Đề cương CNSH trong Nông nghiệp

Đề cương CNSH trong Nông nghiệp, sử dụng công nghệ động vật trong Nông nghiệp đầy đủ, chi tiết phục vụ thi cuối kỳ. Nhận làm thuê slide cực đẹp, chuyên nghiệp, giá cực rẻ và nhanh chóng tại Hà Nội: 0966.839.291. Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Tài Nguyên Và Môi Trường. Nhận đào tạo về Powerpoint.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP (VẤN ĐÁP CÂU) CÂU NUÔI CẤY SƠ CẤP TBĐV? Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) trình nuôi TB trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền (subculture) Sau việc nuôi cấy đc gọi nuôi thứ cấp (sencondary culture) 1) Thu nhận mẫu xử lý sơ bộ: ① L{m mô vị trí lấy cách rửa sát trùng cồn, đưa mô v{o bảo quản dd DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) ② Xử lý sơ mẫu mô, bao gồm rửa nhiều lần dd PBS (Phosphate Buffered Saline) có bổ sung kháng sinh (thường gentamicin hay penicillin streptomicin) chất kháng nấm ③ Sau cắt bỏ mô chết, phần thừa (mỡ…) ④ Cắt nhỏ mẫu mô thành mảnh 2-3 mm2 ⑤ C|c mẫu n{y sd để nuôi phá triển mảnh mô sd để tách rờ c|c TB sau 2) Tách rời TB (bằng học; enzyme; phương ph|p kh|c): a Bằng học: - Cắt nhuyễn mô: sd lực học bẻ gãy cầu nối liên b{o ƯĐ: khả sống TB cao NĐ: hiệu ko cao, số lượng TB đơn thu đc (C|c bước: Cắt nhuyễn mô  huyền phù dd PBS  ly tâm  TB + dịch) - Ép nhuyễn mô: Sd phiến lame để tách TB mô lk yếu (l|ch…) NĐ: hiệu suất ko cao (Các bước: Ép nhuyễn mô  huyền phù PBS  ly tâm  TB) - Tách màng lọc TB (cell strainer): đường kính lỗ 70-100 μm Đặt mẫu mô lên màng lọc, sd pitton syringe (đọc l{ sơ-ranh) để chà xát mạnh mảnh mô  TB va chạm v{o lưới lọc tách rời, TB đơn có đường kính bé lỗ lọc lọt qua b Tách enzyme: - Cầu nối gian bào chất peotein  sd enzymes protease để t|ch c|c TB Thường dùng trypsin - Trypsin E kiềm tính điển hình (hđ pH = 6-9, tối ưu 8-9) có tác dụng cắt liên kết: + nhóm carboxyl (-COOH ) lysin arginin + nhóm amin (-NH2) aa liền kề với chúng (ngoại trừ lk lysin arginin) - Trypsin KO ĐẶC HIỆU loại pro  làm vỡ TB dùng nồng độ cao dùng thời gian dài - Nồng độ thường dùng 0.25% trung hòa huyết thu đc TB đơn c Các pp khác: (không thi viết cho có) - Ly tâm theo gradien tỉ trọng: TB lắng lớp gradien tỉ trọng tương ứng vs tỉ trọng chúng - Quy trình Ficoll: dùng ph}n t|ch TB m|u đơn nh}n - Marker bề mặt: thường dùng để phân lập tách TB gốc 3) Nuôi cấy thu nhận TB: (1) Dùng pipetman hút vào ống eppendorf, ống ml dịch tách TB (2) Ly tâm 1000 v/ph 10 ph  bỏ dịch (3) Cho vào eppendorf 1ml môi trường nuôi; huyền phù vortex (4) Hút dịch huyền phù TB eppendorf cho vào bình nuôi cấy bố sung thêm 1ml môi trường nuôi (5) Ủ 37.5oC 5% CO2 tủ nuôi; 24h thay môi trường tiếp tục ủ CÂU NUÔI CẤY THỨ CẤP TBĐV? 1) Kỹ thuật chọn dòng TB: Đ}y l{ kỹ thuật dùng để t|ch riêng clony TB đĩa nuôi có nhiều dạng TB khác Thực sau: (1) Tạo huyền phù TB trypsin (2) Cấy TB v{o môi trường mới, nồng độ 1000 TB/ml  nuôi đến chúng phát triển clony riêng rẽ (3) Chọn clony TB cần tạo dòng cấy sang môi trường  Cấy chuyền TB: (1) (2) (3) (4) Đổ bỏ môi trường cũ Rửa bề mặt giá thể nuôi (bằng PBS (-)) Tách TB bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi (bằng trypsin-EDTA) Pha loãng TB môi trường (dùng môi trường E’MEM) 2) Các phương pháp chọn/tạo dòng TB: Mục đích: - Đảm bảo c|c TB ch|u để xuất phát từ TB đơn v{ có đặc tính di truyền  ngăn biến đổi nhanh v{ ko đo|n trước đc kiểu hình - Cho phép sàng lọc số lượng lớn dòng TB có đặc tính mong muốn - Trong môi trường nuôi cấy, TB riêng rẽ nguyên cmn phân tạo TB con, chúng quần tụ vị trí TB mẹ ban đầu hình thành clony  tất TB clony có KG KH C|c phương ph|p chọn dòng: 3pp PP ống syringe: giúp thu nhận tập đo{n TB quan t}m đc nuôi cấy môi trường thạch PP pha loãng tới hạn: nồng độ pha loãng thấp, thể tịch dung dịch chứa TB  nuôi cấy  hình thành tập đo{n (HAY DÙNG) PP dùng môi trường không huyết 3) Xây dựng đường cong tăng trưởng đo phát triển: Mục đích: ph}n tích c|c đặc điểm phát triển kiểu TB hauy dòng TB Sd buồng đếm hồng cầu  đưa cách trực tiếp số lượng TB  từ suy phát triển 4) Thử nghiệm tìm điểm giới hạn: Điểm giới hạn (end-point): mốc mà số lượng TB đạt mức tối đa điều kiện nuôi cấy đc x|c định Nhằm đ|nh gi| pứ TB (số lượng) nhan tố đc khảo sát (thuốc) thêm v{o môi trường nuôi Có 3pp tìm điểm giới hạn: dựa vào huỳnh quang; so màu MTT; sd phân tử [3H] thymidine 5) Hiệu trải: X|c định TB đơn sống sót hình thành nên tập đo{n theo công thức: số tập đo{n hình th{nh/số TB đem trải x 100% CÂU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH DỊCH? Đánh giá đại thể: Lượng xuất tinh (V): lợn 200-400ml , bò 3-6ml Màu sắc, mùi tinh dịch: màu sữa đặc đến màu kem sữa, màu trắng xám Độ pH: 6,8-7,2 Đánh giá vi thể: Nồng độ tinh trùng (C): tinh dịch lợn nội thường có (C)= 100-250 triệu/ml ; lợn ngoại có (C)= 250350 triệu/ml C|ch x|c định: sd m|y so m{u quang điện; buồng đếm hồng cầu; ống Karat Tinh trùng kỳ hình (K): tinh trùng có hình dạng kh|c thường so với tinh trùng bình thường khả thụ thai Để kiểm tra tinh trùng kỳ hình người ta sd pp nhuộm xanh metylen , tím violet… Sức đề kháng (R): sức đề kháng tinh trùng môi trường l{ đẳng trương Sử dụng nước muối 1% để ktra v{ đ|nh gi| lượng dd cần thiết phs lo~ng đợn vị tinh dịch đến toàn lượng tinh trùng ngừng hđ tiến thẳng Sức hoạt động (A): tỉ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có vi trường quan s|t đc, việc đ|nh gi| theo thang điểm 10 Tinh dịch lợn ngoại (A) thường đạt 0,8; lợn nội (A) thường đạt 0,7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng Tỷ lệ sống chết tinh trùng: Những tinh trùng chết nhuộm bắt màu thuốc nhuộm Eosin, tinh trùng sống không bắt màu Cách tiến hành: Lấy phiến kính khô,  nhỏ giọt tinh nguyên lấy  nhỏ 1-2 giọt dd Eosin 5% bên cạnh giọt tinh dịch  dùng đũa thủy tinh trộn phết tiêu (dàn mỏng mẫu lên phiến kính)  ktra độ phóng đại 400-600 lần Những tinh trùng m{u đỏ/hồng Eosin l{ tinh trùng đ~ chết, tinh trùng trắng sống Đếm 300 tinh trùng tổng số cách ngẫu nhiên tính tỷ lệ sống, chết Trong nghiên cứu: áp suất thẩm thấu, lực đệm, tình trạng acrosome Ngoài pp thủ công, ng{y người ta sd phần mềm Sperm Version, có lợi ích như: Tăng suất công việc sx tinh dịch lên 15% Có tính thích hợp việc đ|nh gi| l{ chuẩn Chính xác, nhanh chóng, dễ dàng Kiểm so|t đc qua c|c thông số Soạn báo cáo Điều chỉnh tự động, tự động đếm tinh trùng sống, chết Bảo quản nguồn liệu an toàn, bảo mật CÂU PHA LOÃNG, BẢO TỒN, VẬN CHUYỂN TINH DỊCH? Mục đích ý nghĩa: - Pha loãng tinh dịch: tăng lượng tinh dịch, nâng cao hiệu kinh tế chăn nuôi - Bảo tồn tinh dịch: kéo dài tg sống tinh trùng thể, thời gian sd tinh dịch đc kéo d{i - Vận chuyển/nhập tinh: thuận tiện, chi phí thấp - Rút ngắn tg cải tạo đ{n gia súc phạm vi rộng, phòng chống đc số bệnh nguy hiểm l}y theo đường tình dục Yêu cầu mt pha loãng bảo tồn: cung cấp lượng, kháng khuẩn, chất đệm, tạo dd đẳng trương ❶ Kĩ thuật pha tinh dịch (cho lợn): Sử dụng môi trường VCN Sử dụng môi trường BTS B1: cho túi lớn v{o nước cất vừa đun sôi v{ khuấy tan B1: Đảm bảo nhiệt độ mt trc pha gần tương đương với nhiệt độ tinh dịch B2: đợi nhiệt độ dd xuống 40oC cho tiếp hóa chất túi nhỏ vào khuấy tan hoàn toàn B2: Cho mt chảy từ từ vào tinh dịch, tránh sốc cho tinh trùng Đảm bảo liều tinh sau pha có chứa không B3: pha tinh lợn 35oC 3.109 tinh trùng sống B4 bảo tồn tinh dịch 18-20oC B3: Làm lạnh từ từ tinh dịch đ~ pha xuống 15-18oC 2h ❷ Đông lạnh tinh dịch bò: (tinh dịch bò nên ko pha loãng đông lạnh mđ: bq đc lâu) - Môi trường: Môi trường Môi trường Lactose 11% 75 ml ml Glycerin ml ml Lòng đỏ trứng 20 ml 20 ml Penicillin 100.000 UI 100.000 UI Streptomycin 0.1 mg 0.1 mg Sữa tươi ml 73 ml - Đông lạnh đá CO2: Cưa đ| CO2 khối hình chữ nhật có bề mặt thật phẳng  dùng bàn nóng mặt có nhiều đinh sắt ấn lên bề mặt đ| tạo lỗ tròn nhỏ  nhỏ tinh dịch v{ Kết cho viên tinh đặn v{ đẹp - Đông lạnh Nitơ lỏng: Đặt mica cách bề mặt nito lỏng 5-20cm nhỏ tinh dịch lên mica  sau 3-5p thu đc viên tinh (Không tốn viên tinh l{m xấu hơn) Cho viên tinh vào cọng tinh có ghi số hiệu đực, có ghi ng{y th|ng đông lạnh Người ta thường đóng cọng rạ làm loại: 0,25ml loại 0,5ml Thông thường cọng rạ chứa khoảng 18-20 triệu tinh trùng Đưa v{ bảo quản nito lỏng Sau 30p ktra tiêu hoạt lực tinh trùng (A) Chỉ giữ lại lô tinh có A = 0,3 ❸ Vận chuyển tinh dịch: nhiều phương tiện Yêu cầu: Đảm bảo chất lượng tinh tốt, không để xảy choáng Ktra chất lượng tinh, đổ đầy nito lỏng Phải có sổ sách ghi chép Tuyệt đối an toàn vận chuyển CÂU KỸ THUẬT DẪN TINH CHO BÒ? Dẫn tinh trình người sd dụng cụ chuyên dụng thông qua kỹ thuật thích hợp để đưa tinh dịch gia súc đực vào đg sinh dục gia thời súc điểm vị trí thích hợp, đem lại kết thụ thai cao 1) KỸ THUẬT PHÁT HIỆN BÒ ĐỘNG DỤC:  PP đực thí tình: - Phát nhanh chóng xác kể bò c|i động dục thầm lặng Không phát đc tất bò c|i động dục ngày, bám theo số mà bỏ qua số khác  PP túi thị: - Túi thị túi polyetylen mỏng, dễ vỡ, chứa khoảng 50-100ml chất thị m{u đỏ/màu xanh gắn v{o vùng xương sống đuôi bò c|i chưa có chửa Khi động dục, bò khác nhảy lên lưng đè vỡ túi làm cho phần mông vật có màu giúp dẫn tinh viên (người dẫn tinh) dễ dàng phát động dục  PP quan sát: - Quan sát vài lần ngày Mỗi lần theo dõi cần khoảng 25-35p Nếu có bò động dục nhảy lên bò khác để khác nhảy lên lưng Biểu bò động dục: - Trước chịu đực: Băn khoăn, ngơ ng|c, lại không yên, ăn Thỉnh thoảng đ|i dắt, kêu Nhảy lên kh|c không để khác nhảy lên Âm hộ sưng huyết đỏ, sưng, chảy dịch trắng - Sau chịu đực: Đi tìm đực, thích đứng gần khác Để khác nhảy lên lưng Âm hộ bớt sưng, thâm se lại Các loại động dục: - Tg dài, cường độ mạnh - Tg dài, cường độ yếu Tg ngắn, cường độ mạnh Tg ngắn, cường độ yếu 2) THAO TÁC DẪN TINH: Để tỷ lệ thụ thai cao: - Thể trạng tính dục tốt - Chất lượng tinh trùng cao - Tay nghề cao - Thời điểm phù hợp (quy luật sáng chiều) Thời điểm dẫn tinh sau động dục: - 0-6h: sớm - 6-12h: tốt - 12-18h: tốt - 18-24h: tốt - Sau 24h: muộn - - Trc động dục đứng yên 8h Động dục đứng yên 16h Sau động dục đứng yên 8h Căn vào thời điểm rụng trứng (12h sau rụng trứng ): tối động dục  s|ng bơm tinh, s|ng động dục  chiều muộn bơm tinh Căn vào thời điểm động dục đứng yên: khoảng 8, 12 ,18h sau thấy bò động dục, đ}y l{ thời điểm bơm tinh tốt Thao tác dẫn tinh: - Các khâu chuẩn bị: Cố định chắn vật giá dẫn tinh Chuẩn bị dụng cụ thuận lợi, đảm bảo an toàn tránh as mặt trời Chuẩn bị dẫn tinh quản súng bắn tinh - PP dẫn tinh: Kỹ thuật trực tràng-}m đạo: dụng cụ thụ tinh đc đưa v{o phía }m đạo v{ đc hướng qua cổ tử cung nhờ v{o b{n tay đeo găng trực tràng Đ}y l{ pp có hiệu đk thực tế sx C|c bước: Chuẩn bị dụng cụ dẫn tinh Đeo găng tay có chất bôi trơn Đưa b{n tay deo găng tay bạn vào trực tràng, xđ vị trí cổ tử cung Ktra xem bò có phải KHÔNG có chửa không Nhẹ nhàng thả cổ tử cung tử cung, lau vết ph}n v{ nước từ âm hộ khăn giấy vải mềm Đầu súng đẫn tinh phải đc đưa v{o với góc nghiêng 30 độ dọc theo đỉnh âm hộ để tr|nh đưa nhầm vào lỗ niệu đạo v{ bóng đ|i, lỗ nằm phía đ|y }m đạo Nhẹ nh{ng đưa súng dẫn tinh phía trc đến chạm vào vật cứng, dấu hiệu đ~ tới cổ tử cung Nhẹ nh{ng đưa súng vào, dẫn đầu súng qua cổ tử cung vào tử cung, đầu súng bị lỗi đ}m thủng thành mỏng tử cung Súng dẫn tinh không đc đưa qu| xa phía trx mà vừa qua cổ tử cung (khoảng 1cm) 10 Với phối giống lại, vị trí súng phải cổ tử cung an toàn  sâu nguy hiểm >3% bò chửa động dục lại 3-6 tuần 11 Bơm từ từ 1/2 2/3 lượng tinh dịch thân tử cung, phần tinh dịch lại bơm cổ tử cung (đối với bò phối lại bơm cố tử cung) 12 Rút súng khỏi đường sinh dục massage tử cung + cổ tử cung v{i gi}y để kích thích tiết Oxytocin 13 Nới lỏng vòng khóa súng (tr|nh trượt vào vỏ súng bẩn), rút vỏ súng khỏi nòng, cọng láy vỏ súng Ko vứt bỏ vỏ súng cọng đến ghi chép sổ sách hoàn tất  đốt vỏ sung + cọng tránh bệnh tật 14 Thả bò khỏi giá đg r{o ngăn 15 Tiến hành bp vệ sinh c| nh}n rửa nước sát trùng, làm ủng,…; th|o súng, lau súng, vệ sinh cồn… CÂU CÔNG NGHỆ/KỸ THUẬT CẤY TRUYỀN PHÔI? 1) KHÁI NIỆM, Ý NGHĨA Cấy truyền phôi (embryo transfer) trình đưa phôi đc tạo từ thể bò mẹ (bò cho phôi) vào thể bò mẹ khác (bò nhận phôi), phôi sống phát triển tốt, tạo thành thể đc sinh bình thường Ý nghĩa: - Nhân nhanh giống tốt,những đặc tính quý thực tế sx sở khai thác triệt để tiềm di truyền cá thể cao sản thông qua việc lấy - bảo quản phôi cấy truyền phôi chúng - Tận dụng đồng thời đặc tính tốt bố mẹ cao sản cao sản gây rụng trứng nhiều lại đc phối giống với tinh dịch đực giống tốt - N}ng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống sở tăng nhanh tiến di truyền năm - Có thể khai thác phôi gia súc non, phân biệt giới tính phôi trc cấy - Nâng cao khả sinh sản, tạo nhiều sp thịt sữa - Giảm chi phí - Dễ dàng thuận lợi việc xuất khẩu, vận chuyển, trao đổi giống - Bảo tồn, giữ gìn giống dạng trứng phôi, tinh trùng (ex-situ) - Hạn chế số dịch bệnh nâng cao khả chống chịu bệnh, khả thích nghi cho vật mt 2) CƠ SỞ KHOA HỌC: Phôi coi l{ thể độc lập giai đoạn đầu trình pt Nếu đc chuyển v{o thể khác có trạng thái sinh lý sinh dục phù hợp với trạng thái thể cho phôi (hoặc phù hợp với tuổi phôi) sống pt bình thường Sự phù hợp gọi đồng pha 3) QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ: ❶ Bò cho phôi: - - - Nguồn gốc: Lý lịch rõ ràng (phả hệ) Đặc điểm di truyền (có bệnh hay ko ý mà ) Năng suất, phẩm chất: Những c|i có suất cao ưu tiên tính chọn lọc liên quan đến tính trạng sinh sản, hệ số di truyền cao, cải tạo, có sức sống tốt, khả thích ứng cao với điều kiện môi trường sinh thái, điều kiện sống thay đổi Khả sinh sản: Là tiêu quan trọng chọn bò cho phôi Đ|nh gi| vào tiêu: Tuổi thành thục giới tính Chu kì tính, khoảng cách lứa đẻ Thời gian động dục lại sau đẻ Trước sử dụng khai thác phôi, bò cho phôi phải theo dõi chặt chẽ chu kì động dục với thời gian chu kì 21 ngày ❷ Bò nhận phôi: - Sức khỏe tốt - Sinh trưởng, phát triển bình thường - Sinh lý sinh sản bình thường: bò nhận phôi phải theo dõi chu kì động dục bình thường Đ}y l{ yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ đầu thai, chí ảnh hưởng đến thành bại cấy truyền phôi ❸ Gây động dục đồng pha: Trc t|c động, bò cho phôi bò nhận phôi có trạng thái sinh lý sinh dục khác Mục đích việc tạo chu kỳ l{ kích thích cho c|c bò n{y động dục đồng thời (gọi l{ động dục đồng pha) Chiến lược hormon: g}y động dục đồng pha cách sd số loại hormon như: Prostaglandine nhóm F2α (PGF2α); FSH , PMSG; progesterone… chế phẩm sinh học có hoạt tính tương đương để kthich ❹ Gây siêu noãn: siêu noãn hay gây rụng trứng nhiều bò cho phôi l{ kích thích để lần động dục có nhiều trứng chín rụng Mục đích l{ nhằm có nhiều trứng rụng, thụ tinh tạo nhiều hợp tử, kết thu đc nhiều phôi Để gây siêu noãn thường dúng c|c hormone FSH, PMSG, HMG, pergonal… ❺ Phối giống bò cho phôi: phối giống bò cho phôi với đực giống tốt để đảm bảo thu đc nhiều phôi chất lượng tốt ❻ Thu hoạch phôi: - Môi trường: cần có dd giội rửa lấy phôi v{ nuôi phôi ngo{i thể mẹ Hiện ngta sd PBS (tp` PBS: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, pH= 7,4) Dụng cụ lấy phôi: khác tùy mục đích, pp vị trí giội rửa - PP lấy phôi: Ở bò không phẫu thuật mà dùng dụng cụ FOLEY CATHETER Đưa dụng cụ lấy phôi foley catheter qua }m đạo, cổ tử cung vào thân, sừng tử cung, cố định foley catheter vị trí định bóng khí Sau dd đc đưa v{o lấy theo hệ thống ống khép kín trực tiếp xilanh thông qua foley catheter Trứng v{ phôi đc đưa ngo{i trình rửa PP thu phôi ko qua không phẫu thuật đc tiến hành từ ngày t6-t9 (tôt vào ngày thứ 7, 8) sau thụ tinh Sau giội rửa, để lắng dd 20-30p, sau soi để tìm phôi kính hiển vi soi có độ phóng đại ≥ 24 lần ❼ Phân loại phôi: - Hình thái chung phôi: - Kích thước phôi: kích thước bình thường 100-200 µm Hình dáng phôi: hình dẹt, phôi dâu, phôi nang Mức độ phân chia tế bào: độ tập trung, phân tán mối lk TB phôi (số lượng TB tách rời mối lk lỏng lẻo) Phôi tốt l{ phôi có kích thước đảm bảo, có dạng hình cầu nguyên vẹn Các tế b{o phôi đều, lk chặt chẽ, có độ s|ng phần  Sau đó: + Cấy cho bò động dục đồng pha (cấy phôi tươi) + Đem đông lạnh để dự trữ, cần sd (cấy phôi đông lạnh) + Đóng v{o cọng rạ trc đem nuôi cấy đông lạnh để dự trữ ❽ Cấy phôi: - Phôi đc lấy từ vị trí (bò cho phôi) cấy lại vào vị trí (bò nhận phôi) Phôi đc đưa v{o sừng tử cung bên buồng trứng vàng (nếu cấy phôi cho bò nhận) Vị tri cấy thường 1/3 phía sừng tử cung Để tăng tỉ lệ bò đẻ sinh đôi, bò nhận cấy phôi cấy phôi kết hợp vào bò đ~ đc phối giống Sau cấy phôi tháng khám để đ|nh gi| kết Ngoài chất lượng phôi kỹ thuật cấy, tỷ lệ thụ thai phụ thuộc v{ đk mt chế độ chăm sóc, nuôi dưỡng, thời tiết khả tiếp nhận phôi cá thể bò - 10