KHẢO SÁT độ ổn ĐỊNH CỦA KIT THỬ RPM để ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

Phùng Thị Hoàng Nhi: đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp red pyrogallol molybdat”... TỔNG QUAN Công thức thuốc thử RPM đã đ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

KHOA DƯỢC ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ

RED PYROGALLOL MOLYBDAT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

Giáo viên hướng dẫn: ThS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN

Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ HÀ

Lớp: D09

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo quy chế đăng kí lưu hành thuốc của Bộ y tế Việt Nam, một trong những điều kiện để chế phẩm được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm, tuổi thọ của chế phẩm phải lớn hơn hạn dùng

DS Phùng Thị Hoàng Nhi: đề tài “Thiết kế và tối ưu hóa quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp red pyrogallol molybdat”

Chúng tôi tiếp tục thực hiện đề tài “Khảo sát độ ổn định của kit thử red pyrogallol - molybdat để định lượng protein niệu” với công thức đã được tối ưu hóa.

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Mục tiêu của đề tài

1 Khảo sát đ ổn định của kit thử RPM ộ ổn định của kit thử RPM

đã tối ưu hóa bằng các phương pháp tự

nhiên và lão hóa cấp tốc.

2 Xác định tuổi thọ và hạn dùng của b ộ ổn định của kit thử RPM

kit thử RPM

2 TỔNG QUAN

Phương pháp Red Pyrogallol – Molybdat

để định lượng protein niệu

Nguyên tắc:

Red pyrogallol + molybdat  phức hợp RPM màu đỏ (λmax = 470 nm)

Phức hợp RPM + protein  phức hợp màu tím (λ max = 578 – 612 nm)

Thường được đo ở bước sóng 600 nm

2 TỔNG QUAN Công thức thuốc thử RPM đã được tối ưu hóa

Quy trình định lượng protein

bằng thuốc thử RPM đã tối ưu hóa

2 TỔNG QUAN

Đánh giá quy trình định lượng

Tính đặc hiệu Tính tuyến tính

Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng

Độ chính xác Độ đúng

2 TỔNG QUAN

Nghiên cứu độ ổn định

Lựa chọn lô thử: ít nhất phải có 3 lô, trong đó có 2 lô đủ cho các thử nghiệm và 1 lô có thể ít hơn

Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp dài hạn

Phương pháp lão hóa cấp tốc

Phương pháp sử dụng điều kiện khắc nghiệt

2 TỔNG QUAN

Chế phẩm Nhiệt độ ( o C) Độ ẩm (%)

Thuốc bảo quản thường 25 ± 2 hoặc 30 ± 2 60 ± 5

Thuốc bảo quản lạnh 5 ± 3 Không quy định

Thuốc bảo quản đông lạnh -20 ± 5 Không quy định

Chế phẩm Nhiệt độ ( o C) Độ ẩm (%)

Điều kiện tiến hành độ ổn định dài hạn

Điều kiện tiến hành độ ổn định cấp tốc

2 TỔNG QUAN

Các chỉ tiêu để kết thúc thử nghiệm độ ổn định

- Hàm lượng hoạt chất thay đổi 5% so với giá trị ban đầu.

- Bất kỳ tạp chất liên quan nào vượt quá giới hạn cho phép.

- Các chỉ tiêu như hình thức, màu sắc, đặc tính chức năng không đạt.

2 TỔNG QUAN Xác định tuổi thọ của chế phẩm

Phương pháp dài hạn:

- Dựa vào phương trình đường tuyến tính y = a0 + ax

- Dựa vào công thức t90 = 0,1053/K với K = ln([Dt]/[Do])/t

Phương pháp lão hóa cấp tốc:

- Phương pháp Van’t Hoff

2 TỔNG QUAN Tính chất thuốc thử RPM

Công thức cấu tạo red pyrogallol Công thức cấu tạo natri molybdat

RPM là dung dịch màu đỏ trong nước cất, kém bền với nhiệt Nhạy cảm với ánh sáng, bền với các tác nhân oxi hóa và vi khuẩn Hấp thu cực đại ở bước sóng 470 nm

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

thuốc thử RPM được sản xuất theo công thức đã được thiết kế và tối ưu hóa bằng phần mềm thông minh

nguyên liệu

Trang thiết bị, dụng cụ

Máy quang phổ UV-Vis

Spectro UV 2505 Tủ vi khí hậu Shellab HC9-2

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất, dung môi

Red Pyrogallol , natri molybdat, metanol, axit succinic , natri oxalat, natri Benzoat, Dung dịch protein nồng độ 6 g/dL, nước cất 2 lần.

Chất chuẩn

Dung dịch protein chuẩn nồng độ 100 mg/dL của hãng Biolabo: Số

lô 97016 hạn dùng đến tháng 06/2014.

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp thực nghiệm

Chuẩn bị thuốc thử:

Pha dung dịch mẹ RP 2 mmol/L

Pha dung dịch mẹ natri molybdat 10 mmol/L

Pha dung dịch mẹ axit succinic 200 mmol/L

Pha dung dịch Natri oxalat 100 mmol/L

Pha dung dịch mẹ Natri benzoat 100 mmol/L

Pha thuốc thử RPM theo công thức tối ưu hóa

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quy trình định lượng thực nghiệm

Trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 13 phút Sau đó đo mật độ

quang ở bước sóng 600 nm và đọc đối chiếu với mẫu trắng.

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng

phương pháp RPM trên máy UV – Vis Spectro UV 2505

Khảo sát tính đặc hiệu:

quét phổ từ bước sóng 400 – 800 nm đối với mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính:

đo độ hấp thu của giai mẫu có nồng độ từ 2 – 350 mg/dL

Giới hạn phát hiện: Dựa vào biểu thức LOD = 3,3 SD/b

Giới hạn định lượng: Dựa vào biểu thức LOQ = 10 SD/b

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng

phương pháp RPM trên máy UV – Vis Spectro UV 2505

Tiến hành định lượng với 3 mức nồng độ protein thấp, trung bình, cao.Tính độ đúng (D%) và độ lệch thực nghiệm (B%) so với giá trị lý thuyết:

D = 100%

B =

Ei: Nồng độ protein theo lý thuyết (mg/dL)

Oi: Nồng độ protein theo thực tế (mg/dL)

Di: Độ đúng (%)

B: Độ lệch thực nghiệm (%)

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng

phương pháp RPM trên máy UV – Vis Spectro UV 2505

Tiến hành định lượng với 3 mức nồng độ protein thấp, trung bình, cao.Xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD% ở mỗi nồng độ theo công thức

RSD% = SD/XTB x 100%

SD: độ lệch chuẩn

XTB: Nồng độ trung bình

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ứng dụng quy trình đã được thẩm định trên một số

một số mẫu nước tiểu người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân

Lấy mẫu nước tiểu của người tình nguyện gồm 8 người tình nguyện khoẻ mạnh và 6 người tình nguyện có bệnh lý về thận

Sử dụng mẫu nước tiểu trên định lượng bằng thuốc thử RPM theo quy

trình tối ưu

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Khảo sát độ ổn định của thuốc thử RPM đã được thiết

kế và tối ưu hóa dưới tác động của nhiệt độ

Pha chế các lô thuốc thử RPM.

Chuẩn bị mẫu thử.

Điều kiện khảo sát độ ổn định của thuốc thử RPM.

- Điều kiện tự nhiên: Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 ± 3 oC

- Lão hóa cấp tốc: Bảo quản trong phòng máy lạnh duy trì nhiệt độ 25 ±

2 oC/ RH = 60 ± 5 %

- Thử nghiệm cưỡng bức: Bảo quản trong tủ vi khí hậu duy trì nhiệt độ

40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5 %

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sau những khoảng thời gian bảo quản nhất định, tiến hành lấy mẫu thuốc thử để quan sát và định lượng dung dịch protein 100 mg/dL

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Cảm quan: Màu sắc thuốc thử, màu sắc phức tạo thành khi định lượng, kết tủa

- Định lượng: Sự giảm độ hấp thu của phức hợp màu tạo thành giữa

dung dịch protein và thuốc thử RPM đo được

5 oC x

3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xác định tuổi thọ của bộ kit theo Phương pháp Van’t Hoff

Xác định hàm lượng thuốc sau những khoảng thời gian bảo quản nhất định trong điều kiện để trong tủ vi khí hậu

Tính K theo công thức: K =

Tính tuổi thọ của chế phẩm ở nhiệt độ bảo quản theo công thức

t90 = (ngày)Trong đó:

∆t: Hiệu số giữa nhiệt độ thử nghiệm và nhiệt độ bảo quản

D0: Hàm lượng vào thời điểm ban đầu

Dt:: Hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản t

t: Số ngày từ khi thực hiện khảo sát độ ổn định đến khi lấy mẫu đo

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả thẩm định quy trình định lượng protein

niệu bằng phương pháp RPM

Tính đặc hiệu

Phổ UV – Vis của mẫu trắng

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Phổ UV – Vis của dung dịch protein chuẩn

100 mg/dL với thuốc thử RPM

Phổ UV – Vis của dung dịch protein thử

100 mg/dL với thuốc thử RPM

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường tuyến tính của nồng độ protein trong nước tiểu và độ hấp thu

Hệ số b0 = 0,0116 không có ý nghĩa Nên phương trình tuyến tính là

y = 0,0033x

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện:

LOD = 3,3 x SD/b = 3,3 x 0,0005/0,0033 = 0,500 mg/dL

Giới hạn định lượng:

LOQ = 10 x SD/b = 10 x 0,0005/0,0033 = 1,515 mg/dL

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nồng độ lý thuyết (mg/dL) Nồng độ tìm thấy (mg/dL) RSD%

Độ chính xác

Độ chính xác trong ngày

Độ chính xác khác ngày

Nồng độ lý thuyết (mg/dL) Nồng độ tìm thấy (mg/dL) RSD%

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Độ đúng

Độ đúng trong ngày

Nồng độ (mg/dL) STT Độ hấp thu Nồng độ tìm thấy (mg/dL) Độ đúng (%) Độ lệch thực nghiệm (%)

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Độ đúng khác ngày

Nồng độ (mg/

Nồng độ tìm thấy (mg/dL)

Độ lệch thực nghiệm (%)

Nồng độ tìm thấy (mg/dL)

Độ lệch thực nghiệm (%)

Nồng độ tìm thấy (mg/dL)

Độ lệch thực nghiệm (%)

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ứng dụng quy trình đã được thẩm định trên một

vài mẫu nước tiểu của người tình nguyện

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả độ ổn định

Phương pháp dài hạn ở 5 ± 3 oC

Ln[nồng độ

protein]

Nồng độ

protein

TB (mg/dL)

Ln[nồng độ

protein]

Nồng độ

protein TB (mg/dL)

Ln[nồng độ protein]

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ngày lấy mẫu Nồng độ dung dịch protein trung bình của 6 lần đo (mg/dL)

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thời gian bảo

quản (ngày)

Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff Hoff ở 3 lô

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5%

trong, không có kết tủa, màu sắc

nhạt dần so với ban đầu Dung

dịch tạo thành giữa thuốc thử và

dung dịch protein có màu nhạt

dần so với thời điểm ban đầu

a

c

b

d

a: Thuốc thử RPM thời điểm ban đầu

b: Phức hợp protein với thuốc thử

RPM thời điểm ban đầu

c: Thuốc thử RPM ngày lấy mẫu 61

d: Phức hợp protein với thuốc thử

RPM ngày lấy mẫu 61

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ngày lấy mẫu Nồng độ dung dịch protein trung bình của 6 lần đo (mg/dL)

Phương pháp lão hóa cấp tốc ở 40 ± 2 oC/ RH = 75 ± 5%

Kết quả định lượng:

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thời gian bảo

quản (ngày)

Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff ở 3 lô được

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tuổi thọ của bộ kit

Phương pháp lão hóa cấp

Tuổi thọ trung bình theo

phương pháp Van’t Hoff

(tháng)

Tuổi thọ kit thử tính theo phương pháp Van’t Hoff ở 3 lô:

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

So sánh hiệu quả kinh tế của bộ kit thử

với một vài chế phẩm trên thị trường

thuốc thử (VNĐ)

Tuổi thọ (tháng)

4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Bàn luận

Kit thử RPM được sản xuất theo quy trình tối ưu hóa sẽ có thể

thay thế các chế phẩm ngoại nhập hiện có trên thị trường mà vẫn đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm và giúp giảm thiểu chi phí cho bệnh nhân.

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1

•Quy trì

nh tối ư

u hóa được đán

h giá

là

đạt các yê

u c

ầu của hát ạn p ới h gi ệu, hi đặc ính ề t h v tíc phân nh trì quy một

hiệ

n, giớ

i hạn địn

h lượng

, độ chín

h xác v

i thọ c

ủa thuố

c th

ử th

eo phương

pháp Van

’t Ho

ff xác đị

nh áng 30 th là us eni Arrh pháp ng hươ o p the và áng 29 th là ợc đư

(cao hơ

n các c

hế

phẩ

m ngoại nh

ập hiệ

n có trên thị trư

ờng Vi

4

•Kit thử

RPM sản xu

ất với mộ

t và

i k

it thử RPM trê

n thị trường

thì hí hi p i c vớ lớn rất tranh ạnh ế c th lợi có óa u h i ư tố PM R thử kit

sản xuất th

ấp hơn

Kết luận

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Đề nghị

Tiếp tục khảo sát độ ổn định của kit thử RPM theo phương

kiện tự nhiên, từ đó đưa ra hạn dùng chính xác của bộ kit

Sản xuất một lượng lớn bộ kit thử RPM đã tối ưu hóa và sử dụng bộ kit này để định lượng protein niệu của các mẫu thử lâm sàng So sánh kết quả định lượng lâm sàng của kit thử tối

ưu hóa với các kit thử khác trên cùng các mẫu thử để đánh giá độ nhạy và hiệu quả của bộ kit thử sản xuất.

CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN

ĐÃ LẮNG NGHE