BIOLOGIE MOLECULAIRE FONDAMENTALE CHAPITRE : ADN-Réplication Học thuyết trung tâm : Dòng chảy thông tin di truyền theo hướng từ ADN sang ARN tới protein, có số trường hợp ngoại lệ I) Structure ADN (Acide DésoxyriboNucléique) : ADN polydesoxyribonuclotide tạo nên từ nhiều desoxyribonucleotide nối với liên kết phosphodiester ADN có ba thành phần quan trọng : a) Pentose 2'-désoxyribose, đường carbone, thiếu nhóm OH (désoxy), khác biệt này, so với việc trở thành ribose bình thường hoàn hảo, désoxy vị trí 2' b) Các base chứa nitơ : - Gắn vào ribose - Base chứa C, H, O N - Chúng gồm loại : adenine (A), guanine (G), thymine (T), cytosine (C) c) Triphosphate, monomer để tạo ADN Chúng ta có phân tử dương vị trí C 1' có base, C 5' có triphosphate Triphosphate góp lượng cho phản ứng trùng hợp Khi polymer hoá, ta có base, CH2, phosphate chiều polymer hoá từ C 5' đến C 3' Đó lặp lại đường phosphate, điều khác biệt có bases bao gồm purines (A G), pyrimidine (T C) Notes : Pentose* + Base = Nucleoside Nucleoside + Phosphate = Nucleotide ADN có cấu trúc xoắn kép theo chiều tay phải Hai mạch xoắn với theo chiều ngược lại : mạch từ 5' – 3', mạch từ 3' – 5' Base mạch nối với base mạch liên kết hydrogen : A=T C=G (một gạch liên kết H) Các nucleotide mạch nối liên kết phosphodiester ADN mang điện tích âm DNA phân tử phân cực : - Một nucleotide có đầu 5' gốc P đầu 3' gốc OH - Do đó, DNA có đầu 5'Pi đầu 3'OH Hình dạng kích cỡ : - Hình dạng : + Thẳng : hầu hết génome tế bào eucaryotes số virus (phages) + Vòng : hầu hết plasmid, gen vi khuẩn, gen ti thể, gen lạp thể số virus DNA + Siêu vòng (supercoil) : DNA vòng xoắn vào - Kích cỡ : + Chiều dài : 34A / xoắn 10.5bp + Khối lượng phân tử : 1bp = 660 Da II) Condensation de l'ADN : BỘ GENE CỦA PROCARYOTE : Bộ gene đa số sinh vật procaryote phân tử ADN có dạng vòng không gắn với protein để tạo thành nhiễm sắc thể eucaryotes Ở procaryote, ADN thường dạng siêu xoắn với ADN mạch kép xoắn vặn thành hình số Đây dạng tự nhiên tế bào vi khuẩn, sợi ADN phân tử ARN nối giúp cuộn xoắn làm cho chiều dài phân tử rút ngắn đáng kể Tình trạng siêu xoắn thay đổi thuận nghịc tác động enzym ADNase ARNase Ngoài ADN dạng vòng tròn dạng thẳng BỘ GENE CỦA EUCARYOTE : Cách tổ chức DNA nhân tế bào DNA eucaryote có kích thước lớn, ví dụ người tổng chiều dài tất DNA có nhân tế bào dài đến 2m Để nằm gọn nhân tế bào, DNA phải cuộn xoắn nhiều mức độ cấu trúc khác DNA người dài gấp 600 lần khoảng cách từ Trái Đất tới mặt trời Làm cách mà lượng DNA khổng lồ gói lại thành nhiễm sắc thể chứa nhân tế bào tí hon ? (http://vnbiology.blogspot.fr/2016/07/ong-goi-dna-nucleosome-va-chromatin.html) Hệ gen đơn bội người chứa khoảng 3,2 tỉ cặp base gói thành 23 NST Hầu hết tế bào thể (trừ tế bào giao tử đực cái) nhị bội, chứa 23 cặp NST Điều có nghĩa tế bào chứa tỷ cặp base DNA Vì cặp base dài khoảng 0,34 nm nên tế bào nhị bội chứa : (0,34 x 10-9) x (6 x 109) = 2m Hơn nữa, người ta ước tính thể người chứa khoảng 50 nghìn tỷ tế bào, có nghĩa người có 100 nghìn tỷ mét DNA Khoảng cách từ Mặt Trời tới Trái Đất 150 tỷ mét, có nghĩa người có lượng DNA dài 600 lần khoảng cách từ Trái Đất tới Mặt Trời Sao lại ? DNA, Histone Chromatin (sợi nhiễm sắc) Câu trả lời nằm chỗ sợi DNA số protein gói gọn lại Các protein gọi histone, phức hợp DNA-histone gọi chromatin (sợi nhiễm sắc) Điều giống ta quấn sợi len dài quanh lõi để tạo thành cuộn len nhỏ gọn Histone họ gồm protein nhỏ, tích điện dương có tên H1, H2A, H2B, H3 H4 DNA tích điện âm gốc phosphate khung đường-phosphate nên histone liên kết chặt vói Hình Các nhiễm sắc thể tạo thành từ DNA quấn chặt quanh histone DNA nhiễm sắc thể gói gọn nhân nhờ hỗ trợ histone Histone protein tích điện dương liên kết chặt với DNA tích điện âm tạo thành phức hợp gọi nucleosome Mỗi nucleosome gồm sợi DNA quấn 1,65 vòng quanh protein histone Các nucleosome quấn lại thành sợi nhiễm sắc dày 30 nm, sợi lại tạo thành đoạn lặp lại trung bình khoảng 300 nm Sợi 300 nm nén gấp lại thành sợi dày khoảng 250 nm Cuối cùng, sợi cuộn xoắn chặt lại thành nhiễm sắc tử NST Nucleosome : Đơn vị cấu trúc chất nhiễm sắc Đơn vị cấu trúc chất nhiễm sắc nucleosome, tạo thành từ protein histone khoảng 146 cặp base DNA Dưới kính hiển vi điện tử, nucleosome trông giống hạt chuỗi hạt Hình Ảnh kính hiển vi điện tử chất nhiễm sắc Trong ảnh này, nucleosome (mũi tên) trông giống hạt chuôi hạt Ngày nay, nhà khoa học biết cấu trúc nucleosome sau : protein loại histone (H2A, H2B, H3 H4) kết hợp với tạo thành tám (octamer) histone, tám liên kết quấn khoảng 1,65 vòng DNA, hay khoảng 146 cặp base Protein histone H1 bổ sung thêm quấn thêm 20 cặp base nữa, tạo thành hai vòng quấn hoàn chỉnh quanh tám, tạo thành cấu trúc gọi chromatosome Như vậy, quanh tám histone có khoảng 166 cặp base, không dài lắm, NST chứa tới 100 triệu cặp base Do đó, NST chứa hàng trăm ngàn nucleosome, nucleosome gắn với đoạn DNA tự nằm chúng (dài khoảng 20 cặp base) Các DNA nằm nucleosome gọi DNA liên kết (linker DNA) Dưới hình ảnh tinh thể cấu trúc nucleosome Khung phosphodiester DNA chuỗi xoắn kép có màu nâu xanh ngọc lam, protein histone có màu xanh dương (H3), xanh (H4), vàng (H2A) đỏ (H2B) Lưu ý có tế bào nhân chuẩn eucaryote có nucleosome, tế bào procaryote Hình Cấu trúc nucleosome Sợi nhiễm sắc cuộn lại thành cấu trúc bậc cao Việc gói gọn DNA thành nucleosome rút ngắn chiều dài sợi DNA khoảng lần Nói cách khác, đoạn DNA dài m trở thành sợi nhiễm sắc dạng chuỗi hạt dài khoảng 14 cm Dù vậy, sợi nhiễm sắc dài để chứa nhân, vốn có đường kính khoảng 10 đến 20 micromet Do đó, chromatin cuộn lại thành sợi ngắn hơn, dày gọi sợi 30 nm sợi có đường kính khoảng 30 nm Hình Hình ảnh kính hiển vi điện tử sợi nhiễm sắc Sợi nhiễm sắc 30 nm Scale bar = 50 nm Các trình phiên mã tái yêu cầu hai sợi DNA phải tạm thời tách rời nhau, cho phép polymerase tiếp cận sợi DNA khuôn Tuy nhiên, nucleosome cuộn gấp sợi NS thành sợi 30 nm lại hàng rào cho enzyme Do đó, tế bào phải có chế để giãn (giảm cuộn xoắn) sợi NST và/hoặc tạm thời loại bỏ histone phép phiên mã tái xảy Nói chung, có hai chế khiến sợi NS trở nên dễ tiếp cận : - Các histone bổ sung thêm gốc acetyl, methyl phosphate - Các histone dịch chuyển phức hợp tái cấu trúc sợi nhiễm sắc (chromatin remodeling complex), qua polymerase enzyme khác tiếp cận với trình tự DNA bao quanh Các biến đổi thuận nghịch nên sợi nhiễm sắc quay trở lại trạng thái nén gọn trước sau thực xong phiên mã và/hoặc tái Nhiễm sắc thể gói gọn trung kì (metaphase) So sánh chiều dài NST trung kì với DNA không cuộn nén tỷ số DNA NST giai đoạn trung kì khoảng 10000:1 (tùy vào NST) Điều tương tự cuộn đoạn dây dài sân bóng đá thành khối ngắn cm Mức độ nén đạt nhờ việc cuộn, gấp sợi NS liên tục thành vòng lặp xoắn (Hình 1) Cơ chế xác điều chưa rõ, phosphorylation histone H1 đóng vai trò http://tailieu.tv/tai-lieu/cau-truc-sieu-vi-the-cua-nhiem-sac-the-10801/ Nucleosome sợi 10nm Ở trạng thái ngưng tụ nhất, NST nhìn thấy kính hiển vi điện tử dạng sợi mảnh có kích thước (bề dày) 10nm Dưới KHVĐT, sợi trông chuỗi cườm, gồm hạt nhỏ đường kính khoảng 10nm nối với sợi ADN Hạt nhỏ nói gọi nucleosome Nucleosome đơn vị cấu trúc phức hợp ADN-histone Trong nucleosome, có phân tử histone gồm loại, kí hiệu H2A, H2B, H3 H4, loại phân tử Mỗi phân tử histon chứa từ 107 đến 135 gốc acid amin, tức thuộc loại protein PTL tương đối nhỏ Histon có tính kiềm cao, có nhiều gốc acid amin Lys, Arg tích điện dương Tám phân tử histon xếp thành phức hợp lõi (octamer), phân ly thành hai nửa (tetramer) Phức hợp lõi có đoạn ADN dài 146b khoảng hai vòng bên gọi nucleosome Đó hạt dẹt có đường kính 11nm Sợi ADN nối nucleosome dài chừng vài chục base nito gọi ADN nối (linker ADN) Tổng cộng hai vòng ADN quanh lõi histon đoạn ADN nối tạo thành chu kì lặp lại nucleosome ADN, dài vào khoảng 200b Như vậy, gen cỡ trung bình dài chừng 10kb chứa khoảng 50 nucleosome Bên nucleosome có thêm phân tử histon( H1) gắn lỏng lẻo (dễ phân ly) Sự liên kết đồng thời phân tử histon H1 vào nucleosome làm cho sợi 10nm ngưng tụ chặt Các histon lõi gắn chặt với ADN, trình chép mã, cấu trúc nucleosome NST không bị phân ly hoàn toàn Người ta cho tổng hợp ARN khuôn ADN, enzym ARN-polymeraza chạy đến nucleosome lõi histon nucleosome phân ly tạm thời thành mảnh enzyme « làm việc » Cơ chế « mở để làm việc tạm thời » đối nucleosome có tính chất bảo tồn, không thay đổi suốt lịch sử tiến hóa eucaryote, cấu trúc bậc histon không thay đổi nhiều loài Sợi nhiễm sắc 30nm Histone H1 liên kết vào nucleosome khiến cho sợi 10 nm bị ngưng tụ chặt chẽ hình thành sợi lớn hơn, gọi sợi nhiễm sắc 30nm Mô hình cấu tạo trình bày hình, ta thấy sợi 10 nm tạo thành chuỗi xoắn (solenoid) có bề ngang chừng 30nm Trong NST có đoạn ADN tương đối dài không liên kết với histon không ngưng tụ thành nucelosome Các đoạn nhạy cảm với ADN-az Ngưng tụ cấp cao Sau ngưng kết thành sợi 30nm, phân tử ADN xếp gọn lại với độ dài chừng 0,1 cm Tuy nhiên, chiều dài lớp gấp khoảng 100 lần đường kính nhân ! Trong thực tế, NST nhân gian kỳ, phần lướn sợi nhiễm sắc 30nm ngưng tụ tiếp tục thành sợi nhiễm sắc có kích thước chừng 100 nm (bề dày) Tuy nhiên, mô hình cấu trúc chưa rõ Ðối với nhân tế bào phân chia, nhiễm sắc ngưng tụ cách đậm đặc Sợi 30nm uốn lượn thành vòng, vòng chứa chừng 20-100kb Một dãy vòng nối với trục protein Dãy vòng có bề dày chừng 300nm, chúng gấp lại đoạn định xếp thành cấu trúc cao (700nm) Cấu trúc 700nm ngưng tụ vào nhiễm sắc thể nhân gián phân, trung kỳ nhiễm sắc thể có bề rộng cỡ 1400nm dài vài micromet (10 -6 m) So với chiều dài lý thuyết ADN trạng thái duỗi hoàn toàn (1cm = 10-2 m), kích thước nói thu gọn cỡ 10000 lần với trật tự hoàn hảo III) Structure des chromosomes : a) Centromère – Télomère : - Khảo sát NST giai đoạn phân bào KHV điện tử cho thấy NST cấu tạo gồm thành phần riêng biệt Mỗi thành phần có dạng hình que gọi sợi nhiễm sắc Hai sợi nhiễm sắc NST liên kết với cách chắn centromere (tâm động) Centromere nơi chứa đoạn DNA có tính lặp lại cao (highly repeated DNA sequences) có chức vị trí gắn kết số protein chuyên biệt kinetochore Kinetochore nơi siêu ống thoi phân bào gắn vào nơi tập trung nhiều protein chuyển động kinesin dynein - Télomère : https://hoctotsinhhoc.wordpress.com/2012/05/11/telomere/ http://thpt-nguyentatthanh-kontum.edu.vn/upload/Tailieu/Telomere.pdf Là cấu trúc đặc thù nằm hai đầu mút NST sinh vật nhân chuẩn, không chứa gen, gồm trình tự ngắn lặp lại nối tiếp ngàn lần đặc trưng cho loài Chúng cần thiết cho ổn định hệ gen, bảo vệ NST trình phân bào giữ cho chúng không bị dính vào b) Euchromatine – Hétérochromatine : Đồng nhiễm sắc dị nhiễm sắc Dưới kính hiển vi quang học, tùy theo mức độ bắt màu kiềm hay nhiều mà chất nhiễm sắc phân biệt thành đồng nhiễm sắc dị nhiễm sắc Dị nhiễm sắc (hétérochromatine) vùng có cấu trúc ngưng tụ đậm đặc (bắt màu rõ) tế bào không phân chia (gian kì) Dị nhiễm sắc bao gồm dị nhiễm sắc vĩnh viễn dị nhiễm sắc tạm thời Dị nhiễm sắc vĩnh viễn (constitutive heterochromatin) đoạn NST ngưng tụ đậm đặc loại tế bào thể Phần lớn đoạn bao gồm ADN có chuỗi nucleotid lặp lặp lại cách đơn giản (ADN đồng hành = satelite DNA) Chúng tạo thành tâm NST, tức vị trí mà tế bào phân chia, NST gắn với siêu ống thoi vô sắc Dĩ nhiên, NST bình thường có tâm Nói cách khác, heterochromatin định, tức phần cố định gen không biến đổi thành euchromatin, chúng coi bất hoạt mặt di truyền Dị NS tạm thời (facultative heterochromatin) đoạn NST ngưng tụ số tế bào thể, giai đoạn biệt hóa tế bào Chúng không phiên mã, ADN chuỗi lặp lại đơn giản mà chứa gen thực thụ Tế bào biệt hóa tỷ lệ dị NS tạo thời lớn, hay nói cách khác có nhiều gen bị khóa lại, NST X phụ nữ trường hợp đặc biệt mà tất gen bị khóa trạng thái dị NS tạm thời Nói cách dễ hiểu hơn, heterochromatin không ổn định bao gồm euchromatin vùng bắt giữ màu cô đặc (theo nghĩa đóng xoắn chặt) đặc trưng euchromatin số giai đoạn phát triển, hay nói cách khác, thực chất vùng euchromatin biến đổi thành heterochromatin kì trung gian (interphase) số mô Đồng NS (euchromatin) phần lại NST, nơi có chất NS ngưng tụ lỏng lẻo hơn, bắt màu Đồng NS chứa số ADN không hoạt động phiên mã Nhưng tất đoạn ADN NST có phiên mã phải nằm trạng thái đồng NS Ở tế bào người động vật có xương sống, gen có phiên mã thường chiếm chừng 1/10 tổng số gen Ngay tế bào phân chia, NST ngưng tụ đậm đặc chứa vùng chất NS hoạt động, nhạy cảm với tác dụng phân hủy ADN-az Điều chứng tỏ ADN liên kết lỏng lẻo với histon Tại vùng chất NS hoạt độgn phiên mã, thành phần protein có đặc điểm khác với vùng không hoạt động : - Histon H1 phân ly khỏi sợi 10nm - Các histon khác bị khử bớt điện tích dương, gắn thêm gốc acetyl gốc phosphoryl (acid) vào chuỗi bên gốc acid amin kiềm (ví dụ lysin) Do vậy, lực hút tĩnh điện histon (bazo) với gốc phostphat (acid) ADN bị giảm : - Histon H2A bị thay tiểu phần phụ có cấu trúc bậc khác với histon H2A thông thường - Sự có mặt protein thuộc nhóm linh động (HMG protein) http://thuvienso.daihocthudo.edu.vn/doc/ebook-mot-so-van-de-cua-sinh-hoc-phan-tu-vo-thi-huonglan-328778.html Điều hòa biểu gen thay đổi cấu trúc NST hay cấu trúc phân tử DNA - Chủ yếu điều hòa cấu trúc chất NS (chromatin) - Trong vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) nơi chất NS đóng xoắn chặt, gen thường không biểu - Sự biến đổi hóa học histone DNA chromatin có ảnh hưởng đến cấu trúc chromatin biểu gen Hình 48.6 : chế điều biến histone, AC : acetylation, Me : Methylation, Ub : ubiquitination ubiquitin protein gắn vào protein khác có khả giải xoắn protein thành peptid bậc I, SU : sumoylation sumo phân tử ubiquitin có khối lượng nhỏ có tên small ubiquitin modification, P : phosphorylation http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan4/chuong48-daicuongngoaiditruyenhoc/index.html https://www.sinhhoc.edu.vn/biology/ebook/giao-trinh/mot-so-van-de-cua-sinh-hoc-phan-tu-42.html (tải đổi đuôi HT thành ar) sau giải nén với mật sinhhoc.edu.vn NST chuyển từ dạng không hoạt động (đóng) thành dạng hoạt động (mở) trình điều hòa sau dịch mã (postranslational modification) histone Ngày nay, người ta biết trình điều hòa cộng hóa trị (covalent modification, gọi histone code) histone bao gồm acetyl hóa lysine, methyl hóa lysine arginines, phosphoryl hóa serine threonines, ADP-ribosyl hóa acid glutamic, ubiquitin hóa sumoyl hóa lysine Những trình điều hòa xảy đầu N protein histone phần nằm nucleosome a Sự acetyl hóa histone : Nhóm acetyl gắn vào lysine tích điện dương đuôi histone ⇒ chromatin tháo xoắn ⇒ phiên mã b Sự methyl hóa DNA : - Nhóm methyl gắn vào chromatin Sự gắn thêm nhóm phosphate gần acid amin bị metyl hóa làm cho chromatin tháo xoắn - Trong sinh vật đa bào, metyl hóa ADN dấu hiệu biểu gen liên quan tới biệt hóa mô tế bào Trình tự nhận biết cho metyl hóa ngắn, động vật thường CG thực vật CNG http://documents.tips/documents/bao-cao-hoan-thin-epigeneticpptx.html http://123doc.org/document/2046757-cac-nucleus-hat-nhan-la-dau-hieu-cua-te-bao-co-nhan-dienhinh-pps.htm?page=4 Một số phân tử khác … - Nucléase micrococcale : enzyme nuclease cắt bên bên ADN hay ARN dạng mạch đơn hay mạch đôi, sử dụng để cắt rời nucléosome khỏi http://ambn.vn/product/29462/Tong-hop-mot-so-dan-chat-cua-glutaramid-mang-khungbenzothiazol-huong-uc-che-histon-deacetylase.html http://luanvan-thacsi.blogspot.fr/2016/04/khoa-luan-tot-nghiep-duoc-sitong-hop-va_22.html - Chromatin-modifying complexes : protein histone tạo thành lõi thể nhân Tuy nhiên, acid amin trình tự kết thúc histone nhô Những phần nhô sửa đổi được, tiên tố, phosphoryl hóa methyl hóa acid amin cụ thể (hình minh họa), việc thay đổi đóng vai trò quan trọng trình phiên mã Mặc dù đuôi không cần thiết để trì toàn vẹn cấu trúc nucleosome, vai trò cấu trúc NST bậc cao tương tác với non-histone chromosomal proteins Sự acetyl hóa histone thực enzyme histone acetyltransferases (HATs) phản ứng ngược lại xúc tác enzyme histone deacetylases (HDACs) Sự acetyl lysin việc loại bỏ điện tích dương từ protein (hình b) Những đuôi histone acetyl hóa tương tác với DNA lỏng lẻo để phức histone-DNA linh động dễ dàng phân ly để trình phiên mã xảy HDAC : découvre une charge + sur les histones QUESTION POUR LE PREMIER CHAPITRE • Représentez les différents niveaux de compaction de l'ADN chez un procaryote • Pourquoi obtient-on des fragments de 200 nucléotides après digestion par la nucléase de microccocus ? • Pourquoi les protéines comme les histones liant l'ADN sont riches en acides aminés basiques ? • Quelle est la structure chromatinienne d'un centromère ? Citez une caractéristique • Quelles sont les modifications des histones provoquant un changement de compaction ?