ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ hệ sợi của lục BÌNH EICHHORNIA CRASSIPES BẰNG CHỦNG nấm TRICHODERMA SP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HUỶ HỆ SỢI CỦA LỤC BÌNH EICHHORNIA CRASSIPES BẰNG CHỦNG NẤM TRICHODERMA SP Lê Minh Hiếu[1], Trần Ngọc Hùng[1], Mai Thị Ngọc Lan Thanh[1][2] [1]: Đại Học Thủ Dầu Một [2]: Đại học Bách Khoa Tp.HCM TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu nhằm đánh giá khả phân huỷ hệ sợi cellulose Lục Bình chủng nấm Trichoderma sp Trong bảy chủng nấm phân lập từ đất vườn Bình Dương đất rừng Langbiang tỉnh Lâm Đồng, có hai chủng cho khả phân huỷ hệ sợi Lục Bình mạnh 35% chủng T3-3, T13-2 Các chủng quan sát hình thái chủng nấm mọc môi trường PGA hình thái cuống sinh bào tử để xác định hai chủng phân lập chủng Trichoderma sp Từ khoá: Eichhornia Crassipe, Trichoderma sp, enzyme cellulase, phương pháp phân lập, phương pháp xác định hàm lượng cellulose thô GIỚI THIỆU Lục bình (WH) (Eichhornia crassipes) gọi lục bình, lộc bình, hay bèo Nhật Bản loài thực vật thuỷ sinh, thân thảo, sống theo dòng nước, thuộc chi Eichhornia họ Họ Bèo tây (Pontederiaceae), có khả hấp thu lớn chất dinh dưỡng có nguồn gốc từ khu vực Amazon Nam Mỹ (Bolenz ctv 1990) Khi không kiểm soát, lục bình bao phủ hồ, ao hoàn toàn; điều tác động đáng kể lưu lượng nước, lượng ánh sáng mặt trời đến thực vật thủy sinh địa, lấy ôxy nước, gây chết cá hay số loài động vật nước khác Loài tạo môi trường sống cho loại vật gây hại Lục bình có hình thức sinh sản: sinh sản vô tính sinh sản hữu tính Hạt lục bình bị phát tán loài chim sức sống hạt lên tới 15- 20 năm (Manson J.G and Manson B.E., 1958; Ueki,.K and Oki, J 1970; Matthew et al., 1977) Nhưng sinh sản hữu tính với tốc độ cực nhanh (bằng nhánh con) nguyên nhân chủ yếu sự phát tán phát triển mức lục bình Trong điều kiện lý tưởng, lục bình sản sinh 3.000 nhánh chiếm diện tích khoảng 600 m2 vòng năm (Das R.R 1969; Knipling E.B et al 1970; Reddy K.R et al., 1989) Trichoderma loài nấm diện tất loại đất, nơi mà chúng phổ biến Đa số dòng Trichoderma phát triển đất có độ pH 2.5-9.5 Phát triển tốt độ pH 4.5-6.5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường 25-300C Một vài dòng phát triển tốt 35 0C Một số phát triển 400C (Gary J Samuels, 2004) Theo Prasun K M Kaithadai R (1997) hình thái khuẩn lạc bào tử Trichoderma khác nhiệt độ khác Ở 350C chúng tạo khuẩn lạc rắn dị thường với hình thành bào tử nhỏ mép bất thường, 370C không tạo bào tử sau ngày nuôi cấy Năm 2012 Trần Thị Lệ, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Xuân Kỳ tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Trichoderma spp phân giải cellulose mạnh để sản xuất phân hữu vi sinh nghiên cứu ảnh hưởng chúng giống đậu xanh 208 vụ xuân 2011 hợp tác xã Hương Long, Thành phố Huế Kết tuyển chọn chủng PC6 có khả phân giải cellulose từ 43 chủng nấm Trichoderma spp phân lập Viện Tài nguyên môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế Sau chủng nấm Trichoderma PC6 phối trộn với chất mang cám: trấu theo tỷ lệ 1:5 với 10 ml nước cất trùng cho 0,5 kg Phân hữu vi sinh ủ với chế phẩm Viện vi sinh vật Công nghệ sinh học với lượng thay phân chuồng 60% cho suất hiệu kinh tế cao so loại phân hữu vi sinh mức thay lại, suất lý thuyết suất thực thu đạt tương ứng 17,27 tạ/ha 12,44 tạ/ha Nghiên cứu đánh giá khả phân huỷ cellulose loại chất cám trấu chưa đánh giá chủng mẫu Lục bình, đặc biệt Lục bình tươi hàm lượng độ ẩm cao Năm 2013, Amit Ganguly cộng tiến hành nghiên cứu đánh giá thông số tối ưu phân giải sinh khối Lục Bình ứng dụng lên men sản xuất ethanol Kết hoạt tính enzyme cellulase 46.12U/g, ethanol sản xuất 3.4969 g/L sử dụng chủng Pichia stiptis, 3.4496 3.1349 g/L dùng chủng Candida shehatae Saccharomyces cerevisiae Năm 2014, Zia-ullah Khokhar cộng nghiên cứu vị trí sản xuất enzyme cellulase chủng Trichoderma reesei đột biến lên men môi trường acid ứng dụng tạo ethanol Kết tạo chủng Trichoderma reesei đột biến cho khả phân huỷ 91% lượng cellulose so với lương cellulose ban đầu Năm 2014, Sudarshan Singh Rathore cộng sàng lọc chủng vi sinh vật khu vực hồ có Lục Bình sản xuất enzyme phân huỷ cellulose Kết tìm chủng Trichoderma Sp., Aspergillus Sp., Pseudomonas Sp., Cellulomonas Sp., Bacillus Sp., Micrococcus Sp Trong 36 mẫu vi sinh vật thu sản xuất enzyme cellulase, xylanase 10 chủng nấm, chủng vi khuẩn, 12 chủng nấm men, chủng xạ khuẩn cho khả phân giải cellulose xylan ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học Sự phát triển vi sinh vật nhiệt độ 28 ± ˚C pH 6.0 ±0.4 điều kiến hiếu khí, vòng 2-5 ngày ủ Chủng Trichoderma sp cho khả phân huỷ hệ sợi cellulose Lục Bình cho tiềm ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học xử lý môi trường Như việc phân lập chủng vi sinh vật cho hoạt tính enzyme cellulase cao yều cầu cần thiết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Lục bình thu phường Tân An, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương định danh Bộ môn Sinh học Khoa Tài Nguyên Môi Trường, Đại học Thủ Dầu Một Các chủng nấm Trichoderma sp phân lập Phương pháp Phương pháp phân lập chủng nấm Trichoderma sp phân giải cellulose Bảy chủng nấm Trichoderma sp phân lập đất vườn Bình Dương Langbiang (Đà Lạt) (Bảng 1) Lấy mẫu đất sâu xuống cách mặt đất 15 - 20 cm (khoảng kg/điểm) cho vào bao nilong (100m2 lấy điểm (35kg)), đem trộn đều, lấy khoảng 5kg cho vào bao nilong đem phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập Sau lấy ngẫu nhiên 3g đất phân lập phương pháp pha loãng PGA, chủng nấm sau cấy sang môi trường chọn lọc PGA bổ sung CMC làm nguồn Carbon theo phương pháp Elad (1981) Tiến hành cấy truyền làm phương pháp cấy đơn bào tử (Lester et al., 2008) Nhận dạng hình thái nấm Trichoderma theo phương pháp Elad (1981) Thông qua vòng phân giải chất CMC cho thuốc thử Lugol để định tính hoạt tính phân giải cellulose chủng nấm phân lập Ủ lục bình với chủng Trichoderma thu được: Lục bình tươi sấy tủ sấy nhiệt độ 50 0C, đem cân đến khối lượng không đổi xác định độ ẩm ương đối mẫu Lục Bình Sinh khối tươi tiến hành cắt khúc nhỏ chiểu đài khoảng 1cm sau cho lục bình vào bình tam giác chuẩn bị từ trước, cân lại khối lượng, trước cho chủng nấm vào ủ đem bình tam giác khử trùng phương pháp chiếu tia UV khoảng Sau bình tam giác ủ với 20ml dịch nuôi lỏng chủng nấm qua đêm nhiệt độ 35±2oC Trong thời gian 10 ngày Xác định lượng cellulose lại lục bình sau ủ: Thủy phân chất hữư cellulose acid kiềm cồn , phần lại cellulose thô định phân phương pháp khối lượng Cân 25g nguyên liệu nghiền mịn, cho vào bình cầu cao cổ chứa 50ml nước cất , thêm vào 10ml HCl đậm đặc Đặt bình cầu lên bếp điện tủ hốt, gắn ống sinh hàn khí đun sôi that kỹ tinh bột bị thủy phân hoàn toàn , thử điểm kết thúc thủy phân cách chấm giọt dung dịch thủy phân lên lam kính vào giọt thuốc thử Lugol đến màu xanh Lấy bình cầu khỏi bếp, lọc qua giấy lọc không tro, lấy bã Rửa bã nhiều lần nước cất Dùng bình tia nước chuyển hết bã vào lại bình cầu dùng Thêm vào bình cầu 10ml NaOH 10% Đặt bình cầu lên bếp, đun sôi 20-30 phút Lọc lấy bã hai giấy lọc không tro có trọng lượng bằngng Rửa bã lần nước cất, lần 20ml Sau rửa ba lần dung dịch CH 3COOH 2% rượu etylic nguyên chất (cồn tuyệt đối) Sau rửa bã , bã có màu trắng Đặt hai giấy lọc bã vào chén nung (đã nung lò nung 400-500 0C để nguội cân cân phân tích) đưa vào tủ sấy 1050C giờ, lấy để nguội bình hút ẩm cân Đưa hai giấy lọc bã vào chén nung, tiến hành nung bã lò nung nhiệt độ 400-5000C đến khối lượng không đổi Lấy để nguội bình hút ẩm cân chén nung chứa tro sau nung Công thức xác định hàm lượng cellulose thô(X) tính % theo công thức : X= (m1 − m2 ).100 m Trong đó: m1: khối lượng chén nung xơ bã sau sấy (g) m2: khối lượng chén nung tro sau nung (g) m: lượng cân mẫu (g) KẾT QUẢ: Phân lập chủng nấm Trichoderma sp phân giải cellulose Hình 1: Chủng nấm cho vòng phân giải chất CMC môi trường PGA chọn lọc Dựa vào hình 1, có bảy chủng nấm có vòng phân giải chất CMC lớn nhất, từ bảy chủng nấm làm môi trường PGA cho thí nghiệm đánh giá hoạt tính phân huỷ hệ sợi Lục Bình Hình thái chủng nấm nuôi cấy đĩa petri môi trường PGA Hình 1: hình thái chủng nấm phân lập môi trường PGA p: chủng T2-1, g: chủng T2-2, q: chủng 3-1, b: chủng T3-2, j: chủng T3-3, e: T13-1, u: T13-2 Hình thái cuống sinh bào tử chủng nấm Trichoderma sp phân lập: Hình 2.1: Hình thái cuống sinh bào tử chủng nấm Trichoderma sp T3-3 Hình 2.1: Hình thái cuống sinh bào tử chủng nấm Trichoderma sp T13-2 Đặc điểm hình thái chủng Trichoderma sp thu thập đất vườn Bình Dương đất rừng Langbiang tỉnh Lâm Đồng Bào tử (conidia) thường hình thành dày đặc, tạo lớp màu xanh Bào tử màu xanh Cuống đính bào tử (conidiophores) mọc đơn phổ biến mọc thành cặp Các nhánh phát sinh vuông góc gần vuông góc với trục Sự phân nhánh thành cặp đối xứng phổ biến Thể bình (Phialides) Bào tử hình thành có mật độ dày đặc, tạo vòng tròn đồng tâm hướng hướng mép đĩa Bào tử màu xanh thường xuất vòng (57-66) PGA 30oC bóng tối Khảo sát khả phân huỷ hệ sợi Lục Bình Bảng 1: Khảo sát khả phân giải hệ sợi Lục Bình chủng Trichoderma sp Khối lượng (g) tên chủng nấm Trichode rma sp M (mẫu ban đầu) M (khô) M (sấy) M (tro) M (cellulose lại) M (cellulose lại quy khối lượng mẫu ban đầu) T2-1 49.8600 2.9916 0.7100 0.2400 0.4700 0.4747 T2-1 49.8600 2.9916 0.7800 0.2800 0.5000 0.5050 T2-2 50.9500 3.0570 0.8500 0.3100 0.5400 0.5337 T2-2 50.1500 3.0090 0.8000 0.2400 0.5600 0.5623 T3-1 49.8000 2.9880 0.8400 0.2689 0.5900 0.5966 T3-1 49.6200 2.9772 0.8600 0.2679 0.6100 0.6191 T3-1 49.8100 2.9886 0.8900 0.2690 0.6000 0.6066 T3-2 50.0000 3.0000 0.8800 0.2700 0.6100 0.6144 T3-2 50.0000 3.0000 0.8720 0.2700 0.6020 0.6063 T3-3 48.6700 2.9202 0.5100 0.2628 0.2472 0.2558 T3-3 49.0000 2.9400 0.7900 0.2646 0.5254 0.5400 T13-1 47.8500 2.8710 0.8900 0.2758 0.6142 0.6464 T13-1 46.6000 2.7960 0.8600 0.2686 0.5914 0.6391 T13-2 49.8800 2.9928 0.7400 0.3000 0.4400 0.4442 T13-2 50.3200 3.0192 0.8300 0.3900 0.4400 0.4403 T13-2 50.3700 3.0222 0.6700 0.2600 0.4100 0.4099 M TB (cellulose lại quy khối lượng mẫu ban đầu) tỉ lệ phân giải trung bình 0.4899 26.3671 0.5480 17.6216 0.6075 8.6920 0.6104 8.2545 0.3984 40.1222 0.6428 3.3736 0.4315 35.1398 mẫu đối chứng mẫu đối chứng 50.7200 3.0432 0.9900 0.3200 0.6700 50.0000 3.0000 0.9900 0.3200 0.6605 0.6653 Bằng phương pháp xác định hàm lượng cellulose lại sau lục bình ủ với chủng nấm Trichoderma sp so với mẫu đối chứng không ủ với chủng nấm, phương pháp xác định hàm lượng cellulose, lượng cellulose lại quy chuẩn lượng ban đầu ta kết bảng Dựa vào bảng 1, tỉ lệ phân giải lục bình chủng T3-3 cao 40%, có nghĩa 50g lục Bình tươi có trọng lượng khô 3g, lượng cellulose ban đầu 0.6653g lượng cellulose bị phân huỷ 0.2269g Các chủng Trichoderma sp T13-2 phân lập đất vườn Bình Dương, T2-1, T2-2, T3-3 phân lập từ mẫu đất rừng Langbiang (Lâm Đồng), chủng cho khả phân huỷ hệ sợi cao khoảng 15%-35%, điều kiện thí nghiệm Kết phân giải so sánh với nghiên cứu trước tác giả Bùi Anh Võ cộng 50% khoảng 21 ngày ủ, hoạt tính phân huỷ chủng nấm T3-3 40% T13-2 35% 10 ngày ủ Các chủng nấm nghiên cứu ủ trục tiếp với Lục tươi so với Lục Bình xay nhuyễn nghiên cứu trước việc sử dụng chủng nấm phân lập nghiên cứu đỡ tốn chi phí cho việc xay nhuyễn chất rút ngắn thời gian nửa cho hiệu suất gần tương đương KẾT LUẬN: Các chủng nấm Trichoderma sp phân lập cho hoạt tính phân huỷ hệ sợi cellulose Lục Bình mạnh 35% khoảng thời gian 10 ngày ủ cho tiềm ứng dụng Lục Bình làm phân bón, hàm lượng cellulose hệ sợi Lục Bình cao khoảng 22% Việc ủ chủng nấm với Lục Bình tươi không qua khâu xử lý chất ban đầu giảm chi phí đầu tư TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Anh Võ, P N B N., Hoàng Hồng Ngọc, Nguyễn Thị Lan Hương Phân Lập Một Số Chủng Vi Sinh Vật ứng Dụng Xử Lý Lục Bình Làm Phân Vi Sinh Ganguly, A., Das, S., Bhattacharya, A., Dey, A., & Chatterjee, P K (2013) Enzymatic Hydrolysis Of Water Hyacinth Biomass For The Production Of Ethanol: Optimization Of Driving Parameters Ind J Exp Biol, 51, 556-566 Khokhar, Z.-U., Qurat-Ul-Ain Syed, J W., & Athar, M A (2014) On-Site Cellulase Production By Trichoderma Reesei 3EMS35 Mutant And Same Vessel Saccharification And Fermentation Of Acid Treated Wheat Straw For Ethanol Production EXCLI Journal, 13, 82 Lệ, T T., Hà, T T T., Thanh, N T., & Kỳ, N X (2012) TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM Trichoderma Spp PHÂN GIẢI Cellulose MẠNH ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHÚNG ĐỐI VỚI GIỐNG ĐẬU XANH 208 VỤ XUÂN 2011 TẠI HTX HƯƠNG LONG, THÀNH PHỐ HUẾ Tạp Chí Khoa Học Đại Học Huế, 71(2) Rathore, S S., Mannivannan, A., & Narendhirakannan, R (2014) Screening of cellulase producing microorganisms from lake area containing water hyacinth for enzymatic hydrolysis of cellulose Journal Of Advanced Scientific Research, 5(3) EVALUATION OF THE DEGRADATED CELLULOSE WATER HYACINTH EICHHORNIA CRASSIPES BY TRICHODERMA SP ABSTRACT: The aim of this research is evaluation of the degradated cellulose water hyacinth eichhornia crassipes by trichoderma sp From seven collected fungi in the soil at Binh Duong and Langbiang, Lam Dong province, there are two species that separate the cellulose of eichhornia crassipes strongly upon 35% which are T3-3, T13-2 species These species were observed the morphology of fungi cultured PGA and the morphology of conidium on behalf of proving Trichoderma sp Từ khoá: Eichhornia Crassipe, Trichoderma sp, enzyme cellulase, isolated method, the determined cellulose amount method 10