Theo truyền thống, sản xuất giấm nhằm tận dụng một lượng lớn tỷ lệ trái câyở giai đoạn trái quá chín hoặc các phần trái cây loại ra từ các cơ sở chếbiến. Giấm có thể được sản xuất từ nguyên liệu có đường và tinh bột, là chấtnền cho quá trình lên men tạo rượu và tiếp theo là quá trình lên men tạoacid acetic. Vi khuẩn lên men giấm (vi khuẩn acid acetic) là giốngAcetobacter với đặc tính chuyển đổi rượu ethylic (C2H5OH) thành acidacetic (CH3CO2H) bởi quá trình oxy hóa. Trong nghiên cứu này, giấm đượcsản xuất từ chuối với việc kiểm soát các thông số ảnh hưởng chủ yếu đến khảnăng tạo acid acetic, bao gồm nồng độ rượu (59% vv), nồng độ đường(075 gL) và mật số vi khuẩn A. Aceti trong khoảng 104 đến 106 tế bàomL.Phương pháp mô hình bề mặt đáp ứng được chọn nhằm tối ưu hóa các thôngsố của tiến trình như hàm lượng rượu, đường và mật số tế bào vi khuẩn choquá trình lên men giấm vang chuối. Tương quan giữa hàm lượng acid aceticthực nghiệm và tính toán theo phương trình được tìm thấy (R2=0,97). Giấmchuối đạt hàm lượng acid acetic cao (4%) khi lên men trong thời gian 6 tuầnở nhiệt độ phòng (3738oC) với dịch lên men chứa 5% ethanol, hàm lượngđường 20,62 gL và mật số vi khuẩn 105 tế bàomL.
Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 TƯƠNG QUAN GIỮA HÀM LƯỢNG ACID ACETIC SINH RA VÀ ETHANOL, ĐƯỜNG, MẬT SỐ VI KHUẨN A ACETI TRONG SẢN XUẤT GIẤM VANG CHUỐI Nguyễn Thị Mai Hiền1 Nguyễn Minh Thủy2 Học viên Cao học CNSTH K19, Trường Đại học Cần Thơ Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 26/9/2014 Ngày chấp nhận: 07/11/2014 Title: The relationship between acetic acid content and ethanol, sugar, bacteria in the production of banana vinegar Từ khóa: Acetobactor aceti, ethanol, đường, giấm chuối, mô hình bề mặt đáp ứng Keywords: Acetobactor aceti, ethanol, sugar, vinegar banana, response surface methodology ABSTRACT Traditionally, vinegar production is performed using parts of too ripe fruits or by-product of fruit processing Vinegar could be produced using sugar and starch, which are substrates for ethanol fermentation then acetic acid fermentation Bacterium used for fermentation of vinegar (acetic acid bacterium) is Acetobacter which transforms ethanol (C2H5OH) into acetic acid (CH3COOH) by oxidation In this study, vinegar was produced using bananas by controlling main factors affecting the acetic acid production, including alcohol concentration (5 to 9% v/v), sugar concentration (0 to 75 g/L) and bacteria cell population (104 to 106 cells A aceti/mL) The Response Surface Methodology was adopted to optimize the process parameters including alcohol content, sugar content, and A aceti population for the vinegar fermentation The correlation between the experimental data and the predicted model was quite good (R2=0.97) For banana vinegar, the maximum acidity was obtained (4%) at 5% of alcohol level, sugar content of 20.62 g/L and A aceti cell concentration of 105 cell per mL for weeks at 37-38oC TÓM TẮT Theo truyền thống, sản xuất giấm nhằm tận dụng lượng lớn tỷ lệ trái giai đoạn trái chín phần trái loại từ sở chế biến Giấm sản xuất từ nguyên liệu có đường tinh bột, chất cho trình lên men tạo rượu trình lên men tạo acid acetic Vi khuẩn lên men giấm (vi khuẩn acid acetic) giống Acetobacter với đặc tính chuyển đổi rượu ethylic (C2H5OH) thành acid acetic (CH3CO2H) trình oxy hóa Trong nghiên cứu này, giấm sản xuất từ chuối với việc kiểm soát thông số ảnh hưởng chủ yếu đến khả tạo acid acetic, bao gồm nồng độ rượu (59% v/v), nồng độ đường (075 g/L) mật số vi khuẩn A Aceti khoảng 104 đến 106 tế bào/mL Phương pháp mô hình bề mặt đáp ứng chọn nhằm tối ưu hóa thông số tiến trình hàm lượng rượu, đường mật số tế bào vi khuẩn cho trình lên men giấm vang chuối Tương quan hàm lượng acid acetic thực nghiệm tính toán theo phương trình tìm thấy (R2=0,97) Giấm chuối đạt hàm lượng acid acetic cao (4%) lên men thời gian tuần nhiệt độ phòng (37-38oC) với dịch lên men chứa 5% ethanol, hàm lượng đường 20,62 g/L mật số vi khuẩn 105 tế bào/mL 76 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 chuối, phương pháp sử dụng để tối ưu hóa trình lên men tạo acid acetic từ vang chuối GIỚI THIỆU Giấm biết đến toàn giới gia vị hay tác nhân bảo quản thực phẩm Giấm sản xuất từ nguyên liệu có nguồn gốc nông nghiệp phù hợp, có chứa tinh bột, đường tinh bột đường trình lên men đôi, tạo cồn acid acetic Giấm loại gia vị truyền thống có tính acid, sản xuất rộng rãi từ gạo, mạch nha, táo, dạng rượu vang khác vật liệu nông nghiệp (Horiuchi et al., 1999) Quá trình lên men giấm trình hai giai đoạn với giai đoạn chuyển đổi kỵ khí loại đường lên men thành ethanol nấm men, sử dụng loài Saccharomyces, thứ hai trình oxy hóa hiếu khí ethanol vi khuẩn, thường loài Acetobacter (Horiuchi et al., 2000) Vi khuẩn giấm, gọi vi khuẩn acid acetic, thành viên chi Acetobacter với đặc điểm chuyển đổi ethyl alcohol, C2H5OH thành acid acetic Theo FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ), giấm chứa không gram acid acetic 100 ml 20°C, áp dụng biện pháp lọc, chưng cất trùng 74°C trước đóng chai PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu Nguyên liệu: chuối già chín (Musa acuminata Colla cv.) thu nhận từ vườn chuối nông hộ xã Thiện Mỹ, Trà Ôn, Vĩnh Long Giống nấm men: dòng Saccharomyces cerevisiae phân lập từ nước nốt (Nguyễn Minh Thủy ctv., 2011) Giống vi khuẩn: Acetobacter aceti 15973 (ATCC, Mỹ) ATCC Môi trường tăng sinh vi khuẩn: môi trường GYC (Glucose–Yeast extract–Calcium carbonate) (Benito, 2005) Enzyme Pectinex Ultra SPL (Đan Mạch): chế phẩm enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus aculeatus bao gồm hệ enzyme pectolytic, protease, cellulase hemicellulase 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu sử dụng lên men giấm thường rượu gạo, rượu vang, sản phẩm có cồn khác Hiện có khoảng 10% sản lượng acid acetic giới sản xuất theo phương pháp sinh học (Awad et al., 2012) phương pháp xem quan trọng qui định nhiều quốc gia tổ chức FAO giấm sử dụng thực phẩm phải có nguồn gốc sinh học (lên men) (Zahoor et al., 2006) Quy trình sản xuất giấm vang chuối thực theo sơ đồ: Chuối chín → Bóc vỏ → Chần→ Xay → Lọc→ Dịch → Phối chế → Thanh trùng → Lên men rượu → Phối chế → Lên men giấm → Lọc trùng → Sản phẩm Chọn nguyên liệu chuối có độ chín đồng đều, tách vỏ, xắt miếng với kích thước 3-5 cm xử lý dung dịch acid citric 0,3% (với tỷ lệ chuối: nước 2:1) Nguyên liệu chần nhiệt độ 70oC phút, sau xay nhuyễn (tạo thành dạng paste) điều chỉnh pH 4,5 Paste chuối bổ sung 0,05% chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SPL tiến trình thực nhiệt độ 40oC 40 phút Enzyme với tỷ lệ 0,1% bổ sung trì nhiệt độ 55oC 15 phút Lọc lấy dịch quả, điều chỉnh dịch lên men 18oBrix bổ sung nấm men để lên men rượu phương pháp lên men tĩnh nhiệt độ phòng ngày Rượu sau kết thúc trình lên men pha loãng nồng độ từ đến 9% (cách 2%) kiểm soát hàm lượng đường bổ sung theo tỉ lệ từ 25 đến 75 g/L (cách 25 g) với mẫu không bổ sung đường Mật số vi khuẩn Acetobacter aceti ATCC 15973 chủng vào rượu chuối với hàm lượng thay đổi từ 104 đến 106 tế bào/mL Quá trình lên men giấm thực nhiệt độ phòng Việt Nam nước có sản lượng chuối cao với giá thấp thị trường chuối chín Chuối có thời gian sử dụng ngắn nhanh chóng suy giảm với tỷ lệ lớn sau thu hoạch Chuối (Musa sp.) giàu vitamin B6, giúp chống nhiễm trùng cần thiết cho tổng hợp hemoglobin (có chứa sắt) Chuối giàu kali nguồn chất xơ tốt Vì vậy, lên men tạo giấm từ chuối chín hạn chế tổn thất sau thu hoạch chuối, nâng cao hiệu kinh tế cho nhà vườn Trong thí nghiệm này, nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng để chuyển đổi glucose thành rượu ethylic Lên men acetic bước trình lên men, phân tử rượu oxy hóa thành acid acetic tác động vi khuẩn Acetobacter aceti tạo hương vị dấm đặc trưng Phương pháp bề mặt đáp ứng xem thành công sử dụng phổ biến để mô hình hóa tối ưu trình hóa sinh hóa công nghệ sinh học liên quan đến hệ thống thực phẩm Đặc biệt nghiên cứu sản xuất giấm từ vang 77 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 Các tiêu chất lượng sản phẩm phân tích bao gồm: hàm lượng ethanol (% v/v), độ Brix, hàm lượng acid acetic (%) (Lê Thanh Mai ctv., 2009) Quá trình lên men khoảng tuần Hình biểu diễn tích tụ acid acetic thay đổi hàm lượng ethanol, saccharose theo thời gian lên men Trong tuần đầu, đường bổ sung vào môi trường lên men, vi khuẩn sử dụng hết đường để sinh trưởng phát triển Theo Sossou et al (2009), khởi đầu trình hình thành acid acetic có liên quan đến tăng trưởng tối đa tế bào đủ sinh khối để bắt đầu trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic Do đó, việc thay đổi môi trường ban đầu có ảnh hưởng đến vi sinh vật lên men Nghiên cứu Brock Madigan (1991) cho thấy vi sinh vật cần giai đoạn để thích ứng (pha log), thời điểm vi sinh vật hoạt động chưa mạnh nên hàm lượng acid sinh Ở pha lag, vi khuẩn có đủ lượng sử dụng để tổng hợp acid acetic Sự tiêu thụ hết hàm lượng ethanol 5% tương ứng với tăng dần hàm lượng acid acetic đạt tối đa từ 0,3 đến 3,98% thời gian tuần Vi khuẩn sử dụng chất ethanol để chuyển hóa thành sản phẩm trung gian acetaldehyde cuối thành acid acetic Quá trình lên men kết thúc tuần thứ ethanol sử dụng hết vi khuẩn tiếp tục thực trình oxy hóa, sử dụng acid để chuyển hóa thành CO2 H2O làm giảm chất lượng giấm Hiệu suất tính theo công thức: H(%) = Lượng sản phẩm thực tế/lượng sản phẩm lý thuyết) x 100 2.3 Phân tích thống kê Phân tích thống kê (STATGRAPHIC) sử dụng để chọn mô hình phù hợp cho liệu thu thập Mô hình (1) đề xuất (giá trị Y) trường hợp này: Y = bo + bnXn + bnnXn2 + bnmXnXm + (1) Trong đó: bo hệ số; bn, bnn bnm hệ số bậc 1, bậc phương trình hồi quy; Xn, Xm giá trị biến độc lập Kiểm định tương thích liệu theo mô hình liệu thực nghiệm thực KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tiến trình lên men tạo giấm từ chuối Rượu sau lên men đạt nồng độ 11 (% v/v) pha loãng 5%, bổ sung lượng đường 25 g/L để thực trình oxi hóa ethanol thành acid acetic Các tiêu đo 30 25 20 15 10 0 Thời gian lên men (tuần) Hàm lượng acid (%) Hàm lượng rượu lại (% v/v) Hàm lượng đường (g/L) Hình 1: Chuyển hóa thành phần (rượu đường) thành acid acetic theo thời gian lên men (mật số tế bào vi khuẩn 105 tế bào/mL) 78 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 nhiễm tăng, đặc biệt tế bào nấm men có sẵn rượu nên đường bổ sung vào môi trường nấm men tiếp tục hoạt động Dữ liệu phân tích cho thấy với nồng độ rượu 9% giai đoạn đầu (pha lag) vi khuẩn A.aceti cần thời gian để thích nghi với môi trường, lượng acid sinh thấp, pH môi trường chưa giảm mạnh nên không đủ để ức chế hoạt động nấm men, nấm men tiếp tục hoạt động làm cho nồng độ rượu tăng lên ức chế hoạt động vi khuẩn A.aceti Ở hàm lượng ethanol ban đầu 9% sau lên men lượng ethanol lại 10% Kết nghiên cứu tương đồng với kết công bố Zahoor et al (2006), nồng độ ethanol 10% vi khuẩn A.aceti không phát triển acid sinh thấp Ảnh hưởng hàm lượng ethanol Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng ethanol đến hàm lượng acid sinh tiêu sản phẩm trình lên men giấm mức độ 5, 9% thể Bảng Theo Nguyễn Đức Lượng ctv (2004), sản xuất giấm dùng rượu không cần trùng, cần bổ sung acid để acid hóa môi trường Tuy nhiên, để giữ hương vị tự nhiên sản phẩm giấm vang, rượu sử dụng cho trình lên men giấm nghiên cứu không qua trùng, không bổ sung acid acetic để acid hóa môi trường Vì vậy, trình lên men số lượng vi khuẩn acetic tăng giai đoạn đầu trình lên men số lượng vi sinh vật tạp Bảng 1: Ảnh hưởng hàm lượng ethanol đến tiêu sản phẩm Hàm lượng ethanol (%v/v) Hàm lượng acid (%) 2,750a 0,809b 0,379c Chỉ tiêu Ethanol lại (% v/v) 1,344a 7,500b 10,559c Độ Brix (%) 3,008a 3,650b 4,658c Hiệu suất (%) 59,043a 12,246b 4,437c Ghi chú: Các chữ khác kèm theo trung bình nghiệm thức cột thể khác biệt mức ý nghĩa 5% (trung bình 59,04%) thể khác biệt ý nghĩa so với hiệu suất lên men mẫu có nồng độ rượu 9%, tương ứng 12,24 4,43% 3.3 Ảnh hưởng mật số vi khuẩn Ngoài ra, theo Nguyễn Đức Lượng ctv (2004), hàm lượng ethanol thích hợp cho trình lên men giấm 6-15% Tuy nhiên, khả oxy hóa ethanol để tạo thành acid acetic vi khuẩn acetic có thay đổi lớn giống, loài (Gullo and Giudici, 2008) điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men nhiệt độ, thoáng khí, phương pháp lên men Vì vậy, với hàm lượng ethanol sử dụng khoảng 7% hàm lượng acid acetic sinh không cao, trung bình 0,8% Bên cạnh đó, lượng đường bổ sung ban đầu vào dịch lên men với hàm lượng ethanol 9% sử dụng hết nấm men sử dụng đường để lên men rượu Ngược lại với hàm lượng ethanol để lên men giấm 5% lượng acid sinh cao nồng độ rượu vi khuẩn thích ứng nhanh với môi trường Nồng độ rượu thấp kích thích sinh trưởng phát triển vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng ctv., 2004), acid sinh nhiều, pH giảm mạnh ức chế hoạt động nấm men, hàm lượng ethanol 5% thích hợp cho trình lên men giấm vang, hàm lượng acid sinh trung bình khoảng 2,75% Bấy hàm lượng đường dịch lên men giảm nhanh vi khuẩn sử dụng đường để sinh trưởng, tăng mật số chuyển hóa ethanol thành acid acetic Cũng hàm lượng ethanol này, hiệu suất trình lên men cao Trong tiến trình lên men giấm, vi khuẩn Acetobacter tham gia vào trình oxy hóa sinh học chuyển hóa ethanol thành acid acetic kết hợp enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) aldehyde dehydrogenase (ALDH) (Valli et al., 2006) Khi lên men giấm, tế bào nấm men bị ức chế chết hình thành acetaldehyde sản phẩm trình chuyển hóa rượu thành acid acetic acetaldehyde ảnh hưởng đến hoạt động enzyme nấm men (Aranda and Delomo, 2003) Kết thể bảng cho thấy với mật số vi khuẩn 105 106 tế bào/mL hàm lượng acid acetic sinh nhiều khác biệt ý nghĩa Tương tự, hàm lượng ethanol sản phẩm khác biệt ý nghĩa hai mức độ vi khuẩn sử dụng Trong với mật số vi khuẩn sử dụng cho tiến trình lên men 104 tế bào/mL cho lượng acid sinh ít, pH môi trường giảm nhẹ không đủ để ức chế hoạt động nấm men, làm cho nấm men tiếp tục lên men rượu trở lại Và nồng độ rượu cao ức chế ngược lại hoạt động vi khuẩn dẫn đến lượng rượu lại nhiều 79 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 Bảng 2: Ảnh hưởng mật số vi khuẩn đến tiêu sản phẩm Mật số vi khuẩn (tế bào/mL) 104 105 106 Hàm lượng acid (%) 0,867a 1,499b 1,572b Chỉ tiêu Hàm lượng ethanol (% v/v) 7,072a 6,314b 6,017b Độ Brix (%) 3,858a 3,783a 3,675b Hiệu suất (%) 16,537a 28,825b 30,364b Ghi chú: chữ khác kèm theo trung bình nghiệm thức cột thể khác biệt mức ý nghĩa 5% 3.4 Theo Gullo and Giudici (2008), chi Acetobacter Gluconacetobacter oxi hóa ethanol dễ dàng đường Gluconobacter spp oxy hóa đường dễ dàng ethanol, Acetobacter oxy hóa ethanol thành acid acetic mà không cần bổ sung đường Tuy nhiên, đường diện trình lên men giấm có ảnh hưởng đến giá trị cảm quan sản phẩm Ảnh hưởng nồng độ đường Dữ liệu phân tích thể bảng cho thấy mẫu giấm có bổ sung đường 25 g/L cho lượng acid sinh cao có khác biệt so với mẫu không bổ sung đường mẫu bổ sung đường hàm lượng 50 75 g/L Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ đường đến tiêu sản phẩm Hàm lượng đường (g/L) 25 50 75 Nồng độ acid (%) 1,304a 1,607b 1,299a 1,041c Chỉ tiêu Lượng ethanol (%v/v) 5,439a 5,474a 6,889b 8,064c Độ Brix (%) 2,422a 3,356b 4,322c 4,989d Hiệu suất (%) 25,081b 30,952c 24,849b 20,083a Ghi chú: chữ khác kèm theo trung bình nghiệm thức cột thể khác biệt mức ý nghĩa 5% (104 đến 106 tế bào/mL) đến hàm lượng acid acetic sinh trình lên men giấm thực Hiệu suất trình lên men chịu ảnh hưởng hàm lượng đường bổ sung Với hàm lượng đường sử dụng cho trình lên men 25 g/L hiệu suất lên men cao (trung bình 30,95%), hàm lượng đường bổ sung khác (50 75g/L) không bổ sung đường hiệu suất trình lên men thấp hơn, giá trị trung bình đạt tương ứng 28,5, 24,8 20,08% 3.5 Tương tác hàm lượng acid acetic sinh biến độc lập (hàm lượng rượu, hàm lượng đường mật số vi khuẩn) Kết phân tích cho thấy tương thích mô hình hồi quy đa chiều (phương trình 2) mô tả mối quan hệ acid acetic sinh số hạng (3 biến độc lập X1, X2, X3) Hàm lượng acid acetic (%) = -0,2411 – 2,3923 X1 – 0,00108 X2 + 4,4328 X3 – 0,1838 X1X3 + 0,189 X12 – 0,2794 X32 – 0,000224 X22 + 0,00193 X1X2 (2) Trong đó: X1 hàm lượng ethanol (5÷9% v/v), X2 hàm lượng đường bổ sung (25÷75 g/L) X3 mật số vi khuẩn (104 đến 106 tế bào/mL) Theo Kadere et al (2008) chủng chi Acetobacter giữ vai trò chủ yếu trình sản xuất giấm Vai trò quan trọng vi khuẩn Acetobacter rõ chuyển hóa ethanol thành acid acetic Ngoài ra, trình sản xuất giấm cần lượng đường cho phát triển vi khuẩn, tham gia vào trình sản xuất acid acetic (Gullo et al., 2005) Do đó, nghiên cứu xác định mối tương quan nhân tố bao gồm hàm lượng ethanol (5÷9% v/v), hàm lượng đường bổ sung (25÷75g/L mẫu đối chứng) mật số vi khuẩn Phân tích thể bảng ANOVA cho thấy giá trị P hầu hết nhỏ 0,05, cho thấy tương quan có ý nghĩa mặt thống kê biến với mức độ tin cậy 95% (dữ liệu thống kê ANOVA không trình bày đây) Hệ số xác định tương quan R2 theo thống kê mô hình tương thích 96,425% biến thiên giá trị acid acetic thu nhận Sai số chuẩn ước tính (SEE) cho 80 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 thấy độ lệch chuẩn số dư 0,2503 Với giá trị P lớn 0,05, cho thấy tương quan tiếp số dư mức độ tin cậy 95,0% Hàm lượng acid acetic (%) = - 0,2702 – 2,3889 X1 + 4,4328 X3 – 0,1838 X1X3 + 0,189 X12 – 0,2794 X32 – 0,000229 X22 + 0,00183 X1X2 (3) R2 = 96,43%, SEE = 0,2458 Trong việc xác định mô hình đơn giản hóa, giá trị P thể cao biến độc lập 0,8965, thuộc giá trị X2 (hàm lượng đường) Khi giá trị P biến độc lập 0,05, thành phần ý nghĩa thống kê mức độ tin cậy 95% cao Do đó, xem xét loại bỏ biến X2 từ mô hình Phương trình cho thấy yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến trình tạo acid acetic hàm lượng ethanol (X1) sử dụng, mật số vi khuẩn (X3) sau lượng đường (X2) Các tương tác liên quan đến biến độc lập (X12, X22, X32, X1X3, X1X2,) thể mức độ ảnh hưởng quan trọng Phương trình viết lại thành phương trình Phân tích ANOVA cho thấy biến độc lập có giá trị P nhỏ 0,05, giá trị P cao 0,0033 thể biến X12 (mật số vi khuẩn) (bảng phân tích ANOVA không trình bày đây) Như dù giá trị cao so với giá trị P biến độc lập khác nhỏ 0,05, cho thấy mức độ ý nghĩa với độ tin cậy 95% Giá trị P mô hình nhỏ 0,05 hệ số xác định tương quan cao (R2=96,43%), khẳng định mức độ ý nghĩa độ tin cậy mô hình hồi quy đa chiều thiết lập Mức độ tương thích hàm lượng acid acetic thực nghiệm tính toán theo phương trình hồi quy tìm thấy (Hình 2) (R2 = 0,96) HL acid acetic dự đoán (%) 0 HL acid acetic thực nghiệm (%) Hình 2: Tương quan nồng độ acid acetic (%) thực nghiệm dự đoán theo phương trình (2) (HL: hàm lượng) men hoạt động trở lại ức chế hoạt động vi khuẩn Khi cố định hàm lượng đường bổ sung 25 g/L, tương quan hàm lượng acid acetic sinh hàm lượng ethanol với mật số vi khuẩn trình bày phương trình Hình Ngược lại với hàm lượng ethanol, thực tiến trình lên men acetic, việc bổ sung mật số vi khuẩn tăng dần từ 104 đến 106 (tế bào/mL) hàm lượng acid acetic tạo thành tăng dần đạt cao mật số vi khuẩn từ 105 đến 106 (tế bào/mL) (không thể khác biệt có ý nghĩa) Điều mật số vi khuẩn nhiều khả chuyển hóa ethanol thành acid acetic nhanh, pH môi trường giảm nhanh ức chế ngăn cản hoạt động trở lại nấm men (Valli et al., 2005) Hàm lượng acid acetic (%) = - 0,4136 – 2,343 X1 + 4,4328 X3 – 0,1838 X1X3 + 0,189 X12 – 0,2794 X32 (4) Trong trình lên men giấm, tăng hàm lượng ethanol từ lên 9% lượng acid tạo thành giảm chất ethanol cao ức chế hoạt động vi khuẩn A.aceti Đồng thời, thời gian để vi khuẩn thích nghi môi trường lâu hàm lượng ethanol thấp, tạo điều kiện cho nấm 81 Ham lu o n g acid (% ) Hàm lượng acid acetic (%) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 HàmNong lượndo g etruou hanol (% v/v) Mậ Hàm lượng acid Function acetic (%) 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6 4.0 4.4 5.6 ) 5.2 mL 4.8 ào/ b tế 4.4 Mat ogso vi khuan l ( uẩn i kh v t số Hình 3: Mô hình bề mặt đáp ứng thể tương quan acid acetic, hàm lượng ethanol mật số vi khuẩn trình lên men giấm vang chuối Awad, H.M., R Diaz, R.A Malek, N.Z Othman, R.A Aziz and H.A El Enshasy, 2012 Efficient production process for food grade acetic acid by Acetobacter aceti in shake flask and in bioreactor Cultures EJournal of Chemistry,Volume (2012), Issue 4, Pages 2275-2286 Benito Á.G, 2005 Application of molecular techniques for identification and enumeration of acetic acid bacteria http://www.uco.es/vinegarnetwork/tesis/tesi s_Gonzalez.pdf, accessed on 01/01/2014 Brock, T.D and M.T Madigan (1991) Biology of microorganisms (6th Edition) Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall Gullo, M and P Giudici, 2008 Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cultures selection International Journal of Food Microbiology, 125 (2008) 46–53 Gullo, M., C Caggia, L Devero and P Giudici, 2005 Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar Int J Food Microbiol., 106: 209-212 Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 1999 New vinegar production from onions Journal of bioscience and bioengineering, 88(1), 107-109 Mô hình bề mặt đáp ứng thể tương quan hàm lượng acid sinh theo hàm lượng ethanol sử dụng mật số vi khuẩn chủng thiết lập (Hình 3) (từ phương trình 4) Đồng thời sử dụng chương trình STAGRAPHIC dò tìm giá trị tối ưu cho trình lên men giấm vang chuối với hàm lượng acid acetic đạt cao (hàm lượng 4%) là: hàm lượng ethanol 5%, hàm lượng đường 20,62 g/L mật số vi khuẩn 105 (tế bào/mL) KẾT LUẬN Quá trình sản xuất giấm vang từ chuối già thời gian 43 ngày đạt 4% lượng acid acetic sinh Thông số tối ưu cho trình lên men giấm 5% ethanol dịch lên men, hàm lượng đường 20,62 g/L mật số vi khuẩn 105 tế bào/mL Từ kết cho thấy chất rượu ban đầu (ethanol) không qua trùng, không acid hóa môi trường lên men giấm tạo hương vị hài hòa, đặc trưng cho sản phẩm giấm vang TÀI LIỆU THAM KHẢO Aranda, A and M Delolmo, 2003 Response to acetaldehyde stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae involves a straindependent regulation of several ALD genes and is mediated by the general stress response pathway Yeast, 20: 747-759 82 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp (2014)(1): 76-83 Horiuchi, J I., Kanno, T., & Kobayashi, M, 2000 Effective onion vinegar production by a two-step fermentation system Journal of bioscience and bioengineering, 90(3), 289-293 Kadere, T.T., T Miamoto, R.K Oniang`o, P.M Kutima and S.M Njoroge, 2008 Isolation and identification of genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi) Afr J Biotechnol., 7: 2963-2971 10 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng Lê Thị Lan Chi, 2009 Các phương pháp phân tích ngành Công nghệ lên men Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 331 trang 11 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hương Phan Thị Huyền, 2004 Công nghệ Enzyme Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 534 trang 12 Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Văn Thành Bùi Thị Thúy Ngân, 2011 Tuyển chọn dòng nấm men phân lập từ nước nốt Tạp chí khoa học Trường Đại học 83 Cần Thơ, Vol 18b, trang 117–126 Nhà xuất Đại học Cần Thơ ISSN 1859-2333 13 Sossou S.K., Ameyapoh Y, Karou SD, de Souza C, 2009 Study of pineapple peelings processing into vinegar by biotechnology Pak J Biol Sci.; 12(11): 859-65 14 Valli, M., M Sauer, P Branduardi, N Borth, D Porro and D Mattanovich, 2006 Improvement of lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae by cell sorting for high intracellular pH Applied Environ Microbiol., 72: 5492-5499 15 Valli, M., M Sauer, P Branduardi, N Borth, D Porrot and D Mattanovich, 2005 Intracellular pH distribution in Saccharomyces cerevisiae cell populations, analyzed by flow cytometry Applied Environ Microbiol., 71: 1515-1521 16 Zahoor, T., F Siddique and U Farooq, 2006 Isolation and characterization of vinegar culture (Acetobacter aceti) from indigenous sources British Food Journal, Vol 108 Iss: 6, pp.429 – 439