PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ RÂY PHÂN TỬ Định nghĩa:Sắc ký rây phân tử phương pháp chia tách phân tử dung dịch dựa kích thước chúng Trong đó: Pha động dung môi hữu cơ,kỹ thuật gọi sắc ký thấm qua gel Pha động nước kỹ thuật gọi sắc ký lọc gel Nguyên lý hoạt động Tiêu đề nhỏ Tiêu đề nhỏ Tiêu đề nhỏ Tiêu đề nhỏ Mẫu đưa vào cột chứa đầy gel loại vật liệu xốp, pha động dẫn chạy qua cột Khoảng kích thước lỗ vật liệu nhồi cột xác định khoảng kích thước phân tử chia tách qua trình sắc ký Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để vào tất khoảng không gian lỗ xốp rửa giải tổng thể tích thấm Vt Các phân tử có kích thước lớn kích thước lỗ xốp lớn di chuyển dọc theo cột qua khoảng trống hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, rửa giải thể tích loại trừ Vo Đường cột nối với detector có gắn với máy ghi tự động Pha động chạy qua cột tốc độ không đổi 04 02 CẤU TẠO 01 Một cột sắc ký có kích thước phù hợp 03 Một đầu cột nối với thiết bị phù hợp để cấp mẫu Sắc kí rây phân tử dùng để xác định: Xác định tỷ lệ thành phần tương đối Xác định khối lượng phân tử Sự phân bố polymer theo kích thước phân tử Ví dụ:Phân bố khối lượng phân tử dextran Kiểm tra phương pháp sắc ký rây phân tử: Dung dịch hiệu chuẩn Dung dịch đánh dấu Dung dịch(1) Hoà tan 0,200 g mẫu thử vào pha động pha loãng tới 10 ml pha động Hoà tan mg dextrose chuẩn mg chất đối chiếu hóa học dextran Vo 1ml pha động Hoà tan riêng rẽ 15 mg chất đối chiếu hóa học dextran 4,dextran 10 dùng cho hiệu chuẩn 20 mg chất đối chiếu hóa học dextran 40,dextran 70, dextran 250 dùng cho hiệu chuẩn ml pha động.t đối chiếu hóa học dextran Vo 1ml pha động Chuẩn hóa hệ thống sắc ký Tiến hành tiêm lặp lại vài lần thể tích định dung dịch đánh dấu píc đầu tương ứng chất đối chiếu dextran Vo V0 píc thứ dextrose Vt Tiêm thể tích định dung dịch chuẩn Vẽ cẩn thận đường sắc ký đồ Phân chia sắc ký đồ thành p phần (ít 60) đường gạchthẳng dọc Chuẩn hóa hệ thống sắc ký Trong phần, i tương ứng với thể tích rửa giải Vi, đo chiều cao (yi) đường sắc ký đồ phía đường tính hệ số phân bố Ki theo công thức: Trong đó: Vo = thể tích trống cột, xác định píc tương ứng với chất đối chiếu hóa học dextran Vo sắc ký đồ thu từ dung dịch đánh dấu, Vt = thể tích thấm tổng cột, xác định píc tương ứng với dextrose sắc ký đồ thu từ dung dịch đánh dấu, Vi = thể tích rửa giải phần i sắc ký đồ thu với dung dịch chuẩn Tiến hành hiệu chuẩn Vẽ đường cong chuẩn: Tiến hành hiệu chuẩn Tính toán qua đường cong chuẩn: Trong đó: p = số phân đoạn chia sắc ký đồ, y = chiều cao đường sắc ký phía đường phân đoạn i Mi = khối lượng phân tử phân đoạn i Điều kiện sắc ký: Cột (0,3 m x 10 mm) nhồi agarose loại liên kết chéo dùng sắc ký dãy cột (0,3 m x 10 mm) nhồi gel polyether hydroxyl hóa dùng sắc ký Dung dịch chứa 7g natri sulfat khan 1g clorobutanol 1lít nước đểlàm pha động, tốc độ dòng 0,5 - ml/phút, giữ ổn định với sai số ±1%/giờ Detector khúc xạ ánh sáng vi sai Buồng tiêm mẫu dung tích 100 - 200 μl trì hệ thống hoạt động nhiệt độ ổn định (± 0,1°C)