KHẢO SÁT độ ổn ĐỊNH CỦA KIT THỬ RPM để ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

KHOA DƯỢC ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ RED PYROGALLOL MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ HA Lớp: D09 NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐÊ TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHI ĐẶT VẤN ĐÊ Theo quy chế đăng kí lưu hành thuốc của Bộ y tế Việt Nam, một những điều kiện để chế phẩm được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm, tuổi thọ của chế phẩm phải lớn hạn dùng DS Phùng Thị Hoàng Nhi: đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp red pyrogallol molybdat” Chúng tiếp tục thực hiện đề tài “Khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol - molybdat để định lượng protein niệu” với công thức đã được tối ưu hóa ĐẶT VẤN ĐÊ Khảo sát độ ổn định của kit thử RPM đã tối ưu hóa các Mục tiêu của đề tài phương pháp tự nhiên và lão hóa cấp tốc Xác định tuổi thọ và hạn dùng của bộ kit thử RPM TỔNG QUAN Phương pháp Red Pyrogallol – Molybdat để định lượng protein niệu Nguyên tắc: Red pyrogallol + molybdat  phức hợp RPM màu đỏ (λmax = 470 nm) Phức hợp RPM + protein  phức hợp màu tím (λmax = 578 – 612 nm) Thường được đo bước sóng 600 nm TỞNG QUAN Cơng thức thuốc thử RPM được tối ưu hóa Thành phần Nồng độ (mmol/L) Red pyrogallol 0,08 Natri molybdat 0.04 Acid succinic 3,74100 Natri oxalat 1.04 Natri benzoat 3.74 Nước cất Methanol TỞNG QUAN Quy trình định lượng protein thuốc thử RPM tối ưu hóa Yếu tố tối ưu hóa Giá trị tối ưu hóa Nồng độ RP 0,08 mmol/L pH thuốc thử 2,7 Thời gian ủ 13 phút TỞNG QUAN Đánh giá quy trình định lượng Tính đặc hiệu Tính tuyến tính Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Độ chính xác Độ đúng TỞNG QUAN Nghiên cứu đợ ởn định Lựa chọn lô thử: ít nhất phải có lô, đó có lô đủ cho các thử nghiệm và lô có thể ít Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp dài hạn Phương pháp lão hóa cấp tốc Phương pháp sử dụng điều kiện khắc nghiệt TỔNG QUAN Điều kiện tiến hành độ ổn định dài hạn Chế phẩm o Nhiệt độ ( C) Độ ẩm (%) Thuốc bảo quản thường 25 ± hoặc 30 ± 60 ± Thuốc bảo quản lạnh 5±3 Không quy định Thuốc bảo quản đông lạnh -20 ± Không quy định Điều kiện tiến hành độ ổn định cấp tốc Chế phẩm o Nhiệt độ ( C) Độ ẩm (%) Thuốc bảo quản thường 40 ± 75 ± Thuốc bảo quản lạnh 25 ± 60 ± KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Độ Độ đúng ngày Nồng độ (mg/dL) STT Độ hấp thu Nờng đợ tìm thấy (mg/dL) Đợ (%) Đợ lệch thực nghiệm (%) 0,017 4,775 95,50 4,50 0,018 5,056 101,12 1,12 0,017 4,775 95,50 4,50 0,018 5,056 101,12 1,12 0,018 5,056 101,12 1,12 0,601 168,820 99,31 0,69 0,626 175,843 103,44 3,44 0,612 171,910 101,12 1,12 0,596 167,416 98,48 1,52 0,610 171,348 100,79 0,79 0,997 280,056 96,57 3,43 1,037 291,292 100,45 0,45 1,008 283,146 97,64 2,36 0,998 280,337 96,67 3,33 170 290 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Độ đúng khác ngày Nồng độ (mg/dL) Ngày Nồng độ tìm thấy Độ lệch thực nghiệm 170 290 Nồng độ tìm thấy (mg/dL) (mg/dL) (%) 4,775 4,50 5,056 5,056 1,12 4,775 Ngày Nồng độ tìm thấy Độ lệch thực nghiệm (mg/dL) (%) 1,12 4,775 4,50 5,337 6,74 5,056 1,12 4,50 5,337 6,74 5,056 1,12 5,056 1,12 5,056 1,12 5,337 6,74 5,056 1,12 5,537 6,74 5,337 6,74 168,820 0,69 174,157 2,45 172,191 1,29 175,843 3,44 170,506 0,30 174,438 2,61 171,910 1,12 171,910 1,12 173,315 1,95 167,416 1,52 176,124 3,60 168,258 1,02 171,348 0,79 173,876 2,28 169,101 0,53 280,056 3,43 294,101 3,33 287,360 0,91 291,292 0,45 280,337 0,72 283,427 2,27 283,146 2,36 287,921 2,07 280,056 3,43 STT Ngày Độ lệch thực nghiệm (%) KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Ứng dụng quy trình được thẩm định một vài mẫu nước tiểu của người tình nguyện STT Nồng độ protein niệu (mg/dL) NKM 3,64 NKM 5,23 NKM 3,89 NKM 4,89 NKM 6,79 NKM 6,17 NKM 10,51 NKM 13,43 BN 987,32 BN 76,70 BN 68,23 BN 493,34 BN 51,21 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Kết quả độ ổn định o Phương pháp dài hạn ở ± C Cảm quan: Kết quả định lượng: Lô Ngày lấy mẫu Lô Lô Nồng độ protein Ln[nồng độ Nồng độ protein Ln[nồng độ Nồng độ protein TB Ln[nồng độ protein] TB (mg/dL) protein] TB (mg/dL) protein] (mg/dL) 100,2 4,6072 100,2 4,6072 100,6 4,6112 32 99,9 4,6042 100,0 4,6052 100,1 4,6062 61 99,5 4,6002 99,6 4,6012 99,8 4,6032 89 99,0 4,5951 99,0 4,5951 99,4 4,5992 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN o Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 25 ± C/ RH = 60 ± 5% Cảm quan: Kết quả định lượng: Ngày lấy mẫu Nồng độ dung dịch protein trung bình của lần đo (mg/dL) Lô Lô Lô 100,2 100,2 100,6 100 99,8 100,2 15 99,5 99,5 99,9 22 99,2 99,1 99,5 32 98,7 98,7 99,1 48 97,7 97,9 98,3 61 97,2 97,3 97,6 75 96,6 96,6 97,0 89 96,0 95,9 96,4 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN o Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff Hoff lô được bảo quản điều kiện 25 C ± 2/ RH = 60 ± 5% Thời gian bảo quản (ngày) Lô Lô Lô 916 876 860 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN o Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 40 ± C/ RH = 75 ± 5% Cảm quản: Thuốc thử màu đỏ, trong, không có kết tủa, màu sắc nhạt dần so với ban đầu Dung dịch tạo thành giữa thuốc thử và dung dịch protein có màu nhạt dần so với thời điểm ban đầu a b c d a: Thuốc thử RPM thời điểm ban đầu b: Phức hợp protein với thuốc thử RPM thời điểm ban đầu c: Thuốc thử RPM ngày lấy mẫu 61 d: Phức hợp protein với thuốc thử RPM ngày lấy mẫu 61 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN o Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 40 ± C/ RH = 75 ± 5% Kết quả định lượng: Ngày lấy mẫu Nồng độ dung dịch protein trung bình của lần đo (mg/dL) Lô Lô Lô 100,2 100,2 100,6 99,1 99,0 99,5 15 98,0 98,1 98,5 22 97,2 97,4 97,8 32 96,1 96,1 96,5 48 94,5 94,5 94,9 61 93,6 93,3 93,7 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN o Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff lô được bảo quản điều kiện 40 C ± 2/ RH = 75 ± 5% Thời gian bảo quản (ngày) Lô Lô Lô 905 905 927 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff ở lô: Tuổi thọ của kit o Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 25 C Lô Lô Lô 916 876 860 905 905 927 30 30 29 (ngày) o Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 40 C (ngày) Tuổi thọ trung bình theo phương pháp Van’t Hoff (tháng) KẾT QUẢ VA BAN LUẬN So sánh hiệu quả kinh tế của bộ kit thử với một vài chế phẩm thị trường Nhà sản xuất Thể tích (mL) Giá thành /1 mL thuốc thử Tuổi thọ (tháng) (VNĐ) Biolabo – Pháp 125 24000 24 Diagnostic chemicals - Canada 76 72000 24 Thuốc thử nghiên cứu ( ) 100 * 28 KẾT QUẢ VA BAN LUẬN Bàn luận Kit thử RPM được sản xuất theo quy trình tối ưu hóa sẽ có thể thay thế các chế phẩm ngoại nhập hiện có thị trường mà vẫn đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm và giúp giảm thiểu chi phí cho bệnh nhân KẾT LUẬN VA ĐÊ NGHỊ Kết luận • giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đợ chính xác và đợ đúng • Ứng dụng quy trình tối ưu người tình nguyện: protein niệu của mẫu nước tiểu bệnh nhân cao người khỏe mạnh • T̉i thọ của th́c thử theo phương pháp Van’t Hoff xác định được là 29 tháng và theo phương pháp Arrhenius là 30 tháng (cao các chế phẩm ngoại nhập hiện có thị trường Việt Nam là 24 tháng) • Quy trình tối ưu hóa được đánh giá là đạt các yêu cầu của một quy trình phân tích về tính đặc hiệu, Kit thử RPM sản xuất với một vài kit thử RPM thị trường thì kit thử RPM tối ưu hóa có lợi thế cạnh tranh rất lớn với chi phí sản xuất thấp KẾT LUẬN VA ĐÊ NGHỊ Đề nghị o Tiếp tục khảo sát độ ổn định của kit thử RPM theo phương pháp tự nhiên ± C Xác định tuổi thọ của bộ kit điều kiện tự nhiên, từ đó đưa hạn dùng chính xác của bộ kit Sản xuất một lượng lớn bộ kit thử RPM đã tối ưu hóa và sử dụng bộ kit này để định lượng protein niệu của các mẫu thử lâm sàng So sánh kết quả định lượng lâm sàng của kit thử tối ưu hóa với các kit thử khác cùng các mẫu thử để đánh giá độ nhạy và hiệu quả của bộ kit thử sản xuất CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE