Nghiên cứu quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh phục vụ công tác nhân giống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - BÙI VĂN THẾ VINH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP TP Hồ Chí Minh - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - BÙI VĂN THẾ VINH NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG Chuyên ngành: Di truyền chọn giống trồng Mã số: 62.62.01.11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Dƣơng Tấn Nhựt TS Đỗ Khắc Thịnh TP Hồ Chí Minh - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu dƣới bảo thầy hƣớng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu thuộc Phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo giống trồng – Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Các số liệu kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Văn Thế Vinh ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận án này, nhận đƣợc hƣớng dẫn, quan tâm tận tình giúp đỡ nhiều thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp ngƣời thân Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Dƣơng Tấn Nhựt TS Đỗ Khắc Thịnh trực tiếp hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận án Quý thầy cô, anh chị công tác Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam tận tình hƣớng dẫn, truyền dạy cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nhƣ đóng góp cho ý kiến bổ ích để có định hƣớng cụ thể trình thực nghiên cứu sinh hoạt chuyên môn sở đào tạo Các anh chị, bạn Phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống Cây trồng – Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới; thầy cô, đồng nghiệp Trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện cho thực luận án Các anh chị nghiên cứu sinh: Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Văn Lợt, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Phúc Huy, Trần Trọng Tuấn; bạn: Thái Thƣơng Hiền, Vũ Thị Thủy, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Xuân Chiến, Trịnh Thị Hƣơng, Lê Kim Cƣơng, Hồ Thanh Tâm, Đỗ Mạnh Cƣờng, Nguyễn Việt Cƣờng, Hoàng Văn Cƣơng, Trần Xuân Tình, học tập, nghiên cứu, chia sẻ động viên suốt thời gian học tập, nghiên cứu, thực luận án Cuối cùng, xin gởi lòng biết ơn chân thành đến ngƣời thân yêu gia đình, đồng nghiệp bạn bè gần xa quan tâm giúp đỡ, động viên tinh thần cho suốt năm vừa qua TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng năm 2015 Bùi Văn Thế Vinh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC BIỂU ĐỒ xii DANH MỤC HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu, yêu cầu đề tài Những đóng góp luận án .3 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC .6 1.1 Giới thiệu chi sâm 1.2 Giới thiệu sâm Ngọc Linh 1.2.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.3 Phân bố 10 1.2.4 Tác dụng dược lý sâm Ngọc Linh 11 1.2.4.1 Kết nghiên cứu dƣợc lý thực nghiệm sâm Ngọc Linh 11 1.2.4.2 Kết nghiên cứu dƣợc lý lâm sàng sâm Ngọc Linh 14 1.2.5 Tình hình nghiên cứu sâm Ngọc Linh 15 1.2.5.1 Nghiên cứu phát sinh loài sâm Ngọc Linh 15 1.2.5.2 Nghiên cứu nhân giống từ hạt 16 1.2.5.3 Nghiên cứu tạo rễ bất định 17 1.2.5.4 Nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro 19 1.2.5.5 Nghiên cứu tạo củ in vitro 20 iv 1.2.5.6 Nghiên cứu phát sinh hình thái 20 1.2.5.7 Nghiên cứu hàm lƣợng saponin dƣ lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật mẫu nuôi cấy in vitro 21 1.3 Giới thiệu phôi vô tính 21 1.3.1 Quá trình phát sinh phôi thực vật 22 1.3.2 Khả phát sinh phôi vô tính tế bào sinh dưỡng 24 1.3.3 Sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính 28 1.3.4 Trạng thái tế bào phát sinh phôi vô tính 29 1.3.5 Sự phát sinh phôi vô tính 31 1.3.6 Ứng dụng trình tạo phôi vô tính 32 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình phát sinh phôi vô tính 35 1.4.1 Chất điều hòa sinh trưởng 35 1.4.2 Nguồn nitơ 37 1.4.3 Đường 38 1.4.4 pH 38 1.4.5 Ánh sáng 39 1.4.6 Polyamine 39 1.5 Các kỹ thuật thị DNA 43 1.6 Kỹ thuật đa hình DNA nhân ngẫu nhiên (RAPD) 46 1.6.1 Nguyên lý RAPD 47 1.6.2 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD 47 1.6.3 Ưu, nhược điểm kỹ thuật RAPD 48 1.6.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD 49 CHƢƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài nghiên cứu 50 2.2 Vật liệu nghiên cứu 50 2.2.1 Vật liệu 50 2.2.2 Hóa chất 51 2.2.3 Thiết bị 51 2.2.4 Môi trường nuôi cấy 51 v 2.2.5 Điều kiện nuôi cấy 52 2.3 Nội dung nghiên cứu phương pháp bố trí thí nghiệm 52 2.3.1 Cảm ứng tạo mô sẹo có tiềm phát sinh phôi 52 2.3.1.1 Đánh giá ảnh hƣởng nguồn vật liệu mẫu cấy lên khả cảm ứng tạo mô sẹo có tiềm phát sinh phôi sâm Ngọc Linh 52 2.3.1.2 Đánh giá ảnh hƣởng môi trƣờng khoáng lên khả tạo mô sẹo có tiềm phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 54 2.3.2 Cảm ứng tạo phôi vô tính từ mô sẹo có tiềm phát sinh phôi 55 2.3.2.1 Đánh giá ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng thực vật lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 55 2.3.2.2 Đánh giá ảnh hƣởng nguồn carbohydrate lên khả cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 56 2.3.3 Gia tăng tỉ lệ phát sinh phôi số lượng phôi vô tính sâm Ngọc Linh 57 2.3.3.1 Đánh giá ảnh hƣởng số acid amine lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 57 2.3.3.2 Đánh giá ảnh hƣởng số polyamine lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh 58 2.3.3.3 Đánh giá ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng nuôi cấy lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 59 2.3.3.4 Đánh giá ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 60 2.3.4 Đánh giá sơ mức độ đồng di truyền sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phôi vô tính 60 2.3.4.1 Tách chiết DNA 60 2.3.4.2 Phân tích thị RAPD 61 2.3.5 Đánh giá khả sống sót, sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 62 2.3.5.1 Đánh giá ảnh hƣởng giá thể lên khả sống sót, sinh trƣởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro điều kiện nhân tạo 62 2.3.5.2 Đánh giá ảnh hƣởng giá thể lên khả sống sót, sinh trƣởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro điều kiện sinh thái tự nhiên 63 vi 2.4 Nghiên cứu hình thái giải phẫu cấu trúc phôi 63 2.4.1 Quan sát hình thái giải phẫu kính hiển vi huỳnh quang 63 2.4.2 Quan sát cấu trúc phôi kính hiển vi điện tử quét 64 2.5 Phân tích xử lý số liệu 64 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Ảnh hưởng nguồn vật liệu mẫu cấy lên khả tạo mô sẹo có tiềm phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 66 3.2 Ảnh hưởng môi trường khoáng lên khả tạo mô sẹo có tiềm phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 68 3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 71 3.4 Ảnh hưởng nguồn carbohydrate lên khả cảm ứng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 77 3.4.1 Ảnh hưởng đường sucrose lên phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 77 3.4.2 Ảnh hưởng đường glucose lên phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 81 3.4.3 Ảnh hưởng đường fructose lên phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 83 3.4.4 So sánh hiệu loại đường 85 3.5 Ảnh hưởng số acid amine lên phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 87 3.5.1 Ảnh hưởng arginine lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 87 3.5.2 Ảnh hưởng ornithine lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 89 3.6 Ảnh hưởng số polyamine lên phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 91 3.6.1 Ảnh hưởng putrescine lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 91 3.6.2 Ảnh hưởng spermidine lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 95 vii 3.6.3 Ảnh hưởng spermine lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 97 3.6.4 Kết phân tích hàm lượng PA nội sinh 100 3.7 Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 104 3.8 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh 106 3.9 Sự thay đổi hình thái cấu trúc trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh 109 3.10 Đánh giá sơ mức độ đồng di truyền sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ phôi vô tính 114 3.11 Ảnh hưởng số giá thể lên sống sót, sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 121 3.11.1.Tỉ lệ sống sót, sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh in vitro điều kiện nhân tạo 121 3.11.2.Tỉ lệ sống sót, sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh in vitro điều kiện sinh thái tự nhiên 127 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .133 Kết luận 133 Đề nghị .134 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 135 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .136 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABA Abscisic acid ADC Arginine decarboxylase AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Arg Arginine ATP Adenosine triphosphate BA Benzyladenine Cad Cadaverine cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid EC Embryogenic callus GA Gibberellic acid HPLC High-performance liquid chromatography IAA Indole acetic acid IBA Indole butyric acid LED Light emitting diode LHC Light-harvesting complex MS Murashige and Skoog (1962) NAA Naphthalene acetic acid NO Nitric oxide ODC Ornithine decarboxylase Orn Ornithine PA Polyamine PCR Polymerase chain reaction PEM Proembryogenic mass Put Putrescine RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA RNA Ribonucleic acid SAM S-adenosyl-methionine NT4 - NT6 * -5 2.46235 NT4 - NT7 -0.66667 2.46235 NT4 - NT8 0.666667 2.46235 NT6 - NT7 * 4.333333 2.46235 NT6 - NT8 * 5.666667 2.46235 NT7 - NT8 * 1.333333 2.46235 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.4 Ảnh hƣởng 2,4-D kết hợp với NAA kinetin lên khả phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Moi truong Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 487.703 162.568 Within groups 1266.12 116 10.9148 Total (Corr.) 1753.82 119 F-Ratio 14.89 P-Value 0.0000 F-Ratio 496.44 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count Mean NT10 30 20.4633 NT12 30 21.4833 NT9 30 21.7467 NT11 30 25.7533 Homogeneous Groups X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits NT10 - NT11 * -5.29 1.68953 NT10 - NT12 -1.02 1.68953 NT10 - NT9 -1.28333 1.68953 NT11 - NT12 * 4.27 1.68953 NT11 - NT9 * 4.00667 1.68953 NT12 - NT9 -0.263333 1.68953 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Moi truong Source Sum of Squares Df Between groups 114025 Within groups 8881.2 116 Total (Corr.) 122906 119 Mean Square 38008.4 76.5621 Multiple Range Tests for So phoi by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count Mean NT9 30 11.7444 NT10 30 22.7 NT12 30 32.0555 NT11 30 39.1223 Contrast Sig Difference Homogeneous Groups X X X X +/- Limits NT10 - NT11 * -16.4222 4.47471 NT10 - NT12 * -9.3555 4.47471 NT10 - NT9 * 10.9555 4.47471 NT11 - NT12 * 7.0666 4.47471 NT11 - NT9 * 27.3777 4.47471 NT12 - NT9 * 20.3111 4.47471 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.5 Ảnh hƣởng đƣờng sucrose lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong phoi by Sucrose Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 15682.4 3136.49 Within groups 3944.13 174 22.6674 Total (Corr.) 19626.6 179 F-Ratio 138.37 P-Value 0.0000 F-Ratio 276.50 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong phoi by Sucrose Method: 95.0 percent LSD Sucrose Count Mean 10 30 24.65 20 30 26.3567 30 30 35.3533 40 30 36.4933 50 30 45.1533 60 30 50.7567 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits 10 - 20 -1.70667 2.42625 10 - 30 * -10.7033 2.42625 10 - 40 * -11.8433 2.42625 10 - 50 * -20.5033 2.42625 10 - 60 * -26.1067 2.42625 20 - 30 * -8.99667 2.42625 20 - 40 * -10.1367 2.42625 20 - 50 * -18.7967 2.42625 20 - 60 * -24.4 2.42625 30 - 40 -1.14 2.42625 30 - 50 * -9.8 2.42625 30 - 60 * -15.4033 2.42625 40 - 50 * -8.66 2.42625 40 - 60 * -14.2633 2.42625 50 - 60 * -5.60333 2.42625 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Sucrose Source Sum of Squares Df Between groups 616903 Within groups 77641.8 174 Total (Corr.) 694544 179 Mean Square 123381 446.217 Multiple Range Tests for So phoi by Sucrose Method: 95.0 percent LSD Sucrose Count Mean Homogeneous Groups 10 30 2.7555 X 20 30 8.4222 X X 60 30 32.2223 X 30 30 40.3 X 40 30 47.7333 X 50 30 55.689 Contrast Sig Difference +/- Limits 10 - 20 * -5.6667 3.5882 10 - 30 * -37.5443 3.5882 10 - 40 * -44.9777 3.5882 10 - 50 * -52.9333 3.5882 10 - 60 * -29.4667 3.5882 20 - 30 * -31.8778 3.5882 20 - 40 * -39.311 3.5882 20 - 50 * -47.2667 3.5882 20 - 60 * -23.8 3.5882 30 - 40 * -7.4333 3.5882 30 - 50 * -15.3889 3.5882 30 - 60 * 8.0777 3.5882 40 - 50 * -7.9555 3.5882 40 - 60 * 15.5111 3.5882 50 - 60 * 23.4666 3.5882 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.6 Ảnh hƣởng đƣờng glucose lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Glucose Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 1411.23 282.245 Within groups 1606.82 174 9.23457 Total (Corr.) 3018.04 179 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Glucose Method: 95.0 percent LSD Glucose Count Mean 10 30 12.5467 20 30 13.1467 30 30 14.8633 40 30 15.0467 50 30 17.8567 60 30 20.68 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast 10 - 20 10 - 30 10 - 40 +/- Limits 1.54861 1.54861 1.54861 Sig * * Difference -0.6 -2.31667 -2.5 F-Ratio 30.56 P-Value 0.0000 10 - 50 * -5.31 1.54861 10 - 60 * -8.13333 1.54861 20 - 30 * -1.71667 1.54861 20 - 40 * -1.9 1.54861 20 - 50 * -4.71 1.54861 20 - 60 * -7.53333 1.54861 30 - 40 -0.183333 1.54861 30 - 50 * -2.99333 1.54861 30 - 60 * -5.81667 1.54861 40 - 50 * -2.81 1.54861 40 - 60 * -5.63333 1.54861 50 - 60 * -2.82333 1.54861 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Glucose Source Sum of Squares Df Between groups 131014 Within groups 58353.2 174 Total (Corr.) 189367 179 Mean Square 26202.8 335.363 Multiple Range Tests for So phoi by Glucose Method: 95.0 percent LSD Glucose Count Mean 10 30 0.8222 20 30 3.8777 30 30 8.9111 40 30 17.9333 60 30 21.2222 50 30 25.0444 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits 10 - 20 -3.0555 3.1107 10 - 30 * -8.0889 3.1107 10 - 40 * -17.1111 3.1107 10 - 50 * -24.2222 3.1107 10 - 60 * -20.4 3.1107 20 - 30 * -5.0333 3.1107 20 - 40 * -14.0556 3.1107 20 - 50 * -21.1667 3.1107 20 - 60 * -17.3444 3.1107 30 - 40 * -9.0222 3.1107 30 - 50 * -16.1333 3.1107 30 - 60 * -12.3111 3.1107 40 - 50 * -7.1111 3.1107 40 - 60 * -3.2888 3.1107 50 - 60 * 3.8222 3.1107 * denotes a statistically significant difference F-Ratio 78.13 P-Value 0.0000 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng đƣờng fructose lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Fructose Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 543.037 108.607 Within groups 1057.37 174 6.07681 Total (Corr.) 1600.4 179 F-Ratio 17.87 P-Value 0.0000 F-Ratio 31.92 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Fructose Method: 95.0 percent LSD Fructose Count Mean 10 30 5.76333 30 30 6.12333 20 30 7.73667 40 30 8.25667 50 30 9.74 60 30 10.5333 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits 10 - 20 * -1.97333 1.25624 10 - 30 -0.36 1.25624 10 - 40 * -2.49333 1.25624 10 - 50 * -3.97667 1.25624 10 - 60 * -4.77 1.25624 20 - 30 * 1.61333 1.25624 20 - 40 -0.52 1.25624 20 - 50 * -2.00333 1.25624 20 - 60 * -2.79667 1.25624 30 - 40 * -2.13333 1.25624 30 - 50 * -3.61667 1.25624 30 - 60 * -4.41 1.25624 40 - 50 * -1.48333 1.25624 40 - 60 * -2.27667 1.25624 50 - 60 -0.793333 1.25624 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Fructose Source Sum of Squares Df Between groups 24102.6 Within groups 26280.2 174 Total (Corr.) 50382.7 179 Mean Square 4820.51 151.035 Multiple Range Tests for So phoi by Fructose Method: 95.0 percent LSD Fructose Count Mean 10 30 0.0222 20 30 2.4222 30 30 4.7666 Homogeneous Groups X X X 40 60 50 30 30 30 5.8 8.8889 11.8222 X X X Contrast Sig Difference +/- Limits 10 - 20 * -2.2 2.0876 10 - 30 * -4.5444 2.0876 10 - 40 * -5.5777 2.0876 10 - 50 * -11.6 2.0876 10 - 60 * -8.6666 2.0876 20 - 30 * -2.3444 2.0876 20 - 40 * -3.3777 2.0876 20 - 50 * -9.4 2.0876 20 - 60 * -6.4666 2.0876 30 - 40 -1.0333 2.0876 30 - 50 * -7.0555 2.0876 30 - 60 * -4.1222 2.0876 40 - 50 * -6.0222 2.0876 40 - 60 * -3.0888 2.0876 50 - 60 * 2.93333 2.0876 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.8 Ảnh hƣởng Arg lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Arg Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 10336.6 2067.31 Within groups 3991.66 174 22.9406 Total (Corr.) 14328.2 179 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Arg Method: 95.0 percent LSD Arg Count Mean 30 53.4633 10 30 58.4567 50 30 62.63 100 30 68.0033 200 30 68.83 150 30 76.8267 Contrast - 10 - 50 - 100 - 150 - 200 10 - 50 10 - 100 10 - 150 10 - 200 50 - 100 50 - 150 50 - 200 100 - 150 Sig * * * * * * * * * * * * * Homogeneous Groups X X X X X X Difference -4.99333 -9.16667 -14.54 -23.3633 -15.3667 -4.17333 -9.54667 -18.37 -10.3733 -5.37333 -14.1967 -6.2 -8.82333 +/- Limits 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 2.44082 F-Ratio 90.12 P-Value 0.0000 100 - 200 -0.826667 2.44082 150 - 200 * 7.99667 2.44082 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Arg Source Sum of Squares Between groups 7411.11 Within groups 6616.0 Total (Corr.) 14027.1 Df 174 179 Mean Square 1482.22 38.023 F-Ratio 38.98 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for So phoi by Arg Method: 95.0 percent LSD Arg Count Mean 10 30 4.0 50 30 6.0 100 30 8.0 200 30 13.6667 30 16.6667 150 30 22.3333 Homogeneous Groups X XX X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 * 12.6667 3.14237 - 50 * 10.6667 3.14237 - 100 * 8.66667 3.14237 - 150 * -5.66667 3.14237 - 200 3.0 3.14237 10 - 50 -2.0 3.14237 10 - 100 * -4.0 3.14237 10 - 150 * -18.3333 3.14237 10 - 200 * -9.66667 3.14237 50 - 100 -2.0 3.14237 50 - 150 * -16.3333 3.14237 50 - 200 * -7.66667 3.14237 100 - 150 * -14.3333 3.14237 100 - 200 * -5.66667 3.14237 150 - 200 * 8.66667 3.14237 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.9 Ảnh hƣởng Orn lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Orn Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 6132.88 1226.58 Within groups 4085.68 174 23.4809 Total (Corr.) 10218.6 179 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Orn Method: 95.0 percent LSD Orn Count Mean 30 54.3033 Homogeneous Groups X F-Ratio 52.24 P-Value 0.0000 10 50 100 200 150 30 30 30 30 30 57.1033 59.3 62.6967 65.4 72.1033 X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 * -2.8 2.4694 - 50 * -4.99667 2.4694 - 100 * -8.39333 2.4694 - 150 * -17.8 2.4694 - 200 * -11.0967 2.4694 10 - 50 -2.19667 2.4694 10 - 100 * -5.59333 2.4694 10 - 150 * -15.0 2.4694 10 - 200 * -8.29667 2.4694 50 - 100 * -3.39667 2.4694 50 - 150 * -12.8033 2.4694 50 - 200 * -6.1 2.4694 100 - 150 * -9.40667 2.4694 100 - 200 * -2.70333 2.4694 150 - 200 * 6.70333 2.4694 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Orn Source Sum of Squares Between groups 3282.78 Within groups 2020.0 Total (Corr.) 5302.78 Df 174 179 Mean Square 656.556 11.6092 Multiple Range Tests for So phoi by Orn Method: 95.0 percent LSD Orn Count Mean 10 30 3.33333 50 30 5.66667 200 30 5.66667 100 30 7.66667 150 30 12.3333 30 15.6667 Contrast - 10 - 50 - 100 - 150 - 200 10 - 50 10 - 100 10 - 150 10 - 200 50 - 100 50 - 150 50 - 200 100 - 150 100 - 200 Sig * * * * * * * * * * * * * Homogeneous Groups X X X X X X Difference 12.3333 10.0 8.0 3.33333 10.0 -2.33333 -4.33333 -9.0 -2.33333 -2.0 -6.66667 0.0 -4.66667 2.0 +/- Limits 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 1.73634 F-Ratio 56.55 P-Value 0.0000 150 - 200 * 6.66667 1.73634 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.10 Ảnh hƣởng Put lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Put Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 27277.1 5455.43 Within groups 4748.39 174 27.2896 Total (Corr.) 32025.5 179 F-Ratio 199.91 P-Value 0.0000 F-Ratio 24.35 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Put Method: 95.0 percent LSD Put Count Mean 30 54.2567 200 30 64.5033 10 30 66.26 50 30 74.8267 150 30 86.4567 100 30 89.0333 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 * -12.0033 2.66215 - 50 * -20.57 2.66215 - 100 * -34.7767 2.66215 - 150 * -32.2 2.66215 - 200 * -10.2467 2.66215 10 - 50 * -8.56667 2.66215 10 - 100 * -22.7733 2.66215 10 - 150 * -20.1967 2.66215 10 - 200 1.75667 2.66215 50 - 100 * -14.2067 2.66215 50 - 150 * -11.63 2.66215 50 - 200 * 10.3233 2.66215 100 - 150 2.57667 2.66215 100 - 200 * 24.53 2.66215 150 - 200 * 21.9533 2.66215 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Put Source Sum of Squares Between groups 41524.4 Within groups 59343.3 Total (Corr.) 100868 Df 174 179 Mean Square 8304.89 341.054 Multiple Range Tests for So phoi by Put Method: 95.0 percent LSD Put Count Mean 30 20.6667 200 30 23.6667 Homogeneous Groups X X 10 150 50 100 30 30 30 30 26.3333 42.0 44.3333 64.3333 X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 -5.66667 9.41122 - 50 * -23.6667 9.41122 - 100 * -43.6667 9.41122 - 150 * -21.3333 9.41122 - 200 -3.0 9.41122 10 - 50 * -18.0 9.41122 10 - 100 * -38.0 9.41122 10 - 150 * -15.6667 9.41122 10 - 200 2.66667 9.41122 50 - 100 * -20.0 9.41122 50 - 150 2.33333 9.41122 50 - 200 * 20.6667 9.41122 100 - 150 * 22.3333 9.41122 100 - 200 * 40.6667 9.41122 150 - 200 * 18.3333 9.41122 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.11 Ảnh hƣởng Spd lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Spd Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 37909.1 7581.82 Within groups 5485.23 174 31.5243 Total (Corr.) 43394.3 179 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Spd Method: 95.0 percent LSD Spd Count Mean 30 55.3333 10 30 58.3267 50 30 66.5633 100 30 75.9033 200 30 76.0633 150 30 99.16 Contrast - 10 - 50 - 100 - 150 - 200 10 - 50 10 - 100 10 - 150 10 - 200 50 - 100 50 - 150 50 - 200 Sig * * * * * * * * * * * * Homogeneous Groups X X X X X X Difference -2.99333 -11.23 -20.57 -43.8267 -20.73 -8.23667 -17.5767 -40.8333 -17.7367 -9.34 -32.5967 -9.5 +/- Limits 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 2.86126 F-Ratio 240.51 P-Value 0.0000 100 - 150 * -23.2567 2.86126 100 - 200 -0.16 2.86126 150 - 200 * 23.0967 2.86126 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Spd Source Sum of Squares Between groups 58377.8 Within groups 35852.7 Total (Corr.) 94230.4 Df 174 179 Mean Square 11675.6 206.05 F-Ratio 56.66 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for So phoi by Spd Method: 95.0 percent LSD Spd Count Mean 30 15.6667 200 30 21.0 10 30 22.6667 50 30 25.3333 100 30 35.0 150 30 69.6667 Homogeneous Groups X XX XX X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 -7.0 7.31511 - 50 * -9.66667 7.31511 - 100 * -19.3333 7.31511 - 150 * -54.0 7.31511 - 200 -5.33333 7.31511 10 - 50 -2.66667 7.31511 10 - 100 * -12.3333 7.31511 10 - 150 * -47.0 7.31511 10 - 200 1.66667 7.31511 50 - 100 * -9.66667 7.31511 50 - 150 * -44.3333 7.31511 50 - 200 4.33333 7.31511 100 - 150 * -34.6667 7.31511 100 - 200 * 14.0 7.31511 150 - 200 * 48.6667 7.31511 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.12 Ảnh hƣởng Spm lên tỉ lệ phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Spm Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 28792.8 5758.57 Within groups 6412.03 174 36.8507 Total (Corr.) 35204.9 179 F-Ratio 156.27 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Spm Method: 95.0 percent LSD Spm Count Mean 30 51.2967 10 30 64.2333 50 30 79.8333 200 30 80.7333 100 30 82.03 150 30 88.3567 Homogeneous Groups X X X X X X Contrast Sig Difference +/- Limits - 10 * -12.9367 3.09355 - 50 * -28.5367 3.09355 - 100 * -30.7333 3.09355 - 150 * -37.06 3.09355 - 200 * -29.4367 3.09355 10 - 50 * -15.6 3.09355 10 - 100 * -17.7967 3.09355 10 - 150 * -24.1233 3.09355 10 - 200 * -16.5 3.09355 50 - 100 -2.19667 3.09355 50 - 150 * -8.52333 3.09355 50 - 200 -0.9 3.09355 100 - 150 * -6.32667 3.09355 100 - 200 1.29667 3.09355 150 - 200 * 7.62333 3.09355 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Spm Source Sum of Squares Between groups 36658.3 Within groups 23892.7 Total (Corr.) 60551.0 Df 174 179 Mean Square 7331.67 137.314 Multiple Range Tests for So phoi by Spm Method: 95.0 percent LSD Spm Count Mean 30 14.0 10 30 16.6667 50 30 23.6667 100 30 36.3333 200 30 39.3333 150 30 55.0 Contrast - 10 - 50 - 100 - 150 - 200 10 - 50 10 - 100 10 - 150 10 - 200 Sig * * * * * * * * Homogeneous Groups X X X X X X Difference -2.66667 -9.66667 -22.3333 -41.0 -25.3333 -7.0 -19.6667 -38.3333 -22.6667 +/- Limits 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 5.97162 F-Ratio 53.39 P-Value 0.0000 50 - 100 * -12.6667 5.97162 50 - 150 * -31.3333 5.97162 50 - 200 * -15.6667 5.97162 100 - 150 * -18.6667 5.97162 100 - 200 -3.0 5.97162 150 - 200 * 15.6667 5.97162 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.13 Ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng nuôi cấy lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Trang thai moi truong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 34086.8 17043.4 718.73 Within groups 2063.04 87 23.7131 Total (Corr.) 36149.8 89 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Trang thai moi truong Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Long tinh 30 25.5 Dac 30 55.4333 Long lac 30 72.5967 Homogeneous Groups X X X Contrast Sig Difference Dac - Long lac * -17.1633 Dac - Long tinh * 29.9333 Long lac - Long tinh * 47.0967 * denotes a statistically significant difference +/- Limits 2.49908 2.49908 2.49908  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Trang thai moi truong Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 20276.8 20276.8 Within groups 20339.4 58 350.679 Total (Corr.) 40616.2 59 Multiple Range Tests for So phoi by Trang thai moi truong Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Dac 30 18.3333 Long lac 30 55.1 Homogeneous Groups X X Contrast Sig Difference +/- Limits Dac - Long lac * -36.7667 9.6786 * denotes a statistically significant difference F-Ratio 57.82 P-Value 0.0000 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng lên hình thành phôi vô tính từ mô sẹo xốp sâm Ngọc Linh  Chỉ tiêu Khối lƣợng tƣơi: ANOVA Table for Trong luong tuoi by Dieu kien chieu sang Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 685.464 685.464 30.62 Within groups 1298.2 58 22.3828 Total (Corr.) 1983.67 59 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Trong luong tuoi by Dieu kien chieu sang Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Toi 30 48.6967 Sang 30 55.4567 Homogeneous Groups X X Contrast Sig Difference +/- Limits Sang - Toi * 6.76 2.44521 * denotes a statistically significant difference  Chỉ tiêu Số phôi/mẫu: ANOVA Table for So phoi by Dieu kien chieu sang Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 3526.67 3526.67 Within groups 874.667 58 15.0805 Total (Corr.) 4401.33 59 F-Ratio 233.86 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for So phoi by Dieu kien chieu sang Method: 95.0 percent LSD Level Count Mean Toi 30 2.0 Sang 30 17.3333 Homogeneous Groups X X Contrast Sig Difference +/- Limits Sang - Toi * 15.3333 2.00708 * denotes a statistically significant difference Bảng 3.18 Ảnh hƣởng giá thể lên sống sót, sinh trƣởng phát triển sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro  Chỉ tiêu Chiều dài rễ: ANOVA Table for Chieu dai re by Gia the Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 9.3615 9.3615 Within groups 16.051 58 0.276741 Total (Corr.) 25.4125 59 F-Ratio 33.83 P-Value 0.0000 Multiple Range Tests for Chieu dai re by Gia the Method: 95.0 percent LSD Gia the Count Mean Dat sach Dasa 30 2.18 Dat mun 30 2.97 Homogeneous Groups X X Contrast Sig Difference Dat mun - Dat sach Dasa * 0.79 * denotes a statistically significant difference +/- Limits 0.271891  Chỉ tiêu Chiều cao chồi: ANOVA Table for Chieu cao choi by Gia the Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 0.3375 0.3375 Within groups 8.375 58 0.144397 Total (Corr.) 8.7125 59 Multiple Range Tests for Chieu cao choi by Gia the Method: 95.0 percent LSD Gia the Count Mean Dat sach Dasa 30 3.1 Dat mun 30 3.25 Homogeneous Groups X X Contrast Sig Difference Dat mun - Dat sach Dasa 0.15 * denotes a statistically significant difference +/- Limits 0.196398 F-Ratio 2.34 P-Value 0.1317