KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KỸ THUẬT LÊN MEN

CÔNG NGHIỆP

(Bản thảo)

TS HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2016

MỤC LỤC

1 Khái niệm lên men 3

2 Ứng dụng của các quá trình lên men 4

2.1 Sản xuất sinh khối vi sinh vật 4

2.2 Sản xuất enzyme vi sinh vật 4

2.3 Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật 4

2.4 Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp 5

2.5 Hỗ trợ các quá trình biến nạp 8

3 Quá trình phát triển của công nghiệp lên men 8

CHƯƠNG 2 ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN 10 1 Phân loại phương pháp lên men 10

2 Phương pháp lên men mẻ 10

3 Phương pháp lên men liên tục 14

4 Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch) 16

5 Lên men mật độ cao 19

CHƯƠNG 3 QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP 20

1 Giới thiệu 20

2 Các công đoạn của qui trình lên men 21

3 Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men 29

CHƯƠNG 4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP 34

1 Giới thiệu 34

2 Thiết kế môi trường lên men 35

3 Các thành phần của môi trường lên men 38

4 Đánh giá môi trường 52

5 Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột 52

6 Xử lý mật rỉ mía đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men 54

CHƯƠNG 5 KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP 56

1 Mục đích khử trùng trong lên men 56

2 Yêu cầu khi khử trùng 57

3 Phương pháp khử trùng 57

4 Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt 59

5 Khử trùng môi trường 62

5.1 Khử trùng theo phương pháp liên tục 63

5.2 Khử trùng theo phương pháp mẻ 66

6 Khử trùng nồi lên men 66

7 Lọc không khí 68

CHƯƠNG 6 KIỂM SOÁT NUÔI CẤY 70

1 Kiểm soát tăng trưởng tế bào 70

2 Kiểm soát pH 74

3 Kiểm soát nhiệt độ 75

4 Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men 78

5 Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men 82

6 Phá bọt trong quá trình lên men 85

6 1 Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt 85

6.2 Những trở ngại gây nên bởi bọt 86

1 Nồng độ sản phẩm 89

2 Sản lượng 89

3 Hiệu suất 90

CHƯƠNG 7 TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN 95

1 Cải tiến giống 95

2 Cải tiến thiết bị 96

3 Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy 96

4 Phương pháp thiết kế thí nghiệm để xác định các điều kiện tối ưu cho lên men 102

CHƯƠNG 8 NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG CHỐNG TẠP NHIỄM TRONG LÊN MEN 103

1 Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn 103

2 Phát hiện tạp nhiễm 103

3 Nguyên nhân tạp nhiễm 104

4 Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men 105

5 Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm 106

6 Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm 108

CHƯƠNG 9 THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN 109

1 Giới thiệu 109

2 Các phương pháp tách tế bào 113

2.1 Phương pháp lắng tủa 113

2.2 Phương pháp ly tâm 113

2.3 Phương pháp lọc 114

2.4 Phương pháp tạo bọt 118

3 Phương pháp phá màng tế bào 119

3.1 Phương pháp vật lý 119

3.2 Phương pháp hóa học 123

- Dùng dung môi 126

3.3 Phương pháp sinh học-Enzyme 126

4 Phương pháp thu hồi và tinh sạch sản phẩm 127

4.1 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 127

4.2 Phương pháp thẩm tích 128

4.3 Phương pháp kết tủa 130

5 Phương pháp sắc ký tinh sạch sản phẩm lên men 134

5.1 Sắc kí lọc gel (Gel Permeation Chromatography Size Exclusion

Chromatography) 135

5.2 Sắc kí ái lực (Affinity Chromatography) 137

5.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion 138

CHƯƠNG 10 XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN 141

1 Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý 141

1.1 Giới thiệu 141

1.2 Các phương pháp xử lý chất thải 143

2 Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp 147

3 Triết lý “không phát thải” 148

CHƯƠNG 11 BÀI TẬP ÁP DỤNG 149

1 Bài tập 149

2 Bài giải 151

TÀI LIỆU THAM KHẢO 157

CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG

1 Khái niệm lên men

Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có nghĩa là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch Hiện tượng sôi bọt này là do CO2 sinh ra bởi sự phân giải hiếu khí của các loại đường có trong dịch chiết Tuy nhiên, đối với các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn

có ý nghĩa khác Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự sinh năng lượng bởi quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về phương diện vi sinh vật học trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn

Sự phân giải đường là một quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các phân tử pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị oxy hoá cho các quá trình tiếp theo Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa các phân

tử pyridine nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống cytochrome mà trong đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng Tuy nhiên, trong điều kiện kỵ khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn

ra cùng với sự khử của một hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian của một quá trình phân giải Đối với trường hợp về sự hoạt động của nấm men trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự khử của acid pyruvic thành ethanol Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau và rất đa dạng Do vậy, thuật ngữ lên men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là một quá trình sinh năng lượng trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho vừa là chất nhận điện tử Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết đại mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và

đã trở thành chất trao đổi của vi sinh vật được sản xuất công nghiệp đầu tiên Do vậy, các nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả bất kỳ qui trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật Việc sản xuất bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men theo cả nghĩa về sinh hoá học và vi sinh vật học Trong tài liệu này, thuật ngữ lên men được sử dụng theo nghĩa rộng bao hàm cả hai

Cần phân biệt các khái niệm:

Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùngLên men (sinh hoá) Chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ

Hô hấp hiếu khí Chất hữu cơ Oxygen

Hô hấp kỵ khí Chất hữu cơ Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate)

2 Ứng dụng của các quá trình lên men

2.1 Sản xuất sinh khối vi sinh vật

Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình chính (1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào

vi sinh vật dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn bào) Nấm men bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm

1900 và nấm men được sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong Đại thế chiến thứ I Tuy nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi sinh vật mới được khai thác mạnh mẽ Và do vậy từ những năm 1970, các qui trình sản xuất liên tục theo qui mô lớn đã được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh

khối vi sinh vật phục vụ cho chăn nuôi và thực phẩm cho con người

2.2 Sản xuất enzyme vi sinh vật

Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội hơn do có thể sản xuất với lượng rất lớn bằng kỹ thuật lên men Bên cạnh đó, nhờ sự tiến bộ của kỹ thuật DNA tái tổ hợp nên có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động vật bằng các chủng vi sinh vật Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1 1) Quá trình nuôi cấy

vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ Ngày nay, người ta

sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của các chủng như tăng cường chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp gene

2.3 Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật

Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong các phase khác nhau của đường cong tăng trưởng Ở log phase, sản phẩm được sinh ra chủ yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids, nucleotides, lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm

sơ cấp của sự biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase

Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất bằng phương pháp lên men (Bảng 1 2)

Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ

đủ cho nhu cầu trong tế bào của chúng Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật học công nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện nuôi cấy cần thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này

Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng không tổng hợp được trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối

với quá trình biến dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp,

và phase này gọi là idiophase Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên

ở tốc độ thấp, điều này khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase chiếm ưu thế hơn trophophase Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng thứ cấp, ví dụ như đối với trường hợp của vi khuẩn Enterobacteriaceae thì không tìm thấy có sản phẩm thứ cấp Đôi khi rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp của những hợp chất nhất định có thể thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy

Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được tranh luận nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các chất trao đổi trung gian nhiều hơn Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, là các enzyme ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều chất có dược tính Do vậy, sản phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ

sở của nhiều qui trình lên men khác nhau Cũng giống như trường hợp đối với các chất trao đổi sơ cấp, các chủng vi sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp với nồng độ thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi

sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và hệ thống phản hồi

2.4 Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứng dụng của công nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc sống của con người Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế bào vi sinh vật và các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại Có nhiều chủng vi sinh vật khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống biểu hiện bao gồm E.coli, Sac cerevisiae và các nấm sợi Các sản phẩm được sinh

ra từ các chủng được biến đổi di truyền gồm: interferon, insulin, albumin của huyết thanh người, các nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và somatostatin của bò Khi thiết kế các hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp cần chú ý đến một số vấn đề: sự tiết của sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp trong toàn bộ tiến trình lên men, cũng như tối ưu hóa biểu hiện của gene ngoại

Bảng 1 1 Các ứng dụng của enzyme trong thương mại

Xử lý các thực phẩm ăn nhanh Sản xuất các dịch si-rô

Lên men hạt cà-fé Làm chế phẩm cà-fé cô đặc Sản xuất các lọai bánh kẹo Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp

Sản xuất glucose từ siro bắp Sản xuất siro fructose

Sản xuất dịch thủy phân protein

On định sửa bay hơi Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng động lạnh

Sản xuất sữa thô Tách lọai glucose Làm trong các loại dịch Loại oxygen

Sử dụng làm chất tẩy Chống mọc lông

Amylase Protease Amylase Protease b-glucanase Amylase Pectinase Pectinase Pectinase, hemicellulase Invertase, pectinase Amylase

Amylase Amyloglycosidase Glucoseisomerase Protease

Protease Lactase Protease Glucose oxidase Pectinase

Glucose oxidase Protease, lipase Protease

Nấm Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm

Nấm/vi khuẩn Nấm

Nấm Nấm/vi khuẩn Nấm

Vi khuẩn Nấm

Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm

Nấm men Nấm/vi khuẩn Nấm

Nấm Nấm

Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn

Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ

Amylase, protease Steptokinase Numerous Protease Proteases Glucose oxidase, catalase Amylase

cellulase

Nấm

Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn

Vi khuẩn Nấm/vi khuẩn Nấm

Vi khuẩn Nấm

Bảng 1 2 Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại

Chất trao đổi sơ cấp Ý nghĩa thương mại

Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu

Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Chất tăng vị

Chất hổ trợ thực phẩm Chất tăng vị

Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo Chất hổ trợ thực phẩm

2.5 Hỗ trợ các quá trình biến nạp

Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một cấu trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính đặc trưng vị trí và lập thể cao Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình hóa học và cho phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở những vị trí đặc trưng nhất định trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến các hoá chất Các phản ứng được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử hydrogen, phản ứng oxy hoá, phản ứng hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng khử carboxyl, amin hoá, khử amin, phản ứng chuyển vị Các quá trình chuyển hóa nhờ vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa là thực hiện ở nhiệt độ và áp suất phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như các kim loại nặng

3 Quá trình phát triển của công nghiệp lên men

Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô

tả trong Bảng 1 3 Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn

1900 được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới hạn ở dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn

Bảng 1 3 Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men

CHƯƠNG 2 ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1 Phân loại phương pháp lên men

Tuỳ theo đặc điểm mà việc phân loại lên men có khác nhau

1 Theo tính chất môi trường: lỏng; rắn; bán rắn

2 Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí; lên men kỵ khí

3 Theo trạng thái: trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); trạng thái động (có khuấy trộn/sục khí)

4 Theo mức độ kiểm soát của qui trình: có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất, pH,…); không kiểm soát (tự nhiên)

5 Theo qui trình lên men: lên men theo mẻ (batch); lên men theo dạng liên tục (continuous); lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ sung)

Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên men theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh giá đối với các phương pháp lên men còn lại

2 Phương pháp lên men mẻ

Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ chất dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn phase khác nhau

Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có

sự tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong môi trường mới Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn thời gian của phase này càng nhiều càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm quan tâm Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích nghi, tăng trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b)

Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình toán học sau:

dx/dt = µx (2.1) Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm nuôi cấy được t giờ, µ là tốc

độ tăng trưởng đặc trưng (hr-1), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong chu kỳ tăng trưởng

dx/ µ

 (ln xt - ln x0) = µ (t - t0) (2.2)

x0: lượng sinh khối ban đầu, xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ)

Hình 1 1 Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi nuôi cấy dạng mẻ (a) lag- phase, (b) log- phase, (c) phase ổn định, (d) phase suy vong.

Trong log- phase, giàu dinh dưỡng, µ sẽ đạt µmax Mỗi chủng vi sinh vật trong những điều kiện tối thích nhất định sẽ có µmax khác nhau Tốc độ tăng trưởng phụ

0 0.2 0.4 0.6 0.8

sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy thì tăng trưởng sẽ vẫn đạt được ở tốc độ cao

Bảng 2 1 Một số giá trị µmax của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện nuôi cấy đặc trưng

Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2

theo phương trình:

N = N0 × 2 n (2.3) trong đó, N0 và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ

 n = 3,32 × lg(N/N0) (2.4)

Thời gian thế hệ tg

với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đôi qua n thế hệ

Đối với vi khuẩn tg thường khoảng 20-60 phút, đối với nấm men tg thường khoảng 1-3 giờ

Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ nuôi cấy

k = 1/g = n/t (2.6) Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có thể mô tả bằng phương trình:

x = Y×(si - sr) (2.7) trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, si là hàm lượng

cơ chất ban đầu, sr là hàm lượng cơ chất còn lại Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng lại khi sr = 0 hoặc khi mà trong môi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại

Chủng vi sinh vật µmax (giờ-1

) Nguồn tham khảo

Nuôi cấy tế bào thực vật 0,01-0,046 Petersen & Alfermann (1993)Nuôi cấy tế bào động vật 0,01-0,05 Lavery (1990)

khối vi sinh vật Do vậy có thể dùng Y để tính toán lượng cần thiết của một cơ chất khi muốn tổng hợp một lượng sinh khối nhất định Hiệu suất Y không phải là một hằng số ổn định mà thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH, hàm lượng oxygen hoà tan, sự giới hạn của các cơ chất, Sự suy giảm tăng trưởng phụ thuộc vào cơ chất giới hạn khi cạn kiệt trong môi trường có thể được mô tả theo phương trình (theo Monod, 1942):

µ = µmax× sr/(Ks + sr) (2.8) Trong đó Ks là hằng số sử dụng cơ chất, Hình 2 2 Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau (Bảng 2 2)

Khi sr = Ks thì µ = 1/2µmax Khi µ = 0, bước vào giai đoạn phase ổn định Đây là giai đoạn chính của việc sản xuất các chất trao đổi

Bảng 2 2 Một số giá trị K s của một số chủng vi sinh vật thông thường

Hình 2 2 Sơ đồ biểu thị trị số K s

Sự thay đổi hàm lượng các chất trao đổi có thể biểu diễn:

dp/dt = ρx (2.9) trong đó, p là nồng độ sản phẩm, ρ là tốc độ sinh tổng hợp đặc trưng Mặt khác, sự tạo thành sản phẩm tùy thuộc vào hoạt tính của chủng (hiệu suất trên một đơn vị tế bào):

Chủng vi sinh vật Cơ chất Ks (mg/dm3) Tham khảo

E.coli Glucose 6,8.10-2 Shehata and Marr (1971)

Sac cerevisiae Glucose 25,0 Pirt and Kurowski (1970)

Pseudomonas sp. Methanol 0,7 Harison (1973)

Từ hai phương trình trên ta có:

3 Phương pháp lên men liên tục

Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase, log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase được duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được lặp đi lặp lại cho đến khi nồi lên men đầy Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt thêm hệ thống thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở mức độ ổn định cao nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu

nguồn cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha lỗng Nếu tốc độ sử dụng

cơ chất của vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng trưởng tế bào thì một số đặc điểm sau sẽ xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha lỗng, và

do vậy tế bào sẽ bị chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng được sinh ra Điều này gây nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men Nồng độ

cơ chất trong nồi lên men sẽ tăng dần vì trong nồi lên men cịn ít tế bào hơn để sử dụng Khi nồng độ cơ chất cao hơn, tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao hơn tốc độ pha lỗng và khi đĩ, sinh khối tăng dần lên và trong trường hợp này thì trạng thái ổn định mới được thiết lập

Môi trường

x, S o , F

x, S r , F Thể tích

(B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối;

(C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng

Do vậy, người ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới hạn dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ (sub- µmax)

Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng (x) có thể được biểu diễn:

x = Y × (si + sf - sr) (2.17) Phương trình tạo sản phẩm:

Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);

 dp/dt = ρ.x – D.p (2.18)

Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0 Khi đó:

trong đóp là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định Trong nuôi cấy liên tục, người

ta còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:

1 Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa ngay vào một hệ thống lên men khác Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men

2 Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: Dịch chiết ra trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn Nếu lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng cường được sản lượng của hệ thống Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế bào rồi cho hồi lưu vào hệ thống Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế bào theo dịch chiết và vấn đề chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là một trở ngại lớn

4 Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)

Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung vào nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá trình nuôi cấy Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên men Các cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đang nuôi cấy có thể là (1) giống như thành phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn Đối với cơ chất giới hạn khi bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban đầu, hoặc (3) cao hơn hoặc (4) rất đậm đặc Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2)

gọi là mẻ-bổ sung thay đổi thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống mẻ-bổ sung cố định thể tích

4.1 Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích

Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem như

hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất Sinh khối tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình:

xt = xo + Y(si - sr) (2.20) trong đó xo là nồng độ giống nạp vào hệ thống

Khi sr = 0 và xt = xmax; do x0 << xmax

Hình 2 4 Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung

(A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích

(B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích

Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu như không tăng (dx/dt = 0), do vậy µ = D Đây được xem như là trạng thái cân bằng Khi thể tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy:

D = F/(V0 + F × t) (2.23)

Theo phương trình Monod, Khi sr giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên Tuy nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của µ thì si >> Ks nên trong thực tế sr thay đổi rất nhỏ Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng

p = ρ.x/D (2.25)

4.2 Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích

Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp nuôi cấy mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất giới hạn đạt đến một mức nhất định Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ cao, không làm thay đổi đến thể tích dịch lên men Động học trong hệ thống này được mô tả như sau:

dx/dt = G.Y (2.26) trong đó G là tốc độ nạp cơ chất

Do dx/dt = µx, nên:

G.Y = µx

Nếu GY/x < µmax thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc

đó ds/dt = 0 Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên:

Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau:

dp/dt = ρ.(x0 + G.Y.t) (2.30)

5 Lên men mật độ cao

Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra trong quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn

bị ban đầu Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ tăng trưởng là tốt nhất Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong trường hợp nuôi cấy mẻ-bổ sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để thể tích dịch lên men hoặc không thay đổi hoặc thay đổi ít

Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay ngoại bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ sản xuất đặc trưng (ρ) nhất định:

ρ = (P/X)/t (2.31)

trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng sinh khối tham gia sản xuất Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần phải tăng X

với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men Do thể tích dịch lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng nồng độ tế bào x trong quá trình lên men

Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có thể tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề sau

CHƯƠNG 3 QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

1 Giới thiệu

Trong phần này, chúng ta tập trung phân tích qui trình lên men công nghiệp theo phương pháp chìm, hiếu khí, có kiểm soát vì đây là qui trình bao gồm đầy đủ các thành tố của một qui trình lên men tiêu chuẩn Qui trình này thường bao gồm các công đoạn sau:

- Giữ giống

- Hoạt hóa giống

- Nhân giống (sơ cấp, thứ cấp)

- Lên men sản xuất

- Thu hồi sản phẩm lên men

- Xử lý các chất thải sinh ra trong quá trình sản xuất sản phẩm lên men Tùy theo chủng vi sinh vật, yêu cầu của sản phẩm mục tiêu và hệ thống công nghệ thiết bị mà điều kiện của từng bước trong qui trình lên men có thể khác nhau Tuy nhiên, để đảm bảo được hiệu quả sản xuất tốt và ổn định nhất thì toàn bộ các hoạt động có liên quan đến lên men có một đặc điểm chung là cần được thực hiện trong điều kiện có kiểm soát vô trùng

Nếu không đề cập đến các yếu tố về kiểu nồi lên men, về cơ bản một hệ thống lên men bao gồm sáu thành phần sau:

1 Công thức môi trường sử dụng trong qui trình nuôi cấy vi sinh vật từ giai đoạn nhân giống cho đến giai đoạn lên men sản xuất

2 Điều kiện vô trùng của môi trường nuôi cấy, nồi lên men và các thiết bị liên quan trong hệ thống

3 Bảo đảm nhân giống đủ số lượng với độ thuần nhất và chất lượng cao trước khi nạp vào nồi lên men chính

4 Sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật trong sản xuất dưới điều kiện tối ưu

để tạo thành các sản phẩm mong muốn

5 Chiết tách, tinh sạch và kết tinh sản phẩm

6 Xử lý chất thải của quá trình sản xuất

Các yếu tố này liên quan chặt chẽ với nhau theo một qui trình được mô tả

trong Hình 3 2 Từng yếu tố độc lập có thể được nghiên cứu cải tiến phù hợp để cuối

cùng nâng cao hiệu quả sản xuất của toàn hệ thống

Trước khi tiến hành xây dựng hệ thống lên men cần phải chọn lọc chủng giống

vi sinh vật bảo đảm sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn với hàm lượng cao

Việc chọn lọc chủng giống thường được thực hiện bởi các phòng nghiên cứu có năng lực và kinh nghiệm trong lĩnh vực phát triển chủng giống Ngoài ra, cần phải thực hiện đánh giá hiệu quả và tính ổn định của chủng trước khi đưa vào ứng dụng cho sản xuất Việc tuyển chọn chủng giống phục vụ sản xuất công nghiệp dựa trên một số tiêu chí sau:

- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ tiền)

- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi phí hệ thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)

- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng

- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao

Dựa vào loại sản phẩm lên men và các yêu cầu về độ tinh sạch của sản phẩm,

hệ thống thu hồi chiết tách và tinh sạch sản phẩm được thiết kế để bảo đảm hiệu suất cao, đạt tiêu chuẩn như mong muốn Trong quá trình vận hành sản xuất, cả ba yếu tố chính: chủng giống, qui trình lên men, qui trình thu hồi cần phải được nghiên cứu cải tiến liên tục nhằm thu nhận được nhiều sản phẩm với chất lượng cao

Chủng giống vi sinh vật được thu thập (phân lập, tuyển chọn) và phân phối từ các trung tâm lưu trữ giống danh tiếng trên thế giới (Xem phụ lục 4)

2 Các công đoạn của qui trình lên men

2.1 Giữ giống

Việc giữ giống có vai trò rất quan trọng đối với một qui trình lên men nhằm bảo đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho nghiên cứu và sản xuất

Quá trình giữ giống cần phải bảo đảm một số yêu cầu sau:

- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài, không xảy ra hiện tượng thoái hóa giống, giảm khả năng tăng trưởng hoặc/và giảm năng lực sản xuất của giống

- Không bị tạp nhiễm

Các phương pháp giữ giống khác nhau trong công nghiệp bao gồm:

a Giữ giống ở nhiệt độ thấp

a1 Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Giống vi sinh vật có thể được giữ

trên bề mặt môi trường thạch nghiêng (đối với các chủng hiếu khí) với nhiệt độ giữ giống từ –20 ~ 50C Trong quá trình giữ giống, phải cấy chuyền theo chu kỳ khoảng 6 tháng một lần Phương pháp cấy chuyền tuy đơn giản nhưng lại có những nhược điểm sau:

+ Dễ bị tạp nhiễm và dễ mất chủng giống gốc

+ Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy chuyền không thích hợp

+ Chủng vi sinh vật có thể bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến phát sinh qua nhiều lần cấy chuyền

+ Phải nghiên cứu, theo dõi môi trường và thời gian cấy chuyền thích hợp đối với các chủng bảo quản

+ Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản

Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền, giúp giữ giống trong thời gian dài người ta thường giữ giống trên bề mặt môi trường thạch nghiêng có phủ một lớp dầu bảo vệ, thời gian giữ giống có thể kéo dài đến 1 năm

a2 Giữ giống trong nitơ lỏng (đông sâu) Khi giữ giống ở nhiệt độ thấp (-150 ~

-196oC), hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật giảm hẳn, hầu hết các phản ứng sinh hoá đều không xảy ra, các phân tử nước tồn tại ở dạng liên kết hoặc tinh thể Đây là phương pháp giữ giống khá an toàn cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, virus, tảo và cả tế bào động vật, thực vật Tuy nhiên khi giữ giống bằng phương pháp này thì tế bào có thể bị phá vỡ và làm tan mẫu trong quá trình bảo quản lạnh do tích luỹ các chất điện giải và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Thông thường người ta cho chủng vi sinh vật cần giữ phát triển đến phase ổn định, bổ sung chất bảo vệ (thường là glycerol 10%; DMSO: dimethyl sulfoxide), sau đó làm lạnh và giữ Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp này khá tốn kém cho thiết bị, nguồn nitơ lỏng và một số rủi ro về vấn đề an toàn như cháy nổ

b Giữ trong điều kiện khử nước

b1 Nuôi cấy khô Phương pháp này thường được áp dụng đối với bào tử nấm

sợi Các bước tiến hành bao gồm ủ đất vô trùng với bào tử nấm khoảng vài ngày cho phát triển, làm khô ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tuần, sau đó cất giữ ở điều kiện không khí khô hoặc tủ lạnh

b2 Giữ ở điều kiện khử nước trong giá thể

+ Giữ giống trong cát Phương pháp này thường dùng để giữ các vi sinh vật có bào tử Các bước tiến hành như sau:

- Cát sông được đem rửa sạch bằng nước nhiều lần, sấy khô, rây để bỏ các hạt lớn; xử lý ngâm trong HCl đậm đặc sau đó đem đun sôi 1-2 giờ, rửa nhiều lần cho đến khi pH đạt trung tính, có thể trung hòa bằng NaOH hoặc NaHCO3 nếu pH còn thấp; sấy khô 100oC từ 3 - 4 giờ; chia cát khô vào các ống nghiệm và khử trùng trong

tủ sấy 160 - 180oC từ 2-3 giờ hoặc khử trùng trong autoclave 130oC trong 90 phút Trước khi sử dụng phải kiểm tra độ vô trùng bằng cách cho môi trường LB vào cát

đã vô trùng, nếu môi trường vẫn trong sau 48 giờ nuôi trong tủ ấm nghĩa là cát không chứa các vi sinh vật lạ nên có thể dùng; nếu môi trường bị đục thì phải đem cát khử trùng lại

- Chuẩn bị bào tử: các chủng vi sinh vật được nuôi trên môi trường agar thích hợp để tạo nhiều bào tử, thời gian thường đối với một số loài như sau: vi khuẩn 7 ngày, nấm mốc 7-8 ngày, xạ khuẩn 14 ngày

- Trộn bào tử vào cát: cho 1-2g cát đã vô trùng vào ống giống vi sinh vật đã hình thành bào tử dùng que cấy trộn đều bào tử với cát, tránh làm cát bị ướt quá vón cục, cho cát đã có bào tử vào ống nghiệm vô trùng, đậy nút bông và cho vào tủ sấy, giữ ở 40oC hoặc tủ sấy chân không có chất hút ẩm như CaCl2 trong thời gia 2-3 ngày cho đến khi cát thật khô, dùng paraffin đặc đun nóng chảy phết lên nút bông để tránh trường hợp hút ẩm trở lại, bảo quản trong phòng mát, hoặc trong tủ lạnh 4oC, thời gian bảo quản từ 1 đến nhiều năm, giống trước khi dùng được cấy ria trên môi trường thạch và chọn các khuẩn lạc điển hình

+ Giữ giống trong đất

Một số vi sinh vật có bào tử Clostridium pastetianum thường được bảo quản

tốt trong đất Các bước tiến hành: đất vườn đem nghiền nhỏ, rây lấy những hạt nhỏ bằng nhau cỡ 1 mm Nếu đất chua thì cần bổ sung 1-2% CaCO3 và thêm cát hoặc than hoạt tính khoảng 2% để làm cho đất được tơi xốp Cho vào mỗi ống nghiệm vô trùng

sinh vật, sấy khô, bảo quản như phương pháp bảo quản trong cát Thời gian bảo quản có thể đến 10 năm

+ Giữ giống trên silicagel Cách làm: Silicagel nghiền mịn cỡ 1 mm, phương pháp tương tự như giữ giống trên cát

+ Giữ giống trên hạt ngũ cốc Các hạt như lúa, ngô, kê… đều có thể được sử dụng để giữ giống vi sinh vật Cách làm: chọn loại hạt tốt, loại bỏ tạp chất, rửa sạch cho vào nước sôi theo tỷ lệ 100g hạt / 30 ml nước sôi, khuấy đều, ngâm 30 phút, lọc bỏ nước, rải hạt lên khay sạch để ráo nước, cho vào bình tam giác khoảng 15-16g/ bình 250ml, đậy nút bông, khử trùng 121oC trong 40 phút, 3 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ Bào tử của vi sinh vật đem hòa vào nước vô trùng, dùng pipet cấy vào mỗi bình 3 ml, lắc đều nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại chủng trong thời gian 8-10 ngày, hằng ngày lắc nhẹ

để phá vỡ các khối hạt bết lại, làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm còn khoảng 8% Kiểm tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi dán paraffin trên nút bông và bảo quản trong phòng mát

b3 Phương pháp đông khô Làm đông một dung dịch tế bào trong điều kiện

chân không, kéo theo sự thăng hoa của các phân tử nước Huyền phù dịch nuôi cấy được trong các môi trường bảo vệ như sữa, serum, hoặc glutamate natri, sau đó làm đông khô và giữ trong tủ lạnh Thời gian bảo quản có thể đến hơn 10 năm Ưu điểm của phương pháp này là tỷ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyền của vi sinh vật không bị biến đổi và thời gian giữ giống được kéo dài khá lâu, ít tốn công sức để cấy chuyền nhiều lần

Cách làm: nuôi vi sinh vật trên các môi trường thích hợp cho đến phase log, thu tế bào và trộn với các chất bảo vệ, dùng pipet vô trùng phân từng 0,2 ml huyền phù vi sinh vật vào các ống đông khô chuyên dùng, cho các ống giống vi sinh vật đã chuẩn

bị vào làm lạnh trong băng khô cacbonic + cồn etylic ở nhiệt độ -70oC đến -80oC, trong khoảng 1-5 phút Tiếp theo đưa vi sinh vật vào làm khô trong thiết bị đông khô

ở áp suất thấp, thời gian làm khô tùy thuộc vào thiết bị và số lượng giống cần làm khô, trung bình 8-14 giờ, độ ẩm sau khi làm khô còn lại 1-4% Để xác định độ ẩm còn lại người ta dùng chất chỉ thị là CoCl2 tẩm trên các miếng giấy lọc, sấy khô và bỏ các miếng giấy có tẩm CoCl2 vào các ống nghiệm kiểm tra, nếu giống đã được làm khô thì giấy có màu xanh còn nếu độ ẩm còn thì miếng giấy sẽ có màu hồng Các ống giống khi đã khô được hàn kín để tránh bị ẩm trở lại và có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ lạnh Một số chất bảo vệ được trộn vào giống vi sinh vật để khi

các quá trình oxy hóa… Ví dụ trong trường hợp giữ giống vi khuẩn Lactobacillus

bằng phương pháp đông khô, các dung dịch bảo vệ thường được dùng:

Nồi lên sản xuất (> 1000L)

Nồi nuôi cấy mầm (10-100L)

M

Nuôi cấy lắc (200-1000mL)

Nuôi cấy giống gốc (5-10mL)

Nguyên liệu Môi trường Thanh trùng

Ly tâm/lọc

Dịch nỗi Sinh khối

Xử lý nước thải Chiết xuất sản phẩm

Tinh chế sản phẩm Đóng gói

2 2 Hoạt hóa giống

Hoạt hoá giống là bước rất quan trọng nhằm mục đích khôi phục lại hoạt tính sau thời gian giữ giống Phương pháp cấy chuyền thường được sử dụng để hoạt hoá giống bằng cách cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm hoặc trên đĩa thạch, ủ ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi sinh vật phát triển thành một lớp trên mặt thạch Môi trường sử dụng phải bảo đảm giàu dinh dưỡng, độ pH tối ưu; điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ thoáng khí phải thích hợp cho sự tăng trưởng của chủng Các điểm cần lưu ý trong công đoạn này bao gồm:

- Bề mặt thạch cần phải đảm bảo độ ẩm nhất định, không được quá khô vì như thế sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng sau khi được cấy ria lên mặt thạch

- Trong quá trình cấy ria, cần phải bảo đảm ria đều (theo đường zic-zăc) trên mặt thạch, không ria quá gần mép thạch nghiêng vì ở đây lớp thạch mỏng, khô không thích hợp cho sinh khối tế bào khi khuẩn lạc phát triển lớn

- Cần phải kiểm soát tốt thời gian ủ để đạt được lượng sinh khối với hoạt tính tối ưu và ổn định Tránh trường hợp ủ thời gian quá dài, sinh khối tế bào phát triển quá nhiều (over growth), lớp tế bào trên cùng của khuẩn lạc không được tiếp xúc trực tiếp với dinh dưỡng của môi trường thạch trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của giống sau này

2.3 Nhân giống

Mục đích của nhân giống là tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình sản xuất Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase, khi đó hoạt tính của giống là tốt nhất Quá trình nhân giống thường chia thành hai giai đoạn:

a Nhân giống sơ cấp

Công đoạn nhân giống sơ cấp thường được thực hiện trong phòng nhân giống (phòng clean room) ở qui mô 100-500ml với thiết bị sử dụng có thể là:

1 Máy lắc với bình tam giác có thể tích phải gấp tối thiểu 4 lần thể tích dịch nuôi cấy để bảo đảm đủ không gian để lắc trộn dịch nuôi cấy và cung cấp đủ lượng oxy cần thiết Tốc độ lắc là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng trưởng của chủng trong quá trình nhân giống Nếu lắc ở tốc độ thấp sẽ không bảo đảm cung cấp

đủ độ hòa tan oxy tốt trong dịch nuôi cấy, chủng sẽ phát triển chậm Nếu lắc ở tốc độ quá nhanh, dịch nuôi cấy sẽ tiếp xúc với phần nút bông (cotton plug) làm ẩm ướt nút bông dễ gây ra hiện tượng tạp nhiễm và sẽ cản trở việc trao đổi không khí giữa bên

2 Nồi lên men nhân giống với kích thước nhỏ Hệ thống này có đầy đủ các yếu

tố bảo đảm cho chủng phát triển tốt nhất như độ khuấy trộn, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống hiệu chỉnh pH, nhiệt độ… Tuy nhiên do có nhiều hệ thống liên quan phức tạp tác động vào trong quá trình nuôi cấy nên nguy cơ xảy ra tạp nhiễm trong trường hợp này là rất cao

Khi quá trình nhân giống kết thúc cần phải tiến hành kiểm tra, đánh giá các thông số quan trọng trước khi đưa vào sản xuất như mật độ tế bào thông qua giá trị

OD hoặc DCW (dried cell weight), hiệu suất sinh khối, độ pH, … so với tiêu chuẩn Một trong những vấn đề quan trọng của công đoạn nhân giống sơ cấp là phải bảo đảm giống mầm không bị tạp nhiễm Để đạt được điều này, cần phải bảo đảm môi trường và thiết bị sử dụng được khử trùng triệt để, quá trình thao tác vận hành phải được chuẩn hóa, đáp ứng được các tiêu chí vô trùng Để kiểm tra tạp nhiễm của giống mầm thông thường sử dụng phương pháp nuôi cấy trải trên đĩa pettri Trong một số trường hợp do mật độ tạp nhiễm quá nhỏ, không thể phát hiện được, người

ta thường nuôi cấy tăng cường (enrichment culture) nhằm tăng số lượng tế bào tạp nhiễm (nếu có) trong mẫu thử để kiểm tra Phương pháp thực hiện như sau: dùng khoảng 10-50 ml dịch nhân giống sau khi kết thúc nuôi cấy nạp vào bình tam giác chứa môi trường tương tự như môi trường nhân giống và tiếp tục nuôi cấy cùng điều kiện trong thời gian 24 giờ Sau đó lấy mẫu dịch trải lên đĩa pettri để kiểm tra

độ tạp nhiễm Nếu tạp nhiễm xảy ra thì khả năng giống mầm ban đầu bị tạp nhiễm rất lớn Để bảo đảm kết quả đánh giá chính xác, quá trình nuôi cấy tăng cường cần phải được thực hiện trong điều kiện tuyệt đối vô trùng

b Nhân giống thứ cấp

Tùy theo qui trình mà hệ thống nhân giống thứ cấp được thực hiện qua một hoặc nhiều bậc Quá trình nhân giống thức cấp được thực hiện trong nồi nuôi cấy mầm với thể tích nạp giống tăng dần, khoảng 5-10% cho mỗi bậc Cần phải bảo đảm các điều kiện như thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ… tối ưu để chủng tăng trưởng tốt nhất Mục đích của nhân giống thứ cấp là tạo được lượng sinh khối lớn, hoạt tính tốt phục vụ cho lên men sản xuất

2.4 Lên men sản xuất

Đây là công đoạn chính của qui trình, do vậy cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều kiện nuôi cấy như lượng tế bào cần thiết cho sản xuất, nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hòa tan, nồng độ các cơ chất giới hạn nhằm đạt được hiệu quả lên men cao nhất Trong quá trình nuôi cấy cần phải rút ngắn lag phase, tăng cường tốc độ tăng trưởng đặc trựng   giá trị tối đa, ể đạt max và trong pha ổn định phải được duy trì tốt Một

bảo đảm duy trì được hoạt tính sản xuất của chủng (mẻ- bổ sung) Trong quá trình lên men cần phải phân tích, đánh giá hiệu quả lên men để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp, mang lại hiệu quả sản xuất cao nhất

3 Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men

Một hệ thống lên men hiếu khí có kiểm soát bao gồm các thiết bị liên quan như sau (Hình 3.3):

Hình 3 3 Mô hình hệ thống lên men kiểm soát tự động

Hình 3 4 Hệ thống thiết bị lên men qui mô pilot được thiết kế và gia công bởi công ty Khoa học và Kỹ thuật Vĩnh An (Việt Nam)

(1) Bồn lên men thể tích 50 L (2 bồn)

(2) Tủ điều khiển: Kiểm soát các thông số: tốc độ khuấy trộn, độ pH, nhiệt độ, oxy hoà tan

(3) Máy làm lạnh nước để giải nhiệt sinh học trong quá trình lên men

(4) Máy nén khí cung cấp không khí cho quá trình lên men

(5) Lò hơi điện nhằm cung cấp hơi nước nóng phục vụ cho khử trùng nồi lên men và khử trùng môi trường trước khi nuôi cấy

3.1 Nồi lên men

- Thân nồi: Tùy theo qui mô sản xuất mà thể tích bồn lên men sẽ khác nhau từ 1KL - 1.000 KL

- Hệ thống khuấy trộn: Nhằm mục đích tạo sự đồng nhất của dịch lên men trong nồi và tăng cường độ hòa tan của oxygen vào dịch lên men

- Thiết bị giải nhiệt: Do quá trình lên men sinh ra năng lượng sinh học dưới dạng nhiệt làm cho nhiệt độ của dịch lên men tăng lên Để kiểm soát nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy thì cần phải giải nhiệt cho nồi lên men Tác nhân giải nhiệt thường

là nước có nhiệt độ thấp 5-25oC, được cung cấp bởi hệ thống máy làm mát nước (chiller, cooling tower) Có 3 dạng thiết bị giải nhiệt thường được sử dụng cho nồi lên men: (1) dạng áo (jacket) bao bên ngoài nồi lên men; dạng ống vòng xoắn (coil)

Hình 3 5 Thiết bị trao đổi nhiệt thường dùng trong nồi lên men

- Hệ thống phân phối khí (air sparger): Nhằm phân chia không khí sục vào bồn qua những lỗ có kích thước nhỏ, tạo điều kiện cho không khí tiếp xúc tốt với dịch lên men, tăng diện tích tiếp xúc của bọt không khí với dịch lên men Hệ thống phân phối khí thường được lắp đặt ở gần đáy bồn lên men, bảo đảm hành trình của bọt khí trong nồi lên men khi đi từ đáy bồn đến mặt dịch là dài nhất để tăng tính hiệu quả hòa tan của oxy trong dịch nuôi cấy

- Hệ thống thoát khí và hồi lưu dịch bọt tan (cyclone): Đối với trường hợp lên men hiếu khí, không khí được sục vào từ đáy nồi lên men, sau đó sẽ thoát ra ngoài qua hệ thống cyclone được gắn ở đỉnh bồn Trong quá trình lên men do có rất nhiều bọt khí được hình thành và vì tỷ trọng của bọt nhỏ nên toàn bộ bọt sẽ nổi lên ở bề mặt dịch trong nồi lên men Phần lớn bọt khí này sẽ thoát ra khỏi nồi lên men cùng với không khí sau khi qua dịch lên men, đi vào hệ thống thu hồi dịch (cyclone) Ở trong cyclone, bọt sẽ bị vỡ ra do tác động cơ học, phần khí trong bọt sẽ thoát ra ngoài và phần dịch (màng bọt) sẽ được đưa trở lại nồi lên men qua đường ống hồi lưu gắn ở đáy cyclone

- Hệ thống các đầu dò cảm biến (sensor) để điều khiển pH, nhiệt độ, độ oxygen hoà tan (DO2), phá bọt tự động … Trong quá trình lên men, do hoạt động của vi sinh vật làm thay đổi các đặc điểm lý-hóa của dịch lên men Để bảo đảm các yếu tố này thường xuyên được duy trì ở giá trị phù hợp với nhu cầu của vi sinh vật, cần phải có

hệ thống cảm biến ghi nhận và hiệu chỉnh kịp thời Một hệ thống điều kiện tự động bao gồm: đầu dò cảm biến gắn trực tiếp vào nồi lên men, thiết bị ghi nhận và xử lý tín hiệu, van tự động đóng mở để kiểm soát lượng tác nhân hiệu chỉnh cung cấp vào nồi lên men trong quá trình nuôi cấy Ví dụ trong trường hợp kiểm soát pH tự động

đây sẽ phân tích và so sánh với giá trị cài đạt và sau đó sẽ gởi tín hiệu đến van tự động Van tự động sẽ mở ra và tác nhân hiệu chỉnh pH OH- sẽ được cung cấp vào nồi lên men Khi OH- vào nồi lên men sẽ làm cho pH tăng dần lên và khi vượt qua khỏi ngưỡng cài đặt 7,5 thì đầu dò cảm biến sẽ nhận diện và thông tin sẽ được xử lý, van

tự động sẽ đóng lại, ngưng cung cấp nguồn OH- Cứ như vậy, pH nuôi cấy của dịch lên men được kiểm soát tự động trong suốt quá trình lên men

- Các đường ống: nạp liệu, nạp giống, lấy mẫu, đường xả dịch …Tất cả các đường ống này đều có gắn van nhằm cô lập các hệ thống hỗ trợ với nồi lên men và

để điều tiết dịch nạp vào hoặc chiết ra khi cần thiết

3.2 Hệ thống cung cấp oxygen (không khí nén hoặc nguồn oxygen lỏng)

- Máy nén khí: hút không khí và nén lại ở áp suất 1-3 kgf/cm2 để cung cấp cho nồi lên men Lưu ý là nhiệt phát ra trong quá trình nén không khí do vậy cần phải giải nhiệt cho hệ thống thiết bị nén và không khí nén trước khi cung cấp vào nồi lên men Tác nhân giải nhiệt thường dùng là nước đã làm mát (chilled water/ cooling tower water)

Hình 3 6 Máy nén không khí sử dụng trong công nghiệp.

- Hệ thống tách nước ngưng trong khí nén, bao gồm các thiết bị hạ nhiệt, thiết

bị tách nước ngưng (cyclone) Do không khí sau khi được nén lại nhiệt độ sẽ tăng cao

và trong không khí có độ ẩm lớn nên trước khi sử dụng cho lên men cần phải tách loại nước ngưng và hạ nhiệt độ Hàm lượng ẩm cao trong khí nén sẽ làm tăng thể tích dịch lên men, giảm lưu lượng khí qua các lọc khi và có thể gây tạp nhiễm

- Thiết bị lọc khí Kích thước lỗ lọc có thể thay đổi từ 0,01 - 0,5 mm tùy theo

- Các thiết bị điều khiển áp suất, lưu lượng

3.3 Hệ thống nước giải nhiệt

- Tháp giải nhiệt, máy làm lạnh (chiller)

- Bơm cấp nguồn nước nhiệt độ thấp cho nồi lên men

Hình 3 7 Sơ đồ hệ thống máy làm lạnh nước cung cấp cho hệ thống lên men.

3.4 Hệ thống chuẩn bị và khử trùng môi trường liên tục

- Bồn chứa các thành phần nguyên liệu, bơm, thiết bị phụ trợ…

- Hệ thống thiết bị trao đổi nhiệt liên tục

- Tháp lưu

3.5 Lò hơi

Cung cấp hơi nước nóng với áp suất >1,5 kgf/cm2 phục vụ cho việc khử trùng nồi lên men, môi trường nuôi cấy… Có thể dùng các nhiên liệu như dầu DO, FO, khí hóa lỏng (LPG), khí nén thiên nhiên (CNG) để đốt lò hoặc dùng điện trở đốt nóng

(electrical boiler)

Hình 3 8 Sơ đồ lò hơi cung cấp hơi nước nóng để tiệt trùng cho hệ thống lên men.

NGHIỆP

1 Giới thiệu

Môi trường nuôi cấy được thiết kế tùy theo yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu Trước khi thiết kế môi trường lên men cần khảo sát chi tiết về nhu cầu dinh dưỡng của chủng, nguồn cơ chất trực tiếp tạo ra sản phẩm và hệ thống thiết bị-công nghệ lên men Tuy nhiên các môi trường lên men đều có chung một số yêu cầu căn bản Toàn bộ các chủng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng, phát triển và tạo sản phẩm trao đổi chất đều cần nước, nguồn năng lượng, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vitamin và oxygen (đối với trường hợp hiếu khí) Đối với qui mô phòng thí nghiệm thì việc chuẩn bị môi trường tương đối đơn giản vì thường dùng các hợp chất tinh khiết Tuy nhiên với qui mô sản xuất công nghiệp thì công đoạn này khá phức tạp

Trong công nghiệp người ta dùng các nguồn dinh dưỡng khác nhau để chuẩn

bị môi trường với yêu cầu là càng thỏa mãn các điều kiện sau đây càng tốt

- Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối hoặc/và sản phẩm

- Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối hoặc sản phẩm

- Cho phép tạo được tốc độ sản xuất tối đa

- Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp các sản phẩm không mong muốn

- Ổn định chất lượng và sẵn sàng cho sử dụng quanh năm

- Hạn chế đến mức tối thiểu việc xảy ra các vấn đề trong quá trình chuẩn bị và

- Hạn chế đến mức tối thiểu các vấn đề nảy sinh như gây trở nảy cho việc khuấy trộn, chiết tách, tinh sạch và xử lý chất thải

Cần lưu ý là việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến việc thiết kế nồi lên men, ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm và quá trình xử lý chất thải sau lên men và các yếu tố liên quan đến pháp luật, văn hóa, tôn giáo, …

2 Thiết kế môi trường lên men

Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy vi sinh Thành phần môi trường nuôi cấy phải bảo đảm đủ lượng để phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho việc duy trì mật độ tế bào và sự sinh tổng hợp Phương trình cân bằng vật chất trong quá trình lên men được mô tả như sau:

[C và E] + [N] + O2 + Các yếu tố khác  Sinh khối + Sản phẩm + CO2 + H2O + Nhiệt

Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng, trung lượng và vi lượng

- Yếu tố đa lượng bao gồm: Nguồn nước, nguồn carbon, nguồn nitơ

- Yếu tố vi lượng bao gồm: Nguồn muối khoáng, nguồn vitamin, các chất hỗ trợ tăng trưởng, chất kiểm soát …

Dựa vào thành phần và hàm lượng của các chất trong tế bào vi sinh vật để thiết kế đủ thành phần và lượng cần thiết nhằm thu nhận được sinh khối theo yêu

cầu, bảo đảm sản xuất Bảng 4.1 mô tả một số thành phần căn bản của sinh khối các

loài vi sinh vật khác nhau, cho thấy carbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô tế bào, và các nguyên tố C, O, N, H chiếm tổng cộng khoảng 92%

Bảng 4 1 Thành phần và hàm lượng các nguyên tố trong tế bào vi sinh vật

Đơn vị: % theo trọng lượng khô của tế bào

Bảng 4 2 Phân tích thành phần của một số chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh

vật carbon Nguồn

Tốc độ tăng trưởng

định

Trọng lượng phân

cerevisiae 50,3 7,4 8,8 33,5 CH1,75O0,15N0,50 23,9 Candida utilis Glucose 0,45 46,9 7,2 10,9 35,0 CH1,84O0,56N0,20 25,6

Candida utilis Ethanol 0,43 47,2 7,3 11,0 34,6 CH1,84O0,55N0,20 25,5

Từ các kết quả phân tích thành phần tế bào ở Bảng 4.2 trên đây cho thấy, hàm lượng carbon thay đổi từ 46-50%, H từ 6-7%, N từ 8-14% và O từ 29-35% Sự thay đổi này tùy thuộc vào cơ chất và điều kiện tăng trưởng Trong tính toán kỹ thuật,

Các nguyên tố E.coli Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc

người ta sử dụng công thức chung của vi sinh vật là: CH 1,8 O 0,5 N 0,2 Dựa trên công

thức này, trọng lượng phân tử tế bào được xác định là 24,6

Ví dụ: Muốn sản xuất thu 10 g tế bào khi sử dụng glucose làm nguồn carbon thì lượng glucose tối thiểu cần thiết trong môi trường phải là bao nhiêu?

Công thức ước định của tế bào: CH1,8O0,5N0,2

Glucose: C6H12O6: MW 180

Số phân tử mol tế bào cần là: 10/24,6

Số mole glucose cần 1/6×10/24,6

Lượng glucose cần: 1/6×10/24,6×180 = 12,2 g

Một số môi trường thông dụng:

1 Môi trường sinh tổng hợp Amylase (Underkofler, 1966)

Dịch chiết nấm men thủy phân 1,5%

3 Môi trường sản xuất Pennicillin (Perlan, 1970)

Lard oil (hoặc dầu thực vật) dùng làm chất phá bọt 0,5%

pH 6.5-7.5 (acid hoặc kiềm)

4 Môi trường sản xuất Endotoxin từ Baccillus thuringiensis (Holmberg et al., 1980)

vệ sinh thiết bị Nguồn nước cung cấp phải ổn định, sạch bảo đảm các yếu tố như độ

pH, các muối khoáng hòa tan và mức độ tạp khuẩn trong nước

Hàm lượng khoáng trong nước rất quan trọng đối với công nghiệp lên men sản xuất bia Ví dụ nước cứng có hàm lượng CaSO4 cao rất tốt cho bia đắng Bourton của Anh Nước có hàm lượng carbonate cao thì tốt cho các loại bia có màu sậm hơn như bia nâu Ngày nay, trước khi dùng cho qui trình lên men nước thường được xử

lý bằng phương pháp khử ion, hay các kỹ thuật khác như bổ sung muối khoáng, hiệu chỉnh pH, lọc bỏ tạp khuẩn, …

Trong thực tế, để tiết kiệm, góp phần giảm thiểu giá thành sản xuất, người ta thường nghiên cứu tái sử dụng nguồn nước thu hồi từ các qui trình khác Trong một

số qui trình sau lên men, ở giai đoạn thu hồi hoặc kết tinh, một lượng lớn nước thoát

ra từ qui trình này do hoạt động cô đặc Lượng nước này khi thoát ra trong quá trình bay hơi kéo theo một số hợp chất khác trong dịch như NH3 (còn lại trong dịch lên men của mẻ trước), các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, … sau đó được đưa vào tái sử dụng cho lên men, góp phần làm giảm tải cho qui trình xử lý nước thải của hệ thống

3.2 Nguồn năng lượng

Năng lượng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bắt nguồn hoặc là từ sự oxy hóa các thành phần dinh dưỡng trong môi trường hoặc là từ ánh sáng Hầu hết trong công nghiệp vi sinh, các chủng thường dùng là hóa dưỡng Do vậy, nguồn năng lượng thông dụng nhất được dùng là từ nguồn carbon như các carbohydrate, lipid và protein Một vài chủng còn dùng được cả hydrocarbon hay methanol làm nguồn C và năng lượng cho quá trình tăng trưởng và trao đổi chất Chu trình TCA vừa cung cấp các acid hữu cơ làm khung C để hình thành các chất quan trọng khác cung cấp cho tế bào mặt khác còn cung cấp các chất mang năng lượng lớn như NADH, FADH, các chất này sau đó di vào chuỗi chuyển điện tử để tổng hợp ATP cung cấp nguồn năng lượng lớn cho hoạt động của tế bào