thể người Urease là vấn đề cần quan tâm khi đậu nành sống trộn với urea để làm thức ăn cho gia súc Enzyme này sẽ chống lại sự hấp thụ các chất đạm qua màng ruột do đó không nên ăn đậu nành sống Tuy nhiên urease bị vô hoạt bởi nhiệt Các vấn đề về enzyme urease sẽ được tìm hiểu kỹ trong đề tài nghiên cứu này

- Lipase: thủy phân glyceride tạo thành glycerin và acid béo

- Phospholipase: thủy phân ester của acid phosphoric

- Lipoxygenase: xúc tác phản ứng chuyển O2 trong acid béo

Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng nước nhất định Hàm ẩm là một yếu tố rất quan trọng có ảnh hưởng đến khả năng tồn trữ và chế biến Nếu hàm lượng ẩm quá cao thì sẽ tốn chí phí để sấy khô hạt Ngược lại hạt sẽ bị nứt vỡ và làm giảm giá trị dầu trong hạt Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự oxy hóa chất béo không chỉ diễn ra trong điều kiện hàm ẩm cao mà còn ở hàm ẩm rất thấp Hàm ẩm tối ưu cho việc bảo quản kéo dài là khoảng 12%

1.3 Tách chiết và tinh chế enzyme: [1, 10, 14]

Các enzyme thường có trong các tế bào động thực vật và vi sinh vật và một số enzyme ngoại bào sẽ có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật Để tách chiết chúng ra có các cách như sau:

¾ Nghiền tế bào (phá vỡ tế bào):

Có thể dùng phương pháp vật lý hoặc hóa học, sinh học:

• Phương pháp vật lý: các phương pháp xay nghiền ở nhiệt độ

thấp hay dùng Nitơ lỏng Khi đó nước trong tế bào bị kết tinh và tăng lực ma sát khi xay nghiền phá vỡ màng tế bào

• Phương pháp hóa học: xử lý tế bào bằng các dung môi có khả

năng hòa tan màng tế bào Phần lớn người ta có thể chọn các dung môi hữu cơ hòa tan được chất béo hoặc xử lý kiềm

• Phương pháp sinh học: hay còn gọi là phương pháp tự phân

(autolyse) Sử dụng lyxosom trong tế bào để giải phóng các enzyme phá hủy tế bào hoặc bổ sung các chế phẩm enzyme phá vỡ màng tế bào

¾ Trích ly enzyme:

Tùy loại enzyme người ta sẽ chọn dung môi thích hợp để trích ly Phần lớn dung môi là các muối loãng hay là dung dịch đệm có pH xác định

¾ Kết tủa enzyme:

Sử dụng các dung môi khác nhau để kết tủa enzyme Các tác nhân này phải là các tác nhân biến tính thuận nghịch protein để sau khi kết tủa có thể hòa tan lại được Bao gồm:

• Muối trung tính: từng loại protein có thể kết tủa bởi các nồng

độ muối khác nhau Các muối trung tính thường được chọn là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, MgCl2, NaCl Phương pháp này còn gọi là phương pháp diêm tích

• Dùng pH đẳng điện (pI): mỗi protein dễ bị kết tủa bởi pH đẳng

điện riêng

• Dùng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: có khả năng phá màng

hydrate của protein như: butanol, ethanol, polyethylenglycol, acetone

¾ Loại tạp chất có phân tử lượng nhỏ:

Bằng phương pháp thẩm tích, dùng các màng bán thấm bằng vật liệu có kích thước lỗ màng nhỏ có thể cho các chất có phân tử lượng nhỏ đi qua do chênh lệch áp suất và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn

¾ Loại protein tạp:

Dùng phương pháp sắc ký, gồm sắc ký hấp phụ hoặc sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel Hoặc dùng phương pháp điện di: dùng điện trường để tách các protein tích điện khác nhau

¾ Làm đặc_tiêu chuẩn hóa sản phẩm:

Dùng sấy thăng hoa hoặc các chế phẩm lỏng được siêu lọc và phải tiêu chuẩn hóa sản phẩm: chế phẩm phải có hoạt tính riêng nhất định

Dựa trên lý thuyết chung như trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa

ra được nhiều phương pháp tối ưu nhằm thu nhận được nhiều urease Sau đây là một số các phương pháp mà chúng tôi tham khảo được:

1.3.1 Phương pháp 1: [22]

- Chiết xuất: bột đậu

nành sau khi tách béo được nghiền kỹ trong dung dịch HCl 0.4% có thêm 5.10-3 EDTA và L-cystein Sau đó

ly tâm bỏ tủa

- Xử lý nhiệt: nhiệt độ

của dịch chiết được nâng nhanh lên đến

600C, giữ 10ph Sau đó làm lạnh đến 4-

8oC, giữ trong 30ph, ly tâm bỏ tủa

- Siêu lọc: dịch ly tâm

được xử lý qua màng siêu lọc để loại peptid và polypeptide có phân tử lượng nhỏ hơn 5000Da

- Tủa: Tủa urease bằng acetone: sau khi chạy qua màng siêu lọc, dịch

enzyme được xử lý bằng acetone lạnh với tỷ lệ 1:1 Sau đó ly tâm bỏ phần dịch, phần tủa được hòa tan lại trong 0.1M Tris-buffer pH=7 chứa EDTA và L-cystein 5x10-3

- Sắc ký trao đổi ion: dịch enzyme được chạy sắc ký trao đổi ion trong cột

chứa DEAE-cellulose với gradient nồng độ NaCl từ 0-1M

- Đông khô: enzyme được đông khô với sự hiện diện của saccharose làm

chất ổn định với tỷ lệ 2.5mg saccharose cho 1mg enzyme

1.3.2 Phương pháp 2: [18]

- Trích ly: bột đậu nành

sau khi đã tách béo được cho vào dung dịch đệm A (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM

EDTA, 2mM 2_mercaptoethanol)

trong 1h, ở 40C

- Ly tâm bỏ bã: 30.000

vòng/ph trong 20ph, 40C

- Tủa: acetone lạnh 20%

được bổ sung vào dịch sau li tâm để loại những protein tạp Phần tủa này cũng sẽ được loại bỏ bằng li tâm ở 30.000v/ph trong 20ph, ở 40C

- Thẩm tích: dịch sau bỏ protein tạp sẽ được qua màng thẩm tích trong dung

dịch đệm B (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM

2_mercaptoethanol)

- Dịch thu được sau thẩm tích sẽ cho vào bột Q_Sepharose đã được cân bằng ở

dung dịch đệm B Sau khi khuấy 30ph, hỗn hợp được đem đi lọc Bột được

rửa với 150mM NaCl trong dung dịch đệm B để loại bỏ những protein không

bị giữ lại Phân đoạn làm giàu urease sẽ được thực hiện trong 300mM NaCl

trong đệm B Và cuối cùng dịch thu được sẽ cho qua cột sắc ký lọc gel và

sắc ký hấp phụ

1.3.3 Phương pháp 3: [21]

- Tất cả các công đoạn của quy trình được thực hiện ở điều kiện 40C

- Trích ly: bột đậu nành sẽ

được trích ly trong dung dịch đệm A (0.1M Tris/maleate, 30mM sodium EDTA, 10mM 2_mercatoethanol, pH 7.6) Hỗn hợp được khuấy trong 3h và để 40C qua đêm

- Li tâm bỏ bã: 16.000

vòng/ph trong 10ph

- Gia nhiệt: dịch sau li tâm sẽ gia nhiệt lên 600C trong 1h rồi hạ nhiệt độ về 300C

- Kết tủa lần 1: bằng muối ammonium sulfate 20% và được li tâm loại bỏ tủa

- Kết tủa lần 2: cũng bằng muối như trên nhưng với nồng độ cao hơn là 55% Thu

tủa bằng li tâm 16.000v/ph trong 10ph

- Hòa tan tủa: sau khi thu kết tủa lần 2 sẽ được tái hòa tan trong dung dịch đệm B

(0.1M Tris/maleate, 1mM sodium EDTA, 10mM 2_mercatoethanol, pH 7.0)

- Thẩm tích: dịch sau khi được hòa tan sẽ đem thẩm tích trong dung dịch B

Những protein bị biến tính sẽ được li tâm loại bỏ trong giai đoạn này

- Tủa acetone lần 1: cho acetone 50% vào dịch để thu kết tủa

- Tủa acetone lần 2: dùng tiếp acetone 33% (chiếm 1/3) để tận thu kết tủa

- Tái hòa tan: sau khi thu kết tủa 2 lần sẽ được hòa tan lại trong dung dịch đệm C

(0.1M Tris/maleate, 1mM sodium EDTA, 1mM 2_mercatoethanol, pH 7.0)

- Thẩm tích: dịch được hòa tan sẽ qua thẩm tích trong dung dịch C và cuối cùng

được chạy sắc ký trên cột DEAE_cellulose

- Đậu nành đã loại bỏ hạt xấu để trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C khoảng một tuần liên tục nhằm giúp cho quá trình xay nhỏ được dễ dàng

- Đem đậu xay thô (chưa thành bột mịn) sau đó mang chiết trong bình Soxhlet với ether để loại bỏ chất béo Sau đó bột được trải ra ở 37oC trong vài ngày nhằm cho ether bay hơi hết

- Cân 50g bột đã loại béo, cho vào 250ml nước cất Thêm vào đó 20ml glycerin và 10 giọt toluene, lắc hỗn hợp trên máy lắc trong vài giờ và để trong tủ lạnh một đêm Sau đó ly tâm, gạn lấy nước trong Đây chính là dịch chiết enzyme thô

- Có thể sử dụng dịch chiết thô này để kiểm tra hàm lượng urea có trong nước chấm Đem dịch này cho bay hơi dưới áp suất thấp, sẽ thu được bột enzyme thô

™ Nhìn chung, những phương pháp nêu ở trên khá phức tạp, phải qua nhiều

công đoạn, tuy nhiên chúng cũng gần giống nhau về nguyên tắc cũng như việc sử dụng hóa chất Tùy theo từng vùng, miền, từng nguyên liệu sử dụng mà có thể khác nhau để nhằm một mục đích chung là thu được nhiều urease nhất Vì điều kiện có hạn của phòng thí nghiệm nên chúng tôi sẽ tìm và đưa ra phương pháp phù hợp tối ưu nhất sẽ được trình bày

kỹ trong chương 2

1.4 Các phương pháp xác định hoạt tính urease: [10, 14, 25, 35]

E + S Ỉ [ES] Ỉ E + P

Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động (hoạt tính) của enzyme đó Về nguyên tắc, có thể chia ra 3 nhóm phương pháp sau [10]:

¾ Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

¾ Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định

¾ Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Để dễ dàng cho việc nghiên cứu, người ta đã đưa ra các khái niệm [10]:

¾ Đơn vị enzyme quốc tế (International Units): là lượng enzyme có khả năng

xúc tác làm chuyển hóa được một μmol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

¾ Katal (Kat): là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1

mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

¾ Hoạt tính riêng của chế phẩm (specific activity): bằng số lượng đơn vị hoạt

độ có trong 1 đơn vị thể tích protein (đối với chế phẩm lỏng) hoặc trong 1 đơn vị khối lượng protein (đối với chế phẩm rắn)

Nhóm Các thông số cố

định

Các thông số thay đổi

Nồng độ enzyme

Biến thiên của S hay

P

(hay lượng P tạo thành)

Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme nói lên mức độ tinh khiết của chế phẩm enzyme Trong quá trình tinh chế, hoạt tính riêng sẽ tăng lên đáng kể

¾ Hoạt tính toàn phần của chế phẩm enzyme (total activity): là tổng số đơn vị

hoạt độ có trong chế phẩm

Trong quá trình tinh chế, hoạt tính toàn phần của chế phẩm sẽ bị giảm Đó là sự thất thoát trong quá trình xử lý

¾ Hoạt tính phân tử (molecular activity): chỉ sử dụng đối với một số ít chế

phẩm enzyme đã tách ra được hoàn toàn tinh khiết và đã xác định được phân tử lượng của enzyme Từ đó xác định hoạt tính phân tử của chế phẩm

Đối với enzyme urease, các sản phẩm tạo thành sau phản ứng là CO2, NH3

đều có thể định lượng một cách dễ dàng Chính vì vậy mà nhóm phương pháp đầu tiên được áp dụng trong việc xác định hoạt tính urease

1.4.1 Xác định hoạt tính urease dựa trên việc định lượng NH 3 được giải

- Làm ngừng phản ứng bằng cách thêm 0.5ml dung dịch HCl 1M và lắc đều

- Xác định ammoniac như sau: lấy 0.15ml hỗn hợp phản ứng cho vào ống nghiệm, thêm 7ml nước, 0.5ml thuốc thử Nessler và thêm nước vào đến 10ml Lắc đều và đem so màu trên máy quang phổ kế (có mẫu đối chứng bằng nước cất)

™ Phương pháp chuẩn độ: [25]

- Thêm 10 giọt dung dịch methyl red 0.05% và chuẩn độ bằng dung dịch

H2SO4 0.1N cho đến khi có màu hồng

™ Phương pháp của Gold Kist: [40]

Nguyên tắc:

Khi urease tham gia xúc tác phản ứng chuyển urea thành khí ammoniac làm thay đổi pH của môi trường Bằng cách đo độ thay đổi pH, có thể xác định lượng ammoniac được giải phóng

™ Phương pháp xác định hoạt tính urease trong đất: [37]

Nguyên tắc:

Xác định hoạt tính trong các điều kiện tối ưu dựa trên hàm lượng NH4+ được giải phóng Ủ đất với dung dịch đệm THAM, dung dịch urea và toluene ở 370C trong 2h Dùng KCl, Ag2SO4 để ngừng phản ứng và thu NH4+ thoát ra bằng phương pháp chưng cất và định lượng NH4+ bằng thuốc thử gồm MgO, H3BO4, H2SO4

0.005N

1.4.2 Xác định hoạt tính urease bằng cách định lượng CO 2 được giải

phóng: [3]

Nguyên tắc:

Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea:

+ 2H2O (NH4)2CO3

Khi thêm formaldehyt vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic:

1.5 Ứng dụng của enzyme urease:

Urease phân bố khá rộng rãi trong tự nhiên và nó được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực nông nghiệp, thực phẩm và y tế

1.5.1 Trong nông nghiệp: [2, 12]

Urea là một nguồn Nitơ quan trọng đối với cây trồng Tuy nhiên, thực vật không sử dụng được trực tiếp nguồn N này mà phải thông qua con đường khoáng hóa nhờ vi sinh vật (vi sinh vật sẽ phân hủy urea để sản phẩm cuối cùng là ammoniac) Quá trình phân hủy này được thực hiện nhờ enzyme urease trong các

vi sinh vật đất Các loài vi khuẩn sử dụng urea làm nguồn N có tên chung là

Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc họ Cocoaceae và Bacilaceae [12]

1.5.2 Trong thực phẩm: [37]

Trong danh mục các phụ gia được sử dụng trong thực phẩm do bộ y tế ban hành không có tên urea Điều này chứng tỏ nó không được phép có mặt trong thực phẩm Tuy nhiên trong thực phẩm có thể có urea do nhiều nguyên nhân khác nhau như nhiễm từ nguồn nước hoặc từ nguyên liệu… Đây là những nguyên nhân nằm ngoài dự kiến của các nhà sản xuất Ví dụ: trong các loại thực phẩm lên men như nước giải khác lên men, sữa lên men đòi hỏi có urea (nguồn N) cho vi sinh vật Ngoài ra, trong nước mắm, một sản phẩm mà hàm lượng urea đến mức báo động

Vì đối với loại thực phẩm này thì hàm lượng N toàn phần được xem là chỉ tiêu đầu tiên để đánh giá chất lượng sản phẩm Tuy nhiên, hiện nay xảy ra tình trạng một số nhà sản xuất đã bổ sung urea nhằm tăng chỉ số N toàn phần lên cao Để kiểm soát việc làm này, tại phòng kiểm định Hóa học của Viện Pasteur đã sử dụng chế phẩm urease để xác định hàm lượng urea có trong thực phẩm

1.5.3 Trong y học: [2, 46]

Urea được tạo thành chủ yếu ở gan và được vận chuyển qua thận để thải ra ngoài Hàng ngày, mỗi người bài xuất chừng 7-16g urea hay hơn nữa tùy vào chế độ ăn Mặc dù bản thân urea là chất không độc nhưng sự ứ đọng của nó trong cơ thể thường kèm theo những sản phẩm chuyển hóa độc như NH3 Vì vậy, nếu nồng độ urea trong máu tăng cao kéo dài là một dấu hiệu nghiêm trọng Do đó, việc sử dụng enzyme urease để xác định hàm lượng urea trong máu đã được các bác sỹ sử dụng do tính đặc hiệu của urease và cho kết quả nhanh, chính xác

2.1 Nguyên liệu:

Nguồn nguyên liệu thu nhận urease được chọn làm nghiên cứu là đậu nành có xuất xứ ở Đồng Nai Nguyên liệu trước khi sử dụng được loại bỏ những hạt xấu và bảo quản nguyên hạt nơi khô ráo và chỉ xay thô trước khi làm thí nghiệm để tránh việc hút ẩm làm hư hỏng

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu:

Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành

Tổng quan về urease

Chọn nguồn nguyên liệu

Chọn phương pháp thu nhận

urease

- Phương pháp trích ly

- Phương pháp kết tủa

- Phương pháp tinh sạch Thu nhận urease

- Nhiệt độ tối thích

- pH tối thích

- Ảnh hưởng nồng độ cơ chất Nghiên cứu tính chất

chế phẩm

2.2.2 Phương pháp thu nhận urease:

Theo mục 1.3 trong chương 1 đã trình bày khá kỹ các phương pháp để thu nhận urease mà chúng tôi tham khảo được Tuy nhiên vì điều kiện phòng thí nghiệm nên chúng tôi đã lựa chọn và đưa ra 2 phương pháp sẽ thực hiện như sau:

Bột đậu nành

Tách béo Ether ethylic

Phương pháp 2 Phương pháp 1

Tái hoà tan

Ethanol

Dung dịch

Đậu nành sau khi xay thô thành bột sẽ được tách béo bằng hệ thống Soxhlet với dung môi là ether ethylic Bột sau tách béo sẽ làm nguyên liệu cho quá trình thu nhận enzyme theo phương pháp 1 và 2

2.2.2.1 Phương pháp 1:

™ Trích ly:

Bột sẽ được trích ly enzyme trong dung môi là dung dịch A (đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa 5.10-3M EDTA và L_cystein) trong 1h ở nhiệt độ phòng Bã được loại bỏ bằng cách li tâm 5000v/ph trong 20ph

Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được khảo sát và cho kết quả ở chương 3

™ Kết tủa:

Dung môi kết tủa là ethanol sẽ được bổ sung vào dịch trích vừa thu được Ethanol có hằng số điện môi nhỏ hơn nước nên làm giảm hằng số điện môi của môi trường, giảm khả năng solvate hóa các phân tử nước đối với các phân tử protein trong dung dịch Do vậy tính tan của protein giảm và bị kết tủa

Để hạn chế tối đa việc enzyme bị biến tính, quá trình kết tủa này được thực hiện ở nhiệt độ 40C Thời gian kết tủa là 30ph Thu tủa bằng cách li tâm 5000v/ph

Tỉ lệ dịch trích/dung môi ethanol sẽ được khảo sát và cho kết quả ở chương 3

™ Tái hòa tan:

Tủa thu được sẽ tái hòa tan trong dung dịch A: 10ml dịch sau trích ly sẽ được kết tủa và tái hòa tan trong 5ml dung dịch A Dịch sau tái hòa tan được đem bảo quản lạnh

2.2.2.2 Phương pháp 2:

™ Trích ly:

Bột được trích ly enzyme trong dung môi là dung dịch A’ (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 2mM 2_mercaptoethanol) trong 1h ở nhiệt độ 40C Bã được loại bỏ bằng cách li tâm 15000v/ph trong 15ph ở 40C

Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được khảo sát và cho kết quả ở chương 3

™ Tủa acetone:

Các protein tạp được loại ra bằng cách cho kết tủa với acetone 20% (v/v) so với dịch trích Thực hiện tủa ở 40C trong 2h Loại tủa bằng cách li tâm 5000v/ph trong 15ph ở 40C

™ Thẩm tích:

Loại muối và các chất có phân tử lượng nhỏ bằng túi thẩm tích cellophane trong dung dịch B’ (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol) ở 40C trong 12h Thỉnh thoảng khuấy đều để rút ngắn thời gian thẩm tích

™ Sắc ký lọc gel:

Urease được tinh sạch bằng cách cho dịch sau thẩm tích qua cột chứa Sephadex G_100 Dùng dung dịch rửa giải là dung dịch C’ (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol, 300mM NaCl) để thu 40 phân đoạn (mỗi phân đoạn 4ml)

2.2.3 Các phương pháp tinh sạch enzyme:

2.2.3.1 Phương pháp kết tủa: [27]

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme Có nhiều cách kết tủa, có thể bằng muối, bằng dung môi hữu cơ, bằng pH

ở điểm đẳng điện Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp kết tủa bằng dung môi là ethanol và acetone (sơ đồ mục 2.2.2 chương 2)

™ Nguyên tắc:

Protein có thể kết tủa bằng dung môi hữu cơ tan trong nước như ethanol, acetone, methanol, isopropanol Các dung môi này có hằng số điện môi nhỏ hơn nước nên làm giảm hằng số điện môi của môi trường, giảm khả năng solvate hóa của các phân tử nước đối với các phân tử protein trong dung dịch Do vậy tính tan của protein giảm và bị kết tủa

Để giảm sự biến tính, kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ được thực hiện ở nhiệt độ từ 00C – 40C Ở nhiệt độ cao, cấu trúc protein có thể bị thay đổi bất thuận nghịch, do vậy phân tử dung môi xâm nhập vào bên trong phân tử protein, làm cho protein bị biến tính Tuy nhiên khi bổ sung dung môi, nhiệt độ của dung dịch tăng

vì đây là một quá trình tỏa nhiệt Do vậy cần phải tránh sự tăng nhiệt độ vượt quá

100C bằng cách làm lạnh dung môi và dung dịch protein trước khi phối trộn hoặc

làm lạnh hỗn hợp trong suốt quá trình kết tủa Nhiệt độ càng thấp, khả năng kết tủa càng tăng

Acetone và ethanol là hai dung môi phổ biến nhất trong việc kết tủa protein

do có tính chất an toàn và không độc hại

™ Thực hiện:

- Làm lạnh dung môi và dung dịch xuống 40C

- Rót dung môi vào chậm theo thành ly ở dạng dòng nhỏ hòa lẫn với dung dịch và không để tích lại trên mặt dung dịch

- Lắc nhẹ để dung môi hòa tan đều trong hỗn hợp

- Giữ 40C trong thời gian kết tủa (30ph: đối với ethanol ở phương pháp 1 và 2h: đối với acetone ở phương pháp 2)

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký lọc gel: [27]

™ Nguyên tắc:

Tách các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng

Vật liệu sử dụng: gel Sephadex G_100 với các tính chất:

- Gel sephadex bền trong nước, dung dịch muối, dung môi hữu cơ, dung dịch kiềm, axit yếu

- Có thể chịu được nhiệt độ 1100C trong 40 phút

- Phạm vi phân tách protein theo trọng lượng phân tử: 4.000-150.000 Da

- Sự trương nước: 10 ± 1 (ml/g gel khô)

- Thể tích hạt gel khi hấp thụ nước: 15 ÷ 20 (ml/g gel khô)

™ Thực hiện :

- Ngâm hạt gel trong dung dịch đệm B’ (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM 2_mercaptoethanol) Hạt nhựa được bão hòa trước khi nhồi vào cột

- Cho hạt vào cột dưới dạng huyền phù giúp cho mạng gel trong cột đồng nhất và tránh khí vào cột (vì khí trong cột sẽ làm giảm vận tốc tách)

- Cho mẫu là dịch sau thẩm tích (phương pháp 2) đi qua cột

- Thu 40 phân đoạn: mỗi phân đoạn có thể tích 4ml

2.2.4 Các phương pháp phân tích hóa học: [3]

2.2.4.1 Trích ly và định lượng lipid theo phương pháp Soxhlet:

¾ Nguyên tắc:

Dùng dung môi kị nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu là đậu nành đã được nghiền nhỏ

Hàm lượng lipid tổng có thể tính bằng 2 cách:

- Cân trực tiếp : cân lượng dầu sau khi chưng cất loại sạch dung môi

- Gián tiếp : cân khối lượng bã còn lại

¾ Dụng cụ thiết bị:

- Bộ Soxhlet (bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn, bóng đèn 100W làm nguồn nhiệt)

- Cân khối lượng trước khi trích ly: m1

- Lắp hệ thống hoàn lưu Soxhlet, cho gói mẫu vào trụ chiết

- Trích ly trong 8-12h đến khi chiết hoàn toàn hết chất béo: thử bằng cách lấy vài giọt ether ở cuối ống xiphông nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay hơi không để lại vết dầu loang thì kết thúc

- Cân khối lượng sau trích ly: m2

¾ Tính kết quả:

Hàm lượng phần trăm chất béo tính theo công thức:

100

* 2 1

m

m m

=

Trong đó:

L : hàm lượng lipid trong mẫu (%)

m1 : khối lượng bao giấy và mẫu ban đầu (g)

m2 : khối lượng bao giấy và mẫu sau khi trích ly lipid (g)

m : khối lượng mẫu ban đầu (g)

2.2.4.2 Định lượng Protein theo phương pháp Kjendahl:

¾ Nguyên tắc:

Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxi hóa Carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O Còn Nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N Định phân lượng H2SO4

0.1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0.1N chuẩn, qua đó tính được lượng Nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm

¾ Dụng cụ, thiết bị:

- Máy cất đạm bán tự động Gerhardt

¾ Tiến hành:

• Vô cơ hóa mẫu:

- Tiến hành trong tủ Hotte đối với mẫu E1 và E2

- Lấy 0.2g mẫu cho vào bình Kjendahl

- Thêm vào từ từ 10ml H2SO4 đậm đặc Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa cần thêm xúc tác là HClO4, giải phóng O2 cho phản ứng oxy hóa

- Đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng Trong quá trình đun, thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng

• Cất đạm:

- Tiến hành trong máy cất đạm Gerhardt

- Chuẩn bị máy cất đạm

- Chuyển toàn bộ dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong vào bình định mức 100ml, thêm nước cất cho đến vạch định mức

- Lấy vào erlen 10ml H2SO4 0.1N, lắp vào máy

- Lấy vào ống phản ứng 10ml dung dịch thí nghiệm từ bình định mức, lắp vào hệ thống

- Đặt chương trình cho máy

- Lấy 10ml H2SO4 0.1N vào erlen, định phân bằng NaOH 0.1N

- Tính nồng độ thực tế của NaOH đem định phân

- T: là tỷ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tính toán của NaOH

¾ Tính kết quả:

Hàm lượng protein trong 1g bột chế phẩm:

m

bT a x

*10

0.6

*100

*0014.0

*)( −

=